曹燕燕,刁倩楠,姚東偉,陸世鈞,郟惠彪,張永平?

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201403;2上?；莺头N業(yè)有限公司,上海 201899)

甜瓜(Cucumis meloL.)為葫蘆科甜瓜屬一年生蔓性草本植物。 甜瓜果實(shí)不僅味美香甜,多汁爽口,而且富含多種糖分和維生素,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,深受廣大消費(fèi)者喜愛,為世界十大水果之一[1]。 近年來,我國(guó)甜瓜產(chǎn)業(yè)規(guī)模趨于穩(wěn)定,種植面積和產(chǎn)量常年穩(wěn)居世界首位。

白粉病和蔓枯病是甜瓜生產(chǎn)中的主要真菌病害。 白粉病在甜瓜露地栽培和保護(hù)地栽培中廣泛發(fā)生,該病菌不僅能夠侵染植物的葉片、葉柄和莖蔓,還能侵染其花和果實(shí)。 甜瓜感染白粉病后產(chǎn)量下降,果實(shí)的成熟度和含糖量受到影響,甜瓜的品質(zhì)和商品性嚴(yán)重降低[2]。 蔓枯病是在甜瓜整個(gè)生育期都可發(fā)生的一種土傳病害,在苗期發(fā)病率較低,在植株生長(zhǎng)的中后期發(fā)病嚴(yán)重,莖蔓和葉片是最主要的發(fā)病部位,病害嚴(yán)重時(shí)還可為害果實(shí)[3],其在大田的發(fā)病率可達(dá)20%—30%,在連作地及設(shè)施溫室高達(dá)80%,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致絕產(chǎn)[4]。

目前,引起葫蘆科作物白粉病的常見病原菌是單囊殼屬的單囊殼菌Podosphaera xanthii(P.xanthii)和白粉菌屬的二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum(G.cichoracearum)[5],前者是引起我國(guó)甜瓜白粉病發(fā)生的主要病原菌[6]。 已發(fā)現(xiàn)的甜瓜白粉病抗性基因包括Pm-1、Pm-2、Pm-3、Pm-4、Pm-5、Pm-6、Pm-A、Pm-B、Pm-C1、Pm-C2、Pm-D、Pm-E、Pm-F、Pm-G、Pm-W、Pm-X以及Pm-H等,但目前很少有抗性基因被克隆出來[7]。 張海英等[8]研究發(fā)現(xiàn),甜瓜自交系K7-1 白粉病的抗性受一對(duì)顯性基因Pm-2F控制,開發(fā)的1個(gè)SSR 分子標(biāo)記CMBR120-172與該抗性基因緊密連鎖。 盧浩等[9]研究發(fā)現(xiàn),分子標(biāo)記Mu7191 與抗白粉病基因Pm-PMR6-1 共分離。 蔓枯病是由亞隔孢殼屬的瓜類黑腐球殼菌所引起,但至今尚未確定致病菌生理小種的分化[10]。 目前已發(fā)現(xiàn)Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、Gsb-5、Gsb-6 等多個(gè)蔓枯病抗性基因,但至今未被成功定位和克隆[11]。 而隨著甜瓜基因組研究水平的不斷深入,與甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-1、Gsb-4 和Gsb-6 等相關(guān)的分子標(biāo)記不斷被報(bào)道[12-15]。

目前,白粉病和蔓枯病主要通過噴施藥劑進(jìn)行化學(xué)防治,但長(zhǎng)期單一使用某種化學(xué)藥劑不僅易使病原菌產(chǎn)生耐藥性,還會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境,進(jìn)而威脅人類健康[16]。 防治這兩種病害最根本和最經(jīng)濟(jì)有效的方法就是選育優(yōu)質(zhì)抗病品種,開展現(xiàn)有種質(zhì)資源的抗病性鑒定是甜瓜抗病育種的關(guān)鍵。 本研究一方面對(duì)甜瓜種質(zhì)資源的白粉病和蔓枯病抗性進(jìn)行鑒定,另一方面對(duì)篩選到的抗病材料進(jìn)行抗性分子標(biāo)記分析,以期為甜瓜白粉病和蔓枯病抗性遺傳改良及其抗病雜交組合的配制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的40 份甜瓜種質(zhì)資源由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所提供,具體見表1。 其中,來源為自主選育的甜瓜種質(zhì)均為高世代純合材料。 試驗(yàn)所用的白粉病菌和蔓枯病菌均采集自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行試驗(yàn)基地,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離純化獲得。

1.2 甜瓜和病原菌培養(yǎng)

挑選飽滿的甜瓜種子進(jìn)行浸種催芽,出芽后播種于塑料營(yíng)養(yǎng)缽中,置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),設(shè)置晝夜溫度為25 ℃∕20 ℃,光照周期為16 h 光照∕8 h 黑暗。

將保存的白粉病菌接種到易感甜瓜植株上進(jìn)行大量繁殖用于后續(xù)白粉病菌接種試驗(yàn)。 從保存的蔓枯病菌株挑取純性菌絲塊接種于PDA 培養(yǎng)基上(土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L),置于生化培養(yǎng)箱中,25—28 ℃條件下暗培養(yǎng)1 周后用于蔓枯病菌接種試驗(yàn)。

表1 供試甜瓜種質(zhì)資源Table 1 Melon germplasm resources used in this study

1.3 病原菌接種

白粉病病菌接種參照Zhang 等[17]的方法,將從感病葉片上掃下的新鮮病菌配制成濃度為106個(gè)∕mL的孢子懸浮液,均勻噴灑在植株葉片上,放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件為16 h 光照∕8 h 黑暗,相對(duì)濕度85%—95%。 12 d 后參照張學(xué)軍等[18]的方法進(jìn)行白粉病病情統(tǒng)計(jì)。 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:0 級(jí),無病癥;1 級(jí),病斑面積占整葉面積的1∕3 以下,白粉模糊不清;2 級(jí),病斑面積占整葉面積的1∕3—2∕3,白粉較為明顯;3 級(jí),病斑面積占整葉面積的2∕3 以上,白粉層較厚,連片;4 級(jí),白粉層濃厚,葉面開始變黃,壞死面積占葉面積的2∕3 以下;5 級(jí),葉片壞死面積占整葉面積的2∕3 以上。 其中,病害級(jí)別為0—2 的個(gè)體記錄為抗病,病害級(jí)別為3—5 的個(gè)體記錄為感病。

蔓枯病病菌接種采用離體葉片菌絲塊接種方法,具體操作參照Wang 等[19]的方法并稍作改動(dòng):剪取甜瓜植株完全展開的第3 或第4 片真葉(保留適當(dāng)長(zhǎng)度葉柄),用無菌水沖洗干凈并晾干后放置到鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中,用直徑為0.5 cm 的滅菌打孔器切取培養(yǎng)好的菌絲塊,接種于甜瓜葉片的中央,每個(gè)葉片接種1 個(gè)菌絲塊,每個(gè)甜瓜材料至少接種3 個(gè)葉片。 將培養(yǎng)皿放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度(25 ±1)℃,16 h 光照∕8 h 黑暗,相對(duì)濕度90%—95%;5 d 后,測(cè)量病斑擴(kuò)展半徑,取平均值。 葉片侵染病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照任琴琴等[20]的方法,具體如下:1 級(jí)為高抗(HR),擴(kuò)展半徑<1.8 cm;2 級(jí)為抗(R),1.8 cm≤擴(kuò)展半徑<2.3 cm;3 級(jí)為中抗(MR),2.3 cm≤擴(kuò)展半徑<2.8 cm;4 級(jí)為感(S),2.8 cm≤擴(kuò)展半徑<3.3 cm;5 級(jí)為高感(HS),擴(kuò)展半徑≥3.3 cm。

1.4 分子標(biāo)記鑒定

1.4.1 甜瓜基因組DNA 的提取

待植株長(zhǎng)至3 葉1 心時(shí),取1.0 g 甜瓜葉片于研缽中,加液氮研磨成粉末,利用植物基因組DNA 提取試劑盒(TSP101-50,北京擎科生物科技有限公司)提取甜瓜基因組DNA。

1.4.2 PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

反應(yīng)體系為:ddH2O 7 μL,2 ×TSINGKE Master Mix (blue)(含DNA 聚合酶、dNTP 等)10 μL,上游引物和下游引物(10 μmol∕L)各1 μL,DNA 模板(100 ng∕μL)1 μL。 所用引物序列詳見表2。

反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,50—55 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存;me4em37 引物的擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。

表2 白粉病和蔓枯病抗性來源鑒定所用分子標(biāo)記引物Table 2 Molecular marker primers used for identification of the genetic resistance origin of powdery mildew and gummy stem blight

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 和SPSS 20.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜白粉病苗期抗性鑒定

40 份甜瓜種質(zhì)資源的苗期白粉病抗性鑒定結(jié)果表明,白粉病抗病材料有11 份,分別為12-1-3A、13-5B、152、162、18-6-1A、18-7-5A、1948-1-1、651、B-1-1-1、M09-13 以及Q-1,其中,材料152 的發(fā)病等級(jí)為0 級(jí),為免疫材料;其余29 份種質(zhì)均為感病材料(表3)。

表3 甜瓜種質(zhì)資源白粉病抗性鑒定Table 3 Identification of powdery mildew resistance of the melon germplasm resources

2.2 甜瓜蔓枯病抗性鑒定

采用離體葉片接種方法對(duì)40 份甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行苗期蔓枯病抗性鑒定分析。 結(jié)果表明,供試材料中,表現(xiàn)抗病的材料有2 份,分別為162 和651;表現(xiàn)中抗的材料有6 份,分別為1948-1-1、41S-19、B-1-1-1、M09-9-1、M09-13 和Q-1;表現(xiàn)高感的材料有2 份,分別為159 和E-1-1-1;其余30 份材料表現(xiàn)為感病(表4)。

2.3 抗白粉病甜瓜材料的抗性來源分析

利用抗白粉病基因分子標(biāo)記引物me4em37 對(duì)苗期人工接種鑒定篩選到的11 份白粉病抗性甜瓜材料進(jìn)行抗性來源分析發(fā)現(xiàn),12-1-3A、13-5B、152、162、18-6-1A、18-7-5A、1948-1-1、B-1-1-1 以及Q-1 中擴(kuò)增出目的條帶,表明這9 份材料可能含有與抗病甜瓜收集一號(hào)相同的白粉病抗性基因[21](圖1A);通過利用抗白粉病基因分子標(biāo)記引物CMBR120-172對(duì)上述11 份材料進(jìn)行抗性來源分析發(fā)現(xiàn),152、162、18-6-1A、18-7-5A、B-1-1-1 以及Q-1 可用該引物擴(kuò)增出172 bp 的目的條帶,表明這6 份抗性材料可能含白粉病抗性基因Pm-2F(圖1B)。

表4 甜瓜種質(zhì)資源蔓枯病抗性鑒定Table 4 Identification of gummy stem blight resistance of the melon germplasm resources

圖1 甜瓜白粉病抗性材料抗性來源檢測(cè)Fig.1 Detection of the genetic resistance origin of the powdery mildew resistant melon

2.4 抗蔓枯病甜瓜材料的抗性來源分析

利用抗蔓枯病基因分子標(biāo)記引物對(duì)篩選到的蔓枯病抗性材料進(jìn)行抗性來源分析發(fā)現(xiàn),材料162 和651 可用Gsb-1 分子標(biāo)記引物CMCT505 擴(kuò)增出190 bp 的目的條帶(圖2A),材料41S-19 可用Gsb-4 分子標(biāo)記引物CMAT170a 擴(kuò)增出180 bp 的目的條帶(圖2B),說明這3 個(gè)材料可能分別含有相應(yīng)的蔓枯病抗性基因。

圖2 甜瓜蔓枯病抗性材料抗性來源檢測(cè)Fig.2 Detection of the genetic resistance origin of the gummy stem blight resistant melon

3 討論

種質(zhì)資源評(píng)價(jià)是育種中最重要的基礎(chǔ)工作。 近年來,隨著我國(guó)甜瓜種植面積的逐步擴(kuò)大,各甜瓜種植區(qū)白粉病和蔓枯病危害逐年加重,嚴(yán)重制約了甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 盡管目前存在一些白粉病和蔓枯病抗性甜瓜材料,但篩選新的抗病種質(zhì)資源對(duì)甜瓜抗性品種選育及抗病聚合育種仍十分必要。

人工接種鑒定是篩選抗蔓枯病資源的一種重要手段。 目前,國(guó)內(nèi)對(duì)甜瓜蔓枯病的抗性鑒定一般采用苗期接種方法,但該方法易受溫度、濕度等環(huán)境條件的影響[22-23]。 作為人工接種方法的一種,離體接種鑒定方法具有準(zhǔn)確、快速、篩選量大、受外界環(huán)境條件影響較小等優(yōu)點(diǎn)[24],已廣泛應(yīng)用于甜瓜、黃瓜、西瓜和菜瓜等園藝作物的蔓枯病、疫病和炭疽病等的抗性鑒定[20,24-25]。

本研究通過苗期接種鑒定篩選出11 份甜瓜白粉病抗性材料,其中,9 份材料可用me4em37 分子標(biāo)記引物擴(kuò)增出目的條帶,表明其可能含有與甜瓜抗病資源收集一號(hào)相同的白粉病抗性基因[21];6 份材料可用CMBR120-172分子標(biāo)記擴(kuò)增出目的條帶,表明這些材料可能含有白粉病抗性基因Pm-2F。 另外,有8 份材料利用Mu7191 分子標(biāo)記可擴(kuò)增出1 個(gè)條帶(結(jié)果未顯示),這與盧浩等[9]報(bào)道的利用該引物在抗病材料中擴(kuò)增出3 個(gè)條帶的結(jié)果不符。 因此,這8 份甜瓜種質(zhì)材料是否含有抗白粉病基因Pm-PMR6-1 還需進(jìn)一步分析。

利用蔓枯病抗性基因相關(guān)分子標(biāo)記對(duì)篩選出的蔓枯病抗病材料進(jìn)行抗性來源分析結(jié)果表明,162 和651 這2 份材料含有Gsb-1 抗性基因,41S-19 材料含有Gsb-4 抗性基因;未發(fā)現(xiàn)材料含Gsb-2、Gsb-3 和Gsb-6抗性基因(結(jié)果未顯示)。 已有研究表明,利用分子標(biāo)記輔助篩選抗病基因的可靠性主要取決于分子標(biāo)記與基因的連鎖距離,即連鎖距離越近,選擇的準(zhǔn)確性越高[26-27]。 本研究中一部分白粉病抗性材料和蔓枯病抗性材料未檢測(cè)到抗病基因,其原因可能是所選的分子標(biāo)記與抗性材料所含的抗病基因的連鎖距離較遠(yuǎn)或不連鎖。 因此,為了能夠完整地評(píng)價(jià)材料的抗病性,需要開發(fā)和解析更多與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。

本研究表明,162、B-1-1-1、M09-13 以及Q-1 材料同時(shí)兼抗白粉病和蔓枯病,后續(xù)可重點(diǎn)利用這4 份材料與優(yōu)質(zhì)甜瓜種質(zhì)配制雜交組合,并加大甜瓜抗病種質(zhì)資源的收集和評(píng)價(jià)鑒定工作。 同時(shí),對(duì)現(xiàn)有資源進(jìn)行遺傳改良,并綜合利用其他生物技術(shù)手段和物理手段創(chuàng)制新的種質(zhì)資源,以期為優(yōu)質(zhì)、多抗甜瓜新品種的選育奠定良好的基礎(chǔ)。