方捷生，林藝輝，林秀芳，馬馨怡，陳漢鑫

(漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363005)

珍珠蘆薈(Aristaloearistata)也稱為木銼蘆薈，屬于蘆薈的小型種，葉多而短，株型緊湊，是百合科蘆薈屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物，原產(chǎn)于非洲東南等熱帶地區(qū)[1-2]。長(zhǎng)期以來，蘆薈的食用、觀賞、藥用等多種價(jià)值都為人們所重視，特別是在第二次世界大戰(zhàn)之后，蘆薈就作為一種藥用植物被大面積種植。目前，世界上蘆薈主要生產(chǎn)大國有美國、日本、韓國，現(xiàn)已達(dá)到生產(chǎn)規(guī)?；⒓s化、系列化的水平[3-5]。近年來，我國也逐漸開始重視并支持蘆薈相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，市面上已有許多蘆薈產(chǎn)品相繼問世：蘆薈化妝品、蘆薈牙膏、蘆薈酒、蘆薈膠囊等[4]。珍珠蘆薈葉片中含有蘆薈大黃素、蘆薈寧、多聚糖、氨基酸、活性酶等多種有效成分，是美容佳品，對(duì)口瘡、口腔炎、口腔潰瘍治療也有一定療效，具有消炎、抗菌、抗癌、鎮(zhèn)痛、利尿、健胃等藥理作用，同時(shí)又具有保健、食用和觀賞等多種功能[6-8]，蘆薈雖能開花，但因雄花和雌花開花時(shí)間有差異，無法自花授粉結(jié)實(shí)，不易產(chǎn)生種子，因而用種子繁殖十分困難。目前珍珠蘆薈的主要繁殖方法有分株和葉插，但繁殖速度較慢，無法滿足珍珠蘆薈資源對(duì)種苗的要求以及其種植業(yè)的發(fā)展[1，9-10]。因此，本文利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)珍珠蘆薈的快速繁殖技術(shù)進(jìn)行研究，以期建立成本低、效益高的珍珠蘆薈組織培養(yǎng)技術(shù)體系，在短時(shí)間內(nèi)繁殖大量規(guī)格一致、種性穩(wěn)定的種苗，為珍珠蘆薈規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于2020年在漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所內(nèi)以健壯的珍珠蘆薈幼年植株作為材料進(jìn)行離體培養(yǎng)。

1.2 方法

試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基均加入卡拉膠8.0 g·L-1，pH 6.0。培養(yǎng)溫度(25±3) ℃，光照12 h·d-1，光照強(qiáng)度2500 xl。

1.2.1 消毒處理 珍珠蘆薈幼年植株脫土前于陰涼處晾10 d左右，期間避免澆水，降低植株內(nèi)生菌，從而降低污染率。剝掉植株外層干枯葉片，切除根部，用自來水沖洗干凈。在超凈工作臺(tái)上，用75%酒精浸泡15～30 s，放入0.1%升汞溶液中消毒8 min，最后用無菌水沖洗4～6次，用無菌濾紙濾干水分。用解剖刀切取莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)即為外植體。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 將消毒好的珍珠蘆薈莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。為防止交叉感染，每瓶接種1個(gè)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+NAA 0.3 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1為基礎(chǔ)，加入不同質(zhì)量濃度的6-BA(0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-1，表1)，研究不同濃度的6-BA對(duì)珍珠蘆薈莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的影響。每次接種40個(gè)材料，3次重復(fù)。培養(yǎng)35 d后觀察其誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)率=新生長(zhǎng)的側(cè)芽/未感染的葉片以及莖尖×100%。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)出的側(cè)芽切下來，接入增殖培養(yǎng)基中。選用L9(34)正交設(shè)計(jì)(表2)，以MS(A)、6-BA(B)、NAA(C)、蔗糖(D)為試驗(yàn)因子，各因子設(shè)3個(gè)水平(MS：1/3 MS、2/3 MS、MS，6-BA：1.0、3.0、5.0 mg·L-1，NAA：0.1、0.5、1.0 mg·L-1，蔗糖：2%、3%、4%，每次接種80個(gè)材料，重復(fù)3次。培養(yǎng)35 d后調(diào)查其增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=新生長(zhǎng)的側(cè)芽數(shù)/接入側(cè)芽的數(shù)量。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將繼代增殖得到的高度2.5 cm以上的叢生芽分離，接種至生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基以1/2 MS(大量元素減半，其它成分不變)為基本培養(yǎng)基，分別添加IBA 0.5、1.0、1.5 mg·L-1和NAA 0.5、1.0、1.5 mg·L-1進(jìn)行雙因子組合試驗(yàn)(表3)，同時(shí)以1/2 MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每處理重復(fù)3次，每次做10瓶，每瓶接種5個(gè)側(cè)芽。30 d后統(tǒng)計(jì)生根率，并觀察根系生長(zhǎng)狀況。生根培養(yǎng)基加入蔗糖20 g·L-1，并加入活性炭10 g·L-1。

1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，培養(yǎng)20 d 圖3 珍珠蘆薈生根示意圖

1.2.5 不同煉苗和晾苗時(shí)間對(duì)珍珠蘆薈組培苗移栽成活率的影響 將完成生根培養(yǎng)的組培苗(根的數(shù)量在5條以上)進(jìn)行煉苗和晾苗。將生根苗放置于溫室大棚內(nèi)進(jìn)行煉苗，時(shí)間分別為0、5、10、15、20 d；煉苗后，將組培苗上的培養(yǎng)基洗干凈，每個(gè)煉苗處理分別置于陰涼通風(fēng)處晾苗0、3、5、7 d(進(jìn)行煉苗和晾苗時(shí)間雙因子組合試驗(yàn))，然后移栽到進(jìn)口草炭∶赤玉土=3∶1的栽培基質(zhì)中，在(25±2) ℃條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理100株，3次重復(fù)，取平均值。移栽30 d后統(tǒng)計(jì)不同煉苗和晾苗時(shí)間對(duì)移栽成活率的影響。

1.2.6 不同基質(zhì)配比對(duì)珍珠蘆薈移栽成活率的影響 將完成晾苗過程的組培苗，移栽至不同配方的栽培基質(zhì)中。基質(zhì)分別為：①進(jìn)口草炭；②進(jìn)口草炭∶珍珠巖=3∶1(V∶V，下同)；③進(jìn)口草炭∶赤玉土=3∶1；④進(jìn)口草炭∶蛭石=3∶1。每個(gè)處理100株，3次重復(fù)，取平均值。移栽30 d后統(tǒng)計(jì)不同處理對(duì)組培苗移栽成活率的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel、DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)珍珠蘆薈芽誘導(dǎo)的影響

將消毒好的珍珠蘆薈外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(圖1)，培養(yǎng)10 d，基部脹大；培養(yǎng)20 d左右長(zhǎng)出側(cè)芽。從結(jié)果(表1)可以看出，不同6-BA濃度對(duì)珍珠蘆薈芽誘導(dǎo)有顯著影響，當(dāng)6-BA在0～3.0 mg·L-1范圍內(nèi)，珍珠蘆薈的芽誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的提升而升高；6-BA超過3.0 mg·L-1，容易導(dǎo)致側(cè)芽變異畸形，不利于側(cè)芽生長(zhǎng)。

表1 不同6-BA濃度對(duì)珍珠蘆薈芽誘導(dǎo)的影響

MS+NAA 0.3 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1,培養(yǎng)30 d圖1 珍珠蘆薈芽誘導(dǎo)示意圖2/3 MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1,培養(yǎng)30 d 圖2 珍珠蘆薈增殖示意圖

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)珍珠蘆薈芽增殖的影響

將誘導(dǎo)出來的長(zhǎng)度2 cm左右的側(cè)芽，分別接種到不同的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d左右觀察側(cè)芽增殖情況(圖2)。由表2可知，不同處理的培養(yǎng)基對(duì)蘆薈側(cè)芽增殖的影響具有顯著差異。對(duì)各處理進(jìn)行多重比較分析可知，處理5側(cè)芽增殖系數(shù)最高且極顯著高于其它處理，其增殖系數(shù)為3.9；其次為處理4，增殖系數(shù)為3.4；而處理1增殖系數(shù)顯著低于其它處理，增殖系數(shù)僅2.1。根據(jù)表2極差R值分析，試驗(yàn)中的4個(gè)因素對(duì)珍珠蘆薈增殖的影響大小依次為MS>NAA>6-BA>蔗糖，其中以MS成分對(duì)增殖系數(shù)的影響最大。從各因素的K值獲得優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為2/3 MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+蔗糖4%；此配方組合沒有在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對(duì)此配方進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，得到的增殖系數(shù)為4.2。因此，誘導(dǎo)蘆薈側(cè)芽增殖的最優(yōu)配方為2/3 MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+蔗糖4%。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)珍珠蘆薈側(cè)芽增殖的影響

表2(續(xù))

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)珍珠蘆薈生根的影響

以1/2 MS+蔗糖20 g·L-1為基本培養(yǎng)基，將增殖形成的高度2.5 cm以上的叢生芽分別接種到含不同IBA與NAA濃度配比的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d左右。從表3可以看出，在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比培養(yǎng)基中，珍珠蘆薈的生根情況也有所不同。對(duì)其生根率進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的處理對(duì)珍珠蘆薈生根的影響均達(dá)到顯著與極顯著水平。在培養(yǎng)基中同時(shí)添加IBA、NAA這2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能明顯促進(jìn)珍珠蘆薈組培苗生根，且生根率得到明顯的提高，其中以IBA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1最有利于組培苗生根，且根系較為粗壯。當(dāng)IBA和NAA質(zhì)量濃度均在1.5 mg·L-1及以上時(shí)，其基部會(huì)產(chǎn)生愈傷組織，且根的質(zhì)量較差，會(huì)影響移栽成活率。因此，1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1是較為合適的生根培養(yǎng)基，其根部生長(zhǎng)情況見圖3。

表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)生根培養(yǎng)的影響

圖4 珍珠蘆薈煉苗示意圖圖5 珍珠蘆薈晾苗示意圖

2.4 不同煉苗和晾苗對(duì)珍珠蘆薈移栽成活率的影響

不同煉苗和晾苗時(shí)間對(duì)珍珠蘆薈移栽成活率影響較大，煉苗、晾苗見圖4、圖5。從表4可以看出：不進(jìn)行煉苗和晾苗，直接將組培苗移栽到土培基質(zhì)中，成活率很低，大部分苗腐爛或者干枯死亡。適當(dāng)進(jìn)行煉苗和晾苗可以顯著提高其移栽成活率，當(dāng)煉苗時(shí)間低于15 d，晾苗時(shí)間低于5 d時(shí)，移栽成活率相對(duì)較低，此時(shí)植株葉片含水量較高，且植株容易出現(xiàn)腐爛、化水；當(dāng)煉苗時(shí)間高于15 d，晾苗時(shí)間高于5 d時(shí)，移栽成活率也相對(duì)較低，同時(shí)隨著晾苗時(shí)間的延長(zhǎng)，植株葉片水分蒸發(fā)過多，葉子失水皺縮，在栽培過程中不易恢復(fù)。

表4 不同煉苗和晾苗時(shí)間對(duì)移栽成活率的影響

2.5 不同移栽基質(zhì)對(duì)珍珠蘆薈組培苗移栽成活率的影響

組培苗晾苗后移栽至不同配比的栽培基質(zhì)中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。從表5可以看出，珍珠蘆薈組培苗移栽到進(jìn)口草炭∶赤玉土=3∶1基質(zhì)中，成活率高達(dá)93%，明顯高于其它處理；移栽至進(jìn)口草炭∶珍珠巖=3∶1的基質(zhì)中，組培苗成活率相對(duì)較低。由于珍珠蘆薈根較粗，移栽過程中所用的草炭直徑比較大，而添加的珍珠巖質(zhì)地較輕，移栽時(shí)加的比例較高，在澆水過程中容易浮在上面，不利于混合；移栽至純進(jìn)口草炭的基質(zhì)中，成活率最低，可能是由于純進(jìn)口草炭透氣性及排水不佳，培養(yǎng)過程中不利于植株新根生長(zhǎng)。因此，珍珠蘆薈的移栽基質(zhì)，以通氣排水良好的進(jìn)口草炭∶赤玉土=3∶1基質(zhì)為最佳，見圖6。

表5 不同移栽基質(zhì)對(duì)珍珠蘆薈組培苗移栽成活率的影響

3 討論與結(jié)論

圖6 珍珠蘆薈基質(zhì)培養(yǎng)示意圖

珍珠蘆薈采用葉插、分株等方式進(jìn)行繁殖，繁殖效率低、受環(huán)境影響較大，且植株容易積累病毒。1974年，首次利用普勒多利亞蘆薈種子誘導(dǎo)愈傷組織獲得再生植株，國內(nèi)外紛紛開始嘗試使用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行蘆薈的繁殖生產(chǎn)[11-13]。以健壯幼年珍珠蘆薈植株作為外植體，誘導(dǎo)率較高，且獲得的植株較為健壯，有利于提高種苗質(zhì)量。通過組培技術(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)以較低成本獲得大量組培苗，滿足市場(chǎng)需求，在一定程度上緩解種苗短缺的問題。

本試驗(yàn)以珍珠蘆薈莖尖作為材料，進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，篩選出最佳的誘導(dǎo)、繼代、生根培養(yǎng)基，同時(shí)探索了移栽條件對(duì)組培苗成活率的影響。在楊婷婷等[14]對(duì)蘆薈愈傷組織誘導(dǎo)的初步研究提到，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及其濃度是愈傷組織誘導(dǎo)過程中的一個(gè)至關(guān)重要環(huán)節(jié)；不同濃度的6-BA和NAA會(huì)影響蘆薈增殖，NAA的濃度會(huì)影響蘆薈組培苗生根效果[15]。適當(dāng)提高6-BA濃度，有助于提高珍珠蘆薈誘導(dǎo)率，但濃度過高會(huì)降低誘導(dǎo)率[13]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，在本研究中，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度3.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率最高；質(zhì)量濃度超過3.0 mg·L-1，容易導(dǎo)致側(cè)芽變異畸形，不利于側(cè)芽生長(zhǎng)。增殖試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MS成分對(duì)珍珠蘆薈增殖系數(shù)的影響較大，不同MS成分差別主要在于大量無機(jī)鹽的濃度不同，以2/3 MS為最佳，大量無機(jī)鹽濃度過低或過高都不利于珍珠蘆薈增殖。大多數(shù)植物生根都需要植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，本研究中的珍珠蘆薈也不例外，在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度較低時(shí)可以促進(jìn)生長(zhǎng)，在IBA質(zhì)量濃度高于0.5 mg·L-1、NAA質(zhì)量濃度高于1.0 mg·L-1會(huì)抑制生長(zhǎng)，且長(zhǎng)出的根系也不夠粗壯。

提高移栽成活率是組織培養(yǎng)技術(shù)的重要環(huán)節(jié)之一，移栽前對(duì)蘆薈組培苗進(jìn)行煉苗，其抗性增強(qiáng)，成活率較高[16]。珍珠蘆薈組培苗雖然有一定的光合作用能力，但在試管培養(yǎng)期間處在弱光、恒溫、高濕、低CO2環(huán)境下生長(zhǎng)，適應(yīng)性和光合自養(yǎng)能力相對(duì)較差。朱峰[11]研究表明經(jīng)過練苗的再生植株移栽成活率可以達(dá)到85%以上。林加根等[17]研究認(rèn)為蘆薈試管苗煉苗7 d后移栽成活率可達(dá)97%以上。本研究中，珍珠蘆薈組培苗沒有煉苗就移栽，成活率低，且栽培過程中植株恢復(fù)較慢。煉苗以溫室大棚煉苗15 d左右為最佳，成活率較高，植株長(zhǎng)勢(shì)健康。與前人研究的蘆薈試管苗練苗時(shí)間有所差異可能是因?yàn)槠贩N、地域環(huán)境不同所導(dǎo)致。

珍珠蘆薈等多肉品種，葉片較厚，肉質(zhì)化程度高，葉片儲(chǔ)水量高，移栽過程(特別是在夏天)容易出現(xiàn)化水腐爛現(xiàn)象。因此，珍珠蘆薈組培苗在移栽前需要通過晾苗，利用蒸發(fā)作用降低葉片含水量，減少植株移栽過程中出現(xiàn)化水、落葉、植株腐爛等現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)蘆薈試管苗晾苗時(shí)間為5 d時(shí)，植株移栽成活率最高。不同栽培基質(zhì)對(duì)組培苗的成苗率、形態(tài)指標(biāo)、生長(zhǎng)量、評(píng)價(jià)指標(biāo)和葉部病害發(fā)病率影響較大[18]，基質(zhì)的選擇是組培苗移栽成活的關(guān)鍵，混合基質(zhì)較單一基質(zhì)明顯有利于組培苗的成活和生長(zhǎng)[19]。本試驗(yàn)選用透氣性及排水較好的進(jìn)口草炭、蛭石、珍珠巖以及赤玉土作為栽培基質(zhì)，進(jìn)口草炭∶赤玉土=3∶1的混合基質(zhì)為最佳，能有效提高移栽成活率。同時(shí)移栽后的管理過程中，也需要對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行管控，要適當(dāng)控制光照強(qiáng)度、空氣濕度，確保培養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，以降低植株移栽過程中出現(xiàn)爛苗等的幾率，提高其成活率。

本研究利用珍珠蘆薈莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)作為外植體，建立了珍珠蘆薈組織培養(yǎng)快速技術(shù)繁殖及生根培養(yǎng)和練苗移栽體系，能夠快速獲得大量成本較低、質(zhì)量較高的珍珠蘆薈種苗，可為珍珠蘆薈的規(guī)?；a(chǎn)提供參考。