吳永彬，李 凌

（1.廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院檢驗科, 廣西桂林 541002； 2.南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣州 510515）

規(guī)律成簇間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）相互協(xié)同，構(gòu)成原核生物中CRISPR/Cas自適應免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)。近年來，該系統(tǒng)被開發(fā)成為一種高效的分子診斷工具[1-2]，并在感染性疾病的診斷領(lǐng)域取得重大突破[3-6]，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）及其變異株[7-8]引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）作為一種新的傳染病，其導致的疫情仍在全球肆虐，快速、便攜、準確的診斷方法是及時發(fā)現(xiàn)病原體，防止疫情擴散的重要手段。為此，本文將關(guān)注現(xiàn)有和正在研究的CRISPR/Cas系統(tǒng)用于COVID-19快速診斷的潛在能力，并重點探討其在臨床中的應用和面臨的挑戰(zhàn)，以期為新一代分子診斷技術(shù)的研究和SARS-CoV-2等病原體的檢測提供借鑒和參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)工作機制

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)簡介 CRISPR/Cas系統(tǒng)由四部分組成，分別為CRISPR簇、前導序列、重復序列、以及一系列保守的CRISPR相關(guān)基因。最初發(fā)現(xiàn)于原核生物的基因組中，包括細菌和古細菌[9]，隨著Cas的發(fā)現(xiàn)和重組DNA技術(shù)的應用，科學家又發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)還是原核生物防御系統(tǒng)對病毒的自適應免疫基礎(chǔ)，其通過俘獲一段外源DNA序列，找出其原間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif, PAM），表達并加工CRISPR RNAs（crRNA），當噬菌體二次感染時，crRNA與Cas蛋白復合物相互作用，形成一個具有特殊功能的復合物crRNP（crRNA-Cas ribonucleoprotein），靶向干擾入侵核酸的合成，特異性地阻止噬菌體感染，見圖1。近年來，經(jīng)過重新設(shè)計的Cas擴展了CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能和應用，也豐富了CRISPR/Cas系統(tǒng)的進化分類[10]，即類別一（包含I, III和IV型）和類別二（包含II, V和VI型）。CRISPR/Cas系統(tǒng)常用的Cas蛋白為II型（Cas9等）、V型（Cas14, Cas12a, Cas12b等）和VI型（Cas13a,Cas13b等）效應蛋白[11-12]。其中Cas12和Cas13在COVID-19快速診斷中的應用越來越受到重視[13-15]，包括近期SARS-CoV-2新變異株的診斷[16-17]。

1.2 CRISPR/Cas12系統(tǒng)工作機制 Cas12具有RNA核糖核苷酸酶（RNA ribonuclease, RNase）和DNA核糖核苷酸酶（DNA ribonuclease, DNase）活性，可激活獨立的crRNA生物反應[18]，無需反式激活crRNA（trans-activating crRNA, tracrRNA）的協(xié)助。在CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中，Cas12a（或稱Cpf1）特異性地識別DNA靶標內(nèi)的5＇-TTTV-3＇PAM，使crRNA間隔區(qū)片段特異性地與靶標DNA堿基配對[19]，實現(xiàn)DNA雙鏈切割，形成黏性末端，見圖1?；谠撎匦?，CHEN等[20]人開發(fā)了一種新型的分子診斷工具，即DNA內(nèi)切酶靶向的CRISPR反式報告系統(tǒng)（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter, DETECTR）。在該系統(tǒng)中，Cas12a利用自身的核酶功能域?qū)rRNA的表達陣列進行剪切，并與熒光淬滅法結(jié)合起來實現(xiàn)基因編輯。同時，通過重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification, RPA）技術(shù)來提高檢測系統(tǒng)的靈敏度，進一步提升了其整體檢測優(yōu)勢和臨床應用價值。

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)工作機制

1.3 CRISPR/Cas13系統(tǒng)工作機制 與其他Cas不同的是，Cas13a（或稱C2c2）具有雙重核酸酶特性[21]，一方面專一靶向RNA進行剪切靶序列，另一方面又非特異性地對附近的RNA片段進行無差別的“附帶剪切”[22]。其工作機制是：先募集由重復莖環(huán)結(jié)構(gòu)和間隔序列構(gòu)成的向?qū)NA（guide RNA, gRNA）片段，再由gRNA-Cas13復合物通過RNA-RNA配對識別靶RNA并切割靶向區(qū)域，此過程中Cas13需要前間隔序列側(cè)翼位點（protospacer-flanking site, PFS）來協(xié)助鎖定目標RNA，見圖1?；谠撎匦裕硪环N新型的分子診斷工具，即特異性高靈敏度酶促解鎖系統(tǒng)（specific high-sensitivity enzymatic reporter unLOCKing, SHERLOCK）由MYHRVOLD等[4]人建立起來，其借助RPA恒溫擴增技術(shù)對樣本中核酸進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)T7核糖核酸聚合酶介導轉(zhuǎn)錄后再通過Cas13a工具進行檢測。目前，該系統(tǒng)通過不斷優(yōu)化，引入輔助性CRISPR相關(guān)酶Csm6，已實現(xiàn)更高靈敏度的定量檢測[23]。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在COVID-19快速診斷中的應用

目前，COVID-19的常見診斷分子技術(shù)主要有逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、恒溫擴增[如：重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification， RPA）、環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、重組酶介導擴增（recombinase-aided amplification, RAA）等]、微滴數(shù)字PCR、微流控芯片等，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)開發(fā)的快速診斷平臺見表1。與傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)比較，其具有以下幾點優(yōu)勢：①快速，現(xiàn)有的技術(shù)平臺均可在1h左右完成，快速綜合核酸酶串聯(lián)檢測（fast integrated nuclease detection in tandem, FIND-IT）甚至可縮短至20min內(nèi)完成。②便攜，無需大型和專用的設(shè)備，如FIND-IT，使用CRISPR酶Cas13和Csm6放大熒光信號，而不用借助擴增儀來完成。③準確，以SHERLOCKv2技術(shù)為例，其靈敏度高至10-21摩爾水平。④廉價，如SHERLOCKv2試紙只需幾美元、DETECTR單次檢測成本不到一美元。⑤多通路，基于不同的Cas和酶的組合，CRISPR/Cas系統(tǒng)可實現(xiàn)多通路檢測，如Cas12a，Cas13與Csm6的組合。上述特點充分展現(xiàn)了CRISPR/Cas系統(tǒng)在COVID-19快速診斷中的優(yōu)勢。其中，DETECTR和SHERLOCK，盡管他們?nèi)蕴幱诔跗谘邪l(fā)階段，但可能是臨床應用最有潛力的兩種技術(shù)平臺[24-26]。

表1 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)快速診斷COVID-19的主要技術(shù)平臺

2.1 DETECTR快速診斷COVID-19 DETECTR平臺已用于實驗室和臨床環(huán)境中的大量病毒的診斷?；诘葴財U增與CRISPR/Cas12系統(tǒng)相結(jié)合的DETECTR技術(shù)可特異性地檢測SARS-CoV-2的N基因和E基因，且在30min左右獲得結(jié)果[38-39]，這節(jié)省了基于Cas13a檢測所需的體外轉(zhuǎn)錄步驟花費的時間[40]。而且DETECTR可以同時使用不同的gRNA來避免由于N基因突變引起的假陰性結(jié)果[40]。此外，相較于其他人源性冠狀病毒，DETECTR檢測SARS-CoV-2的特異度可達100%[39]。因此，無需特殊設(shè)備的DETECTR技術(shù)可作為RTPCR技術(shù)的有效補充[41]。

2.2 SHERLOCK快速診斷COVID-19 SHERLOCK是最早基于CRISPR/Cas系統(tǒng)應用于COVID-19快速診斷的技術(shù)平臺[42-43]，并得到不斷的優(yōu)化和升級[44]。在crRNA的引導下，Cas13識別并結(jié)合SARS-CoV-2兩個靶基因S和ORF1ab，同時激發(fā)了Cas13對周圍ssRNA分子的“附帶剪切”，系統(tǒng)將淬滅熒光的ssRNA報告基團添加到反應中，當激活的Cas13切割RNA后，收集檢測信號以示目標核酸的存在。同時，通過RPA或RT-RPA擴增目標DNA或RNA，再與T7轉(zhuǎn)錄相結(jié)合，將擴增后的DNA轉(zhuǎn)化為RNA，以利于后續(xù)的Cas13檢測，最終使其檢測靈敏度可及10-18摩爾水平，特異度更是達到單堿基錯配，且在不到1h內(nèi)無需特殊設(shè)備條件下完成檢測。

2.3 FIND-IT快速診斷COVID-19 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)快速診斷COVID-19的主要技術(shù)平臺幾乎都是建立在基因擴增的基礎(chǔ)上設(shè)計，見表1歸納的前10種技術(shù)平臺。根據(jù)最新研究，LIU等[37]人開發(fā)了一種不依賴于恒溫擴增技術(shù)的FIND-IT技術(shù)，即通過RNA引導的Cas13和Csm6與化學穩(wěn)定激活劑相結(jié)合，可以使用緊湊型探測器檢測從呼吸道拭子樣本中提取的SARS-CoV-2，并在20min內(nèi)實現(xiàn)對每微升RNA標本約30個拷貝進行穩(wěn)定檢測的能力[37]。該方法特別適合于標準實驗室之外的場地開展，如臨床床旁和資源有限的偏遠地區(qū)。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在COVID-19快速診斷中的局限

新興的基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的診斷工具在SARS-CoV-2等病原體的檢測中也存在一些局限：①CRISPR/Cas系統(tǒng)自身在病原體檢測優(yōu)勢還未充分體現(xiàn) ：（a）需借助其他分子診斷技術(shù)輔助進行，（b）需利用多個不同的Cas實現(xiàn)多重病原體檢測，（c）需結(jié)合預擴增環(huán)節(jié)提高檢測靈敏度；②CRISPR/Cas系統(tǒng)在對RNA靶標進行編輯時存在易脫靶情況；③CRISPR/Cas系統(tǒng)在真核細胞中進行有效的ssRNA切割時可能存在毒性；④CRISPR/Cas12系統(tǒng)存在較低的基因組覆蓋率和較低的靶向效率等缺點[45-47]；⑤CRISPR/Cas13系統(tǒng)在多步核酸擴增環(huán)節(jié)中存在可能影響精確定量的缺陷。其中，針對常見的脫靶效應帶來的問題，目前解決的策略主要是從預測脫靶位點，優(yōu)化sgRNA設(shè)計及修飾Cas蛋白結(jié)構(gòu)等途徑入手[48]。

4 總結(jié)與展望

CRISPR/Cas技術(shù)革新了分子診斷領(lǐng)域的研究模式，尤其是在感染性疾病的診斷上具有廣闊的應用前景。本文重點論述了其在COVID-19快速診斷中的潛在應用，盡管諸如DETECTR和SHERLOCK等技術(shù)尚未完全實現(xiàn)商業(yè)化，但CRISPR/Cas系統(tǒng)的精確度和易操作程度目前在其他分子診斷工具中是無法實現(xiàn)的?，F(xiàn)有的COVID-19診斷技術(shù)仍由數(shù)十年前的RT-PCR技術(shù)所主導，其昂貴的專用設(shè)備和嚴苛的實驗環(huán)境限制了其在體外診斷的施展空間，尤其是近期出現(xiàn)的SARS-CoV-2新型突變體，給全球持續(xù)緊張的疫情防控帶來了新的挑戰(zhàn)。目前，相同的突變體已在不同國家獨立出現(xiàn)[49]，新的突變位點可能會增加SARS-CoV-2的傳染性，甚至對現(xiàn)有的治療和疫苗接種人群構(gòu)成重大威脅[50-51]。從長遠而言，開發(fā)高效的且同時覆蓋病原體多個靶基因位點的新型分子診斷工具更具臨床價值。另外，鑒于CRISPR/Cas系統(tǒng)本身的局限性，可以預見的是，未來的CRISPR/Cas技術(shù)平臺仍離不開其他技術(shù)的支持，除前述的各類PCR，恒溫擴增外，后期還會有更多的新興材料與技術(shù)加入到CRISPR/Cas系統(tǒng)中，開發(fā)出更為實用和智能的診斷工具，這將為COVID-19等感染性疾病的快速診斷帶來新的希望和契機。