吳 鵬，宋惠月,*，韓麗春，王正榮,2,*

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056107；2.邯鄲市天然產(chǎn)物與功能食品開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 邯鄲 056107）

海棠果為薔薇科蘋果屬植物的果實(shí)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與獼猴桃媲美，以“百益之果”著稱[1]。靈芝是一種珍貴的中藥材，也是藥食同源食品，具有提高免疫力等多重功效，其含有靈芝三萜化合物、蛋白質(zhì)、生物堿等，這些有效成分都具有廣泛的生物活性和藥用價(jià)值[2]。桂花富含苯丙素類等100 多種有效成分，具有抗氧化等藥理活性[3]。近年來(lái)，復(fù)合飲料越來(lái)越受到人們的歡迎，將不同原料合理搭配制成復(fù)合飲料，不僅營(yíng)養(yǎng)更全面，且綜合了多種風(fēng)味，可提升口感，比單一的飲料更具有保健功效。鑒于海棠果、靈芝、桂花的藥用價(jià)值和保健功效，本試驗(yàn)將海棠靈芝桂花制成復(fù)合飲料，以期為相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

海棠果，采自河北工程大學(xué)校內(nèi)海棠園；靈芝，采自河北工程大學(xué)食藥用菌研究所；干桂花、β-環(huán)糊精、黃原膠、蔗糖、檸檬酸、HC 果膠酶（酶活力≥60 000 U/mL），均為食品級(jí)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

F-1000 搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，新昌縣德科機(jī)械有限公司；FA2004B 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器公司；752N 紫外分光光度計(jì)，江蘇天瑞儀器股份有限公司；HH-S6 型恒溫水浴鍋，濟(jì)南歐萊博技術(shù)有限公司；DGG-9146A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博珍儀器設(shè)備制造廠；PSH-25 型酸度計(jì)，深圳準(zhǔn)控科技有限公司；JYL-C022E 九陽(yáng)榨汁機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司；PRH60-70 高壓均質(zhì)機(jī)，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

海棠果→預(yù)處理（挑選、清洗、去蒂、去籽）→護(hù)色→軟化打漿→酶解→過濾→海棠果汁

靈芝→預(yù)處理→烘干→粉碎→浸提→過濾→靈芝汁

桂花→預(yù)處理→浸提→過濾→桂花汁

海棠果汁+靈芝汁+桂花汁→調(diào)配→均質(zhì)→灌裝→滅菌→冷卻→成品

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 海棠果汁的制備

新鮮海棠果，清洗3 遍，去蒂去籽后切塊，加入海棠果塊2 倍質(zhì)量的85 ℃熱水，軟化1~2 min，靜置至室溫后撈出，用榨汁機(jī)榨汁后加入0.04%果膠酶，攪拌均勻，溫度設(shè)置為45 ℃，酶解120 min，pH 值為4.0，200 目篩過濾得到海棠果汁，置于冰箱5 ℃保存[4]。

1.2.2.2 靈芝汁的制備

將靈芝片洗凈，放入干燥箱60 ℃烘干至恒重，用粉碎機(jī)打碎后過200 目篩，按靈芝與水1∶200（g/mL）的比例于70 ℃下浸提2 h，200 目篩過濾取汁，留靈芝渣加入等體積水（加水量同第1 次），溫度80 ℃，浸提3 h，200 目篩過濾取汁，兩次汁液合并得到靈芝汁，置于5 ℃冰箱保存[5]。

1.2.2.3 桂花汁的制備

1 g 干桂花加100 mL 水，80 ℃浸提10 min，200目篩過濾取汁，桂花濾渣再加水100 mL，85 ℃浸提15 min，200 目篩過濾取汁，兩次合并得到桂花汁，置于5 ℃冰箱保存。

1.2.2.4 調(diào)配

海棠果汁、靈芝汁、桂花汁、檸檬酸、蔗糖按一定比例調(diào)配好，加入適量的CMC-Na、黃原膠、β-環(huán)糊精以調(diào)節(jié)復(fù)合飲料的口感和風(fēng)味。

1.2.2.5 均質(zhì)、滅菌

使用PRH60-70 高壓均質(zhì)機(jī)在60 ℃條件下進(jìn)行均質(zhì)，然后在62.8 ℃，30 min 的條件下對(duì)飲料進(jìn)行滅菌。

1.2.3 復(fù)合飲料單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

海棠靈芝桂花復(fù)合飲料的基本工藝條件為：海棠果汁添加量50%，靈芝汁添加量6%，桂花汁添加量12%，其他未滿100%部分由純凈水補(bǔ)充，蔗糖添加量100 g/L，檸檬酸添加量0.2 g/L。以復(fù)合飲料的感官評(píng)分為指標(biāo)，在此基礎(chǔ)上分別對(duì)海棠果汁（30%、40%、50%、60%、70%）、靈芝汁（4%、6%、8%、10%、12%）、桂花汁（6%、8%、10%、12%、14%）、蔗糖（70、80、90、100、110 g/L）和檸檬酸（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4 海棠靈芝桂花復(fù)合飲料正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究海棠果汁、靈芝汁、桂花汁、蔗糖、檸檬酸這5 個(gè)因素對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響，進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平如表1 所示。

表1 復(fù)合飲料正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test factors and levels design table of compound beverage

1.2.5 復(fù)合飲料穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.2.5.1 復(fù)合飲料穩(wěn)定性單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過預(yù)試驗(yàn)得出海棠靈芝桂花復(fù)合飲料穩(wěn)定劑的基本配方為：黃原膠0.3 g/L，CMC-Na 0.4 g/L，β-環(huán)狀糊精0.6 g/L。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以R 值為指標(biāo)，分別考察黃原膠（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L）、CMC-Na（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）、β-環(huán)狀糊精（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）添加量對(duì)復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響。

1.2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合飲料穩(wěn)定劑配方

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇黃原膠、CMC-Na、β-環(huán)狀糊精作為自變量，感官評(píng)價(jià)作為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6 軟件并使用Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)[6]。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 復(fù)合飲料穩(wěn)定劑優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Response surface experimental factors and levels table of compound beverage stabilizer optimization 單位：g/L

1.2.6 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.6.1 感官評(píng)價(jià)

由10 人組成感官評(píng)價(jià)小組，根據(jù)表3 的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)復(fù)合飲料進(jìn)行評(píng)價(jià)，取平均值作為最終分?jǐn)?shù)。

表3 復(fù)合飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standards of compound beverage

1.2.6.2 穩(wěn)定性

取10 mL 復(fù)合飲料在5 000 r/min 下離心10 min，于660 nm 處測(cè)定離心前的吸光度值A(chǔ)1和離心后上清液的吸光度值A(chǔ)0，以蒸餾水作空白。

依據(jù)R（%）=A0/A1×100 計(jì)算穩(wěn)定性，R 值越大說明穩(wěn)定性越好[7]。

1.2.6.3 理化指標(biāo)

可溶性固形物含量：參照GB/T 12143—2008[8]中的方法測(cè)定；pH 值：直接用手持酸度計(jì)測(cè)定。

1.2.6.4 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)：參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[9]中的方法測(cè)定；大腸菌群：參考GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[10]中的方法測(cè)定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海棠靈芝桂花復(fù)合飲料配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 海棠果汁添加量的確定

在口感最佳的條件下，就營(yíng)養(yǎng)價(jià)值來(lái)說，果汁含量越高則營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高。由圖1 可見，海棠靈芝桂花復(fù)合飲料的感官品質(zhì)隨海棠果汁添加量的增加先上升后下降，這是由于隨著海棠果汁添加量的增加，復(fù)合飲料中海棠果實(shí)的香氣逐漸濃郁，其口感提升，當(dāng)海棠果汁添加量大于50%時(shí)，飲料中其他物質(zhì)的香氣被海棠果特有的香氣覆蓋，感官評(píng)分逐漸下降。在海棠果汁添加量為50%時(shí)，飲料味道微甜，果香味濃郁，靈芝桂花味道適中，顏色呈橙黃色，口感較佳。

圖1 海棠果汁添加量對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of begonia fruit juice additions on sensory qualities of compound beverage

2.1.2 靈芝汁添加量的確定

由圖2 可知，隨著靈芝汁添加量的升高，海棠靈芝桂花復(fù)合飲料逐漸變得苦澀，這是由靈芝本身苦澀而又發(fā)甜的口感決定的。在靈芝添加量小于6%時(shí)，飲料整體并未出現(xiàn)苦澀感；但當(dāng)靈芝汁添加量大于6%，靈芝所帶來(lái)的苦澀感逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，從而影響整體的口感。因此復(fù)合飲料的感官評(píng)分隨靈芝汁添加量的增加先上升后下降，并在靈芝汁添加量為6%時(shí)感官評(píng)分到達(dá)峰值（89 分），此時(shí)的復(fù)合飲料呈現(xiàn)鮮亮的橙黃色，靈芝味道濃郁，但又無(wú)苦澀感，口感細(xì)膩，層次感突出。

圖2 靈芝汁添加量對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effects of Ganoderma lucidum juice additions on sensory qualities of compound beverage

2.1.3 桂花汁添加量的確定

由圖3 可知，海棠靈芝桂花復(fù)合飲料的感官評(píng)分隨著桂花汁添加量的增加先升高后下降，并在添加量為10%時(shí)感官評(píng)分到達(dá)峰值（91 分），此時(shí)的復(fù)合飲料桂花香氣濃厚，顏色和口感較好。

圖3 桂花汁添加量對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of Osmanthus fragrans juice additions on sensory qualities of compound beverage

2.1.4 蔗糖添加量的確定

由圖4 可知，海棠靈芝桂花復(fù)合飲料的感官評(píng)分隨蔗糖添加量的增加先上升后下降，并在蔗糖添加量為90 g/L 時(shí)，感官評(píng)分到達(dá)峰值（92 分），此時(shí)的復(fù)合飲料酸甜適中，果香味十足，層次感較好，顏色和味道均較好。

圖4 蔗糖添加量對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effects of sucrose additions on sensory qualities of compound beverage

2.1.5 檸檬酸添加量的確定

由圖5 可知，隨檸檬酸添加量的增加，海棠靈芝桂花復(fù)合飲料的感官評(píng)分先上升后下降，當(dāng)檸檬酸添加量為0.2 g/L 時(shí)，剛好能夠覆蓋海棠果等原料本身帶有的酸澀異味，若繼續(xù)增加檸檬酸添加量，則飲料會(huì)變得酸澀，口感下降。

圖5 檸檬酸添加量對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響Fig.5 Effects of citric acid additions on sensory qualities of compound beverage

2.2 海棠靈芝桂花復(fù)合飲料配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

通過表4 正交試驗(yàn)結(jié)果和表5 方差分析表明，幾種因素中海棠果汁和桂花汁對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響具有顯著性（P＜0.05），且海棠果汁的影響程度大于桂花汁。各因素對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分影響的主次順序?yàn)椋篈＞E＞C＞B=D，海棠果汁的影響最大，蔗糖和靈芝汁的影響最??；復(fù)合飲料最優(yōu)配方為：A3B2C4D4E2，即海棠果汁50%，靈芝汁6%，桂花汁12%，蔗糖添加量100 g/L，檸檬酸添加量0.2 g/L。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results

表5 正交試驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test

由于得到的最佳組合不在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，需對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，按照A3B2C4D4E2制備的復(fù)合飲料感官評(píng)分為94 分，高于試驗(yàn)中已有最佳組合A3B1C3D4E2的感官評(píng)分。因此復(fù)合飲料的最佳配方為：A3B2C4D4E2，按照此方法配制的飲料呈橙黃色，色澤純正，透光性好，口感層次分明，酸甜適中。

2.3 復(fù)合飲料穩(wěn)定劑單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 黃原膠添加量對(duì)復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

由于黃原膠無(wú)毒無(wú)害易溶于水，溶液呈中性、耐性強(qiáng)，遇水分散，變成穩(wěn)定的親水性黏性膠體，所以可用黃原膠作為增加飲料穩(wěn)定性的添加劑，但黃原膠過量會(huì)使液體黏性過大。由圖6 可知，隨著黃原膠添加量的增加，復(fù)合飲料的穩(wěn)定性（R 值）呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)黃原膠添加量在0.2~0.4 g/L 時(shí)，復(fù)合飲料的穩(wěn)定性較好；低于0.2 g/L 時(shí)，離心后離心管中可見沉淀較多；高于0.4 g/L 時(shí)，飲料的黏稠度增高，使得口感下降。

圖6 黃原膠添加量對(duì)復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of xanthan gum additions on the stability of compound beverage

2.3.2 CMC-Na 添加量對(duì)復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

由圖7 可知，隨著CMC-Na 添加量的增加，復(fù)合飲料的穩(wěn)定性（R 值）呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)CMC-Na添加量為0.2~0.6 g/L 時(shí)，穩(wěn)定性較好，復(fù)合飲料穩(wěn)定無(wú)分層，無(wú)沉淀。高于0.6 g/L 時(shí)，飲料開始變得黏稠，影響飲料流動(dòng)性，口感下降。

圖7 CMC-Na 添加量對(duì)復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of CMC-Na additions on the stability of compound beverage

2.3.3 β-環(huán)狀糊精添加量對(duì)復(fù)合飲料穩(wěn)定性的影響

由圖8 可見，隨著β-環(huán)狀糊精添加量的增加，復(fù)合飲料的穩(wěn)定性（R 值）呈先上升后下降的趨勢(shì)，添加量在0.4~0.8 g/L 時(shí)穩(wěn)定性較好；高于0.8 g/L 時(shí)，飲料過于黏稠導(dǎo)致其流動(dòng)性不佳，使得口感下降；添加量低于0.4 g/L 時(shí)，離心后離心管中可見沉淀較多。

圖8 β-環(huán)狀糊精添加量對(duì)復(fù)合飲料產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of β-cyclodextrin additions on the stability of compound beverage products

2.4 復(fù)合飲料穩(wěn)定劑配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過復(fù)合飲料穩(wěn)定劑單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，黃原膠、CMC-Na、β-環(huán)狀糊精添加量分別在0.2~0.4 g/L、0.2~0.6 g/L、0.4~0.8 g/L 時(shí)穩(wěn)定性較佳。為優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果并得到最佳穩(wěn)定劑配方，利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對(duì)穩(wěn)定劑的添加量進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8，方差分析見表9。

通過利用Box-Behnken 響應(yīng)面對(duì)表8 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合[11]，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=91.20 +2.37X1+2.00X2+2.38X3-0.75X1X2+1.00X1X3-0.25X2X3-11.6X12-9.35X22-6.60X32。

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 8 Response surface experimental design and results

由表9 可知：模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P=0.682 8，說明相對(duì)于純誤差失擬項(xiàng)是不顯著的（P＞0.05）；模型的決定系數(shù)R2= 0.973 3，說明模型97.33%的數(shù)據(jù)可以通過這個(gè)方程來(lái)解釋；并且模型的變異系數(shù)CV 并不高，只有2.96%，說明試驗(yàn)所得到的結(jié)果有很高的精密度和可靠性。通過上述結(jié)果可知，模型完全符合數(shù)理統(tǒng)計(jì)原則，優(yōu)化海棠靈芝桂花復(fù)合飲料穩(wěn)定劑配方可以根據(jù)此方程來(lái)達(dá)到預(yù)測(cè)效果。各因素中，二次項(xiàng)X12、X22、X32的影響極顯著（P＜0.01），X1、X2、X3的影響顯著（P＜0.05），其余各項(xiàng)的影響均不顯著，黃原膠與β-環(huán)狀糊精添加量對(duì)海棠靈芝桂花復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響最大，其次是CMC-Na。

表9 海棠果靈芝桂花復(fù)合飲料回歸模型方差分析結(jié)果Table 9 Variance analysis results of regression model of begonia,Ganoderma lucidum and Osmanthus fragrans compound beverage

利用Desing-Expert 8.0.6 的Box-Behnken 響應(yīng)面分析法分析數(shù)據(jù)得出的響應(yīng)面分析曲面圖和等高線圖，如圖9~11 所示。

通過圖9~11 可以觀察到響應(yīng)面和等高線圖都存在頂點(diǎn)，所選范圍存在極值，等高線形狀為橢圓形[12]。通過單因素試驗(yàn)結(jié)果得出的各因素可選范圍內(nèi)，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，根據(jù)模型回歸分析可得出的穩(wěn)定劑最佳配方為：黃原膠添加量0.3 g/L，CMC-Na添加量0.4 g/L，β-環(huán)狀糊精添加量0.6 g/L，復(fù)合飲料的理論感官評(píng)分為91.65 分。為驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的擬合程度，采用感官評(píng)分最大響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的響應(yīng)因素值進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[13-15]。經(jīng)過3 組平行試驗(yàn)，感官評(píng)分均值為92.1 分，和試驗(yàn)所預(yù)測(cè)的結(jié)果91.65分相近，表明該模型是可靠有效的。

圖9 黃原膠和CMC-Na 添加量的交互作用對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface map and contour map showing the interaction effects between xanthan gum and CMC-Na additions on sensory scores of compound beverage

圖10 黃原膠和β-環(huán)狀糊精添加量的交互作用對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.10 Response surface map and contour map showing the interaction effects between xanthan gum and β-cyclodextrin additions on sensory scores of compound beverage

圖11 CMC-Na 和β-環(huán)狀糊精添加量的交互作用對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.11 Response surface map and contour map showing the interaction effects between CMC-Na and β-cyclodextrin additions on sensory scores of compound beverage

2.5 理化指標(biāo)

按照上述最優(yōu)配方制備的復(fù)合飲料產(chǎn)品，色澤呈橙黃色，具有濃郁的海棠果靈芝桂花的滋味，酸甜適中，無(wú)懸浮物，無(wú)明顯沉淀，pH 值為3.7，可溶性固形物含量≥12%。

2.6 微生物指標(biāo)

海棠靈芝桂花復(fù)合飲料的菌落總數(shù)＜100 CFU/g；大腸菌群＜6 MPN/100 g；致病菌未檢出。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化海棠靈芝桂花復(fù)合飲料的最佳配方為：海棠果汁添加量50%，靈芝汁添加量6%，桂花汁添加量12%，蔗糖添加量100 g/L，檸檬酸添加量0.2 g/L；通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合穩(wěn)定劑的最優(yōu)配方為：黃原膠添加量0.3 g/L，CMC-Na 添加量0.4 g/L，β-環(huán)狀糊精添加量0.6 g/L；按照上述配方制備的復(fù)合飲料感官評(píng)分為92.1 分，飲料色澤呈橙黃色，酸甜柔和，具有海棠果、靈芝、桂花的香氣和營(yíng)養(yǎng)。