陳先意 曲紹軒 駱昕 李輝平 林金盛 蔣寧 侯立娟 馬林 劉慧芹

摘要：為探究熒光假單胞菌MS82中GGDEF結(jié)構(gòu)域基因?qū)-di-GMP調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成及運(yùn)動(dòng)能力的影響，通過抑菌圈法、小試管法、96微孔板法以及運(yùn)動(dòng)性平板分別檢測(cè)GGDEF缺失突變體MT5092、MT0189、MT19和MS82野生型菌株之間的相關(guān)生命活動(dòng)能力的差異。結(jié)果顯示，GGDEF缺失突變型菌株MT5092、MT0189、MT19的抑菌活性、生物被膜形成能力、運(yùn)動(dòng)能力（游泳運(yùn)動(dòng)、集群運(yùn)動(dòng)及抽搐運(yùn)動(dòng)）皆低于突變前的MS82野生型菌株，且突變株與野生株的抑菌活性存在極顯著差異（P<0.01）;36 h的生物被膜形成能力存在極顯著差異;運(yùn)動(dòng)行為存在不一致的顯著（P<0.05）或極顯著差異。最終得出結(jié)論：缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域基因會(huì)降低胞內(nèi)c-di-GMP濃度水平，進(jìn)而影響MS82菌株的生物膜及運(yùn)動(dòng)行為。

關(guān)鍵詞：生防細(xì)菌MS82;GGDEF結(jié)構(gòu)域基因;生物被膜;運(yùn)動(dòng)性

中圖分類號(hào)：S942.3;S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）11-0104-04

收稿日期：2021-09-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號(hào)：31901933）;天津市科技計(jì)劃（編號(hào)：20YDTPJC01330）;天津農(nóng)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：2020XY005）;天津市高校中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃（編號(hào)：J01009030709）。

作者簡(jiǎn)介：陳先意（1997—），女，上海人，碩士研究生，從事植物病理學(xué)研究。E-mail：1156561293@qq.com。

通信作者：劉慧芹，博士，教授，從事植物病害生防研究及生防菌劑研發(fā)，E-mail：wjxlhq@126.com;馬 林，博士，研究員，從事食用菌栽培和病蟲防控研究，E-mail：malin1590@sina.com。

環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）是一種廣泛存在于細(xì)菌中的保守第二信使，作為關(guān)鍵因素調(diào)控著菌落形態(tài)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、生物被膜的形成與擴(kuò)散、鞭毛與菌毛介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)行為、細(xì)胞毒力、抗性分泌等重要生命活動(dòng)。大量試驗(yàn)證明，假單胞菌屬菌株胞內(nèi)c-di-GMP的濃度水平，受到DGCs（二鳥苷酸環(huán)化酶）的催化核心，同時(shí)也是DGCs與2分子GTP結(jié)合形成c-di-GMP的重要結(jié)合位點(diǎn)——GGDEF結(jié)構(gòu)域的調(diào)控。對(duì)c-di-GMP調(diào)控生物膜的研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度的c-di-GMP會(huì)促進(jìn)胞外多糖產(chǎn)生和生物膜形成量的增加，同時(shí)抑制細(xì)菌運(yùn)動(dòng)行為;而低水平的c-di-GMP有利于鞭毛介導(dǎo)的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)卻不利于生物被膜的形成。在探索熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是否符合此結(jié)論時(shí)，選取的試驗(yàn)對(duì)象 Pf0-1 菌株相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，缺失了含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的RapA基因后，細(xì)胞內(nèi) c-di-GMP 水平降低并對(duì)生物膜形成具有抑制作用，卻沒有發(fā)現(xiàn)影響胞外多糖產(chǎn)生或鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性的證據(jù)。

MS82菌株是一株從土壤中發(fā)現(xiàn)的熒光假單胞菌，對(duì)引起食用菌菌種菌料污染、繼而引發(fā)寄生性病害的綠色木霉（Trichoderma viride）具有良好的抑菌作用。突變體MT19是通過隨機(jī)突變方式獲得的一株GGDEF結(jié)構(gòu)域基因破壞菌株，并導(dǎo)致其抑菌活性完全喪失。然而，該基因的突變是否對(duì)生物被膜形成能力和運(yùn)動(dòng)性方面的具體調(diào)控造成影響尚不清楚。

為探索GGDEF結(jié)構(gòu)域基因在MS82菌株中對(duì) c-di-GMP 調(diào)控生物被膜及運(yùn)動(dòng)行為的影響，本研究對(duì)熒光假單胞菌MS82菌株中3個(gè)與c-di-GMP代謝相關(guān)的GGDEF結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)行研究，檢測(cè)MS82野生株與3株不同GGDEF結(jié)構(gòu)域突變株（MT5092、MT0189：基因重組菌株、MT19：隨機(jī)突變菌株）之間的抑菌活性、生物被膜形成量、運(yùn)動(dòng)行為等表型差異，進(jìn)一步探究熒光假單胞菌中c-di-GMP調(diào)控生物被膜及運(yùn)動(dòng)性之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和供試菌株

生防菌：MS82野生型菌株（P. fluorescens），突變型菌株MT5092、MT0189、MT19;病原菌：綠色木霉。所有菌株均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。試驗(yàn)于2020年10月至2021年8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所食用菌研究課題組研究室內(nèi)開展。

1.1.2 相關(guān)培養(yǎng)基制備

LB培養(yǎng)基（1 L）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl;

LB固體培養(yǎng)基（1 L）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl、15 g瓊脂;

氨芐液體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基成分中加入0.1% 50 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）;

氨芐固體培養(yǎng)基：在LB固體培養(yǎng)基成分中加入0.1% 50 μg/mL Amp;

游泳運(yùn)動(dòng)（swimming motility）培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基成分中加入0.3 %瓊脂粉;

集群運(yùn)動(dòng)（swaming motility）培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基成分中加入0.7%瓊脂粉、0.5%葡萄糖;

抽搐運(yùn)動(dòng)（twitching motility）培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基成分中加入3%瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備

MS82、MT5092、MT0189、MT19菌株在氨芐固體培養(yǎng)基上活化，28℃倒置培養(yǎng) 16 h。選擇單菌落重新劃線，28℃倒置培養(yǎng)16 h。將各菌株單菌落接入5 mL LB培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h，4℃、4 000 r/min離心 3 min，棄上清，用無菌水將菌體重懸并稀釋至吸光度D=0.05，備用。

1.2.2 突變體抑菌能力測(cè)定

采用抑菌圈法測(cè)定：分別取10 μL制備好的菌液置于LB固體培養(yǎng)基中心，待菌液晾干后，用小噴壺噴適量用無菌水稀釋的綠色木霉孢子懸浮液（孢子濃度2億CFU/mL），28℃倒置培養(yǎng)2 d，測(cè)量各菌株抑菌圈直徑。

1.2.3 c-di-GMP相關(guān)基因生物膜形成測(cè)定

采用小試管法與96微孔板法測(cè)定c-di-GMP對(duì)生物膜形成的影響。

（1）小試管法：分別在含有 5 mL LB培養(yǎng)基的滅菌試管中加入5 μL各菌株菌液，28℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后，靜置36 h。1%結(jié)晶紫染色后，觀察管內(nèi)形成染色環(huán)狀物的顏色深淺。

（2）96微孔板法：96孔板中每孔加入100 μL的LB培養(yǎng)基及各菌株備用菌液10 μL，28℃靜置孵育，分別于12、24、36 h取出。1%結(jié)晶紫染色后，加入 100 μL 33%乙酸溶解30 min。以LB培養(yǎng)基為參比，用紫外分光光度計(jì)在熒光假單胞菌最大吸光波長(zhǎng)590 nm處測(cè)定菌液吸光度D。

1.2.4 c-di-GMP相關(guān)基因運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定

本研究運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)方法對(duì)謝杰鵬等的方法進(jìn)行改進(jìn)。

（1）游泳運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定：各菌株分別取10.0、2.5 μL 菌液，接種在泳動(dòng)培養(yǎng)基表面正中間，28℃培養(yǎng) 24 h 后，觀察以接種中心蔓延的云霧狀區(qū)域，測(cè)量該區(qū)域的直徑。

（2）集群運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定：分別吸取10.0、2.5 μL 菌液接種在集群運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基表面中心，28℃恒溫培養(yǎng) 24 h 后，觀察以接種中心生長(zhǎng)蔓延的區(qū)域，測(cè)量該區(qū)域的直徑。

（3）抽搐運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定：用無菌牙簽蘸取各菌株菌液，接種在抽搐運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基底部，28℃恒溫培養(yǎng) 48 h 后，輕輕揭去培養(yǎng)基，用0.9%生理鹽水沖洗培養(yǎng)皿底部未黏附的細(xì)菌，1%結(jié)晶紫溶液染色后，觀察以細(xì)菌接種點(diǎn)為中心形成的區(qū)域，測(cè)量該區(qū)域的直徑。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，測(cè)量數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)軟件進(jìn)行單因素方差分析計(jì)（ANOVA），采用LSD-Tamhane's T2 進(jìn)行兩兩比較。數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌能力分析

抑菌圈法產(chǎn)生的透明抑菌圈直徑越大，則表明該菌株的抑菌活性越強(qiáng)，反之越弱。MS82野生型菌株和3個(gè)GGDEF結(jié)構(gòu)域基因突變體菌株對(duì)綠色木霉的抑菌活性如圖1所示，可以看出，3個(gè)突變體菌株的抑菌活性均有不同程度的降低。其中MT19完全喪失抑菌能力，無抑菌圈產(chǎn)生;MT5092與M0189產(chǎn)生的抑菌圈均極顯著小于MS82野生型（P<0.01）。4個(gè)菌株的抑菌活性依次為MS82>MT0189>MT5092>MT19。

2.2 生物被膜形成能力差異分析

MS82菌株中3個(gè)含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的基因分別被突變后，生物被膜的形成能力表現(xiàn)出了明顯的變化。從小試管法的試驗(yàn)結(jié)果（圖2）可以看出，MS82菌株的菌體生物膜經(jīng)過染色后顏色比3個(gè)突變菌株深，且環(huán)狀完整，表明生成的細(xì)菌數(shù)量多，生物被膜形成量多，生物被膜形成能力強(qiáng)。96微孔板法試驗(yàn)結(jié)果（圖3）與圖2一致，即3個(gè)基因突變后的生物被膜形成能力明顯變?nèi)?，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，差異逐漸增大;同時(shí)3個(gè)突變菌株的生物被膜形成能力隨時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸趨于一致。

2.3 運(yùn)動(dòng)性能力差異分析

2.3.1 游泳運(yùn)動(dòng)

具有鞭毛的細(xì)菌在液體中借助鞭毛的旋轉(zhuǎn)，使菌體能定向泳動(dòng)，在培養(yǎng)基表面表現(xiàn)為類圓形云霧狀擴(kuò)散。圖4試驗(yàn)結(jié)果表明，點(diǎn)樣10.0 μL時(shí)各菌株的游泳圈直徑大于點(diǎn)樣2.5 μL時(shí)，3株缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域基因的突變型菌株擴(kuò)散直徑小于野生型，表現(xiàn)出游泳運(yùn)動(dòng)缺陷。不同點(diǎn)樣量下，MS82野生型菌株與3株突變型菌株之間均表現(xiàn)為極顯著差異。MS82、MT5092、MT0189、MT19 這4個(gè)菌株的泳動(dòng)能力強(qiáng)弱呈現(xiàn)依次下降的趨勢(shì)。

2.3.2 集群運(yùn)動(dòng)

細(xì)菌在高密度下會(huì)發(fā)生集群運(yùn)動(dòng)，在相應(yīng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)以接種點(diǎn)為中心向外蔓延的生長(zhǎng)區(qū)域，生長(zhǎng)區(qū)域直徑越大，表明細(xì)菌的集群運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)。對(duì)比數(shù)據(jù)（圖5）發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)樣10.0、2.5 μL 時(shí)各菌株之間的差異性一致。野生型MS82菌株的生長(zhǎng)區(qū)域直徑顯著或極顯著大于基因突變后的3個(gè)突變菌株。說明含有GGDEF結(jié)構(gòu)域基因的缺失影響了MS82菌株的集群運(yùn)動(dòng)能力。

2.3.3 抽搐運(yùn)動(dòng)

通過刺傷試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌的抽搐運(yùn)動(dòng)能力時(shí)，會(huì)在培養(yǎng)基與底部培養(yǎng)皿之間形成淺白色的位移區(qū)域。觀察試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于突變型菌株，野生型菌株MS82向四周發(fā)生的位移距離更大，且位移邊緣不平整，表明有繼續(xù)向外發(fā)生位移的趨勢(shì)，而突變型菌株發(fā)生的位移距離小，邊緣光滑呈類圓形。進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)（圖6）可知，突變株MT0189位移距離雖然變小但與野生株之間無顯著性差異;突變株MT5092位移區(qū)域顯著減小，約為野生株的1/2;突變株MT19位移區(qū)域極顯著減小，幾乎不發(fā)生位移。

3 討論

c-di-GMP作為細(xì)菌內(nèi)調(diào)節(jié)多細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)因子，胞內(nèi)濃度水平由該系統(tǒng)的上下游信號(hào)分別調(diào)節(jié)，并影響細(xì)菌不同的生命活動(dòng)。濃度低時(shí)，上游合成信號(hào)DGCs與2分子GTP在GGDEF結(jié)構(gòu)域的活性部位結(jié)合形成c-di-GMP，提高胞內(nèi)c-di-GMP濃度水平，促進(jìn)生物被膜的形成;濃度高時(shí)，多余的c-di-GMP會(huì)與GGDEF結(jié)構(gòu)域的抑制位點(diǎn)相結(jié)合，或被特異性磷酸二酯酶（PDEs）感知并分解，抑制生物被膜的形成。同時(shí)，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)行為的表達(dá)在生物被膜形成過程中是相互聯(lián)系、共同參與的。c-di-GMP在高水平下限制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)行為，進(jìn)而有利于形成生物被膜;相反c-di-GMP在低水平下，有利于鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)行為，不利于生物被膜的形成。

c-di-GMP信號(hào)系統(tǒng)接收到環(huán)境信號(hào)會(huì)使熒光假單胞菌產(chǎn)生包括2，4-二乙?；g苯三酚、藤黃綠膿菌素、硝吡咯菌素、氫氰酸等多種能夠防治病原微生物的抑菌物質(zhì)。此前在對(duì)熒光假單胞菌喪失GGDEF結(jié)構(gòu)域的突變體MT19進(jìn)行抑菌活性測(cè)定時(shí)，MT19表現(xiàn)出明顯的抑菌活性缺陷。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究對(duì)比同源重組突變株MT5092、MT0189的抑菌活性，試驗(yàn)結(jié)果顯示，抑菌活性同樣有所降低，符合此前得到的結(jié)論，說明缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域會(huì)降低c-di-GMP濃度，進(jìn)而抑制抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)2株同源重組菌株的抑菌活性比MT19強(qiáng)，推測(cè)可能是不同突變方式及位點(diǎn)導(dǎo)致的基因型存在內(nèi)在差異，因此在抑菌活性表型上也存在一定的差異。

另外，通過誘變熒光假單胞菌F113獲得缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域的WspR蛋白突變體，該突變體的運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)于野生型菌株，生物膜形成能力受到抑制。但在本次試驗(yàn)中，同源重組突變菌株MT5092、MT0189以及隨機(jī)突變株MT19的游泳運(yùn)動(dòng)、集群運(yùn)動(dòng)、抽搐運(yùn)動(dòng)等運(yùn)動(dòng)行為及生物被膜形成能力都有所下降，與其他菌株如鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）ATCC17978、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ATCC4356、普城沙雷氏菌（Serratia puccinia）G3、天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）等菌株相關(guān)試驗(yàn)中所得到的結(jié)果相符，卻與F113菌株的試驗(yàn)結(jié)論略有不同。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)2株同源重組菌株的運(yùn)動(dòng)能力比隨機(jī)突變株MT19強(qiáng)，且兩者同源重組菌株MT5092與MT0189之間也存在一定差異，推測(cè)同樣可能是基因位點(diǎn)不同導(dǎo)致的表達(dá)存在差異。

本試驗(yàn)主要通過對(duì)比3個(gè)缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域基因的突變株MT5092、MT0189、MT19與MS82野生型菌株對(duì)綠色木霉的抑菌能力、生物被膜形成能力、運(yùn)動(dòng)行為能力，發(fā)現(xiàn)缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域?qū)-di-GMP信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌抑菌物質(zhì)合成、生物被膜形成及運(yùn)動(dòng)能力存在抑制作用。為更深入地探索GGDEF結(jié)構(gòu)域?qū)-di-GMP調(diào)控生物被膜與運(yùn)動(dòng)性能力之間的關(guān)系，下一步將通過基因互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證突變菌株的抑菌活性、生物被膜形成及運(yùn)動(dòng)能力的變化驗(yàn)證其基因功能。

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