游智湧 劉博林 劉程 高燈州

關(guān)鍵詞：固氮過程;溫度敏感性;同位素示蹤;沉積物;長江口

0引言

河口近岸作為海陸交互的重要地帶，是生物地球化學(xué)循環(huán)的“熱區(qū)”.近幾十年來，人類活動加劇導(dǎo)致河口及近岸地區(qū)的活性氮輸入顯著增加，進(jìn)而引起富營養(yǎng)化和季節(jié)性缺氧等一系列環(huán)境問題.然而，除人為活性氮輸入外，生物固氮也可能是河口海岸生態(tài)系統(tǒng)氮負(fù)荷增強(qiáng)的潛在因素.因此，開展河口及近岸地區(qū)生物固氮研究，對認(rèn)識該區(qū)域氮素收支平衡及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要意義.

目前，國內(nèi)外學(xué)者對河口近岸水體或沉積物環(huán)境生物固氮過程已經(jīng)開展了大量的研究，證實(shí)了其在河口生態(tài)系統(tǒng)氮素平衡中扮演著重要的作用[1-3].研究指出，河口近岸生物固氮過程具有顯著的時空變異特征，其溫度、鹽度、pH值、氨氮、硝酸鹽、硫化氫和鐵等是影響固氮的主要環(huán)境因子.這些環(huán)境變量中，溫度是影響固氮微生物代謝的最基本因素之一.有研究表明，溫度可以通過改變固氮微生物的活性，進(jìn)而影響固氮酶來調(diào)控氮循環(huán)過程[4-5].在缺鐵的寡營養(yǎng)鹽海域中，溫度升高會緩解鐵限制的束毛藻活性，有利于提高束毛藻的固氮速率，進(jìn)而提高海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)力[6].相反，在溫度較低的情況下，微生物新陳代謝較慢，有機(jī)質(zhì)礦化消耗的溶解氧較少，局部生成非厭氧區(qū)而抑制厭氧性固氮微生物的活性[7].盡管當(dāng)前關(guān)于溫度對微生物固氮過程的影響研究已有一些報道，但其效應(yīng)仍未得到充分的認(rèn)識.溫度是衡量全球氣候變化最為關(guān)鍵的參數(shù)之一，其對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要的意義[8-9].河口及近岸地區(qū)微生物氮轉(zhuǎn)化過程是對溫度變化較為敏感的區(qū)域，但其固氮過程對溫度的響應(yīng)還有待深入認(rèn)識.因此，研究生物固氮過程的溫度敏感性對評估全球氣候變化背景下河口近岸地區(qū)生物氮輸入及平衡具有重要的意義.

長江口是世界范圍內(nèi)的富營養(yǎng)化河口之一，受高強(qiáng)度人類活動的影響，每年都有大量的活性氮被輸送到河口及其鄰近的沿海地區(qū)[10-12].基于此，我們選取長江口沉積物為研究對象，探究沉積物中固氮過程的溫度敏感性及影響因素.本研究有助于提高有關(guān)溫度變化對河口及沿海生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程影響機(jī)制的認(rèn)識，以期為河口近岸生態(tài)系統(tǒng)氮素平衡及其對氣候變化響應(yīng)的模擬提供科學(xué)參考.

1研究區(qū)概況與研究方法

1.1 研究區(qū)域

長江口（120°30′E～124°30′E，30°00′N～30°30′N）是我國第一大河口，面積約8500km2.長江口屬于典型亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，氣候溫和，四季分明.年溫度變化范圍為6.7～28.0℃，年平均溫為16℃.多年平均降水量在1144mm，主要集中在4—9月份[13].每年從流域接收數(shù)億噸懸沙和大量的污染物[14].此外，每年大量的無機(jī)氮（約1.1×106t）被排入長江口[15]，一定程度上加劇了水體富營養(yǎng)化、有害藻華爆發(fā)和大面積缺氧等生態(tài)環(huán)境問題[16].

1.2 樣品的采集

選取長江口內(nèi)4個采樣點(diǎn)，分別為瀏河口（LHK）、吳淞口（WSK）、白龍港（BLG）和崇明東灘（CMDT），兩個口外采樣點(diǎn)A1和A2（圖1）.分別于2020年8月和9月，利用柱狀采泥器采集每個站位點(diǎn)表層沉積物（0～5cm）和上覆水，并用便攜式水質(zhì)監(jiān)測儀測定上覆水溫度、pH值和鹽度.采集的沉積物裝入聚乙烯袋，放置于4℃保溫箱并帶回實(shí)驗(yàn)室.上覆水在實(shí)驗(yàn)室用0.22μm的濾膜過濾，用于溫度梯度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).沉積物樣品分成兩份，一份用于溫度梯度培養(yǎng)的泥漿實(shí)驗(yàn)，分析固氮速率;另外一份用于理化性質(zhì)測定.

1.3 理化性質(zhì)的分析

采用鄰菲羅啉比色法測定沉積物中的活性鐵.具體地，用1mol·L–1的鹽酸浸提，二價鐵（Fe2+）直接加入顯色劑顯色分析，總鐵（Fe）通過加入鹽酸羥胺將三價鐵（Fe3+）還原成Fe2+再進(jìn)行分析[17]，F(xiàn)e3+含量為總Fe和Fe2+的差值.沉積物中總有機(jī)碳（TOC），通過重鉻酸鉀-外加熱法測定，具體是稱取0.2g干土在170～180℃油浴中用0.8mol·L–1K2Cr2O7和濃硫酸各5mL消解5min.鄰菲羅啉為指示劑，以0.2mol·L–1硫酸亞鐵銨滴定過量的Cr5+，通過Fe2+的消耗量計(jì)算總有機(jī)碳[18].沉積物中氨氮（NH4+）和硝態(tài)氮（NO3–）利用2mol·L–1KCl浸提，并用連續(xù)流動元素分析儀（SANPlus，SkalarAnalyticalB.V.，theNetherlands）測定[19].沉積物中硫化物（S2–）先用1mol·L–1鹽酸浸提，再利用醋酸鋅吸收后基于亞甲基藍(lán)分光光度法測定[20].

1.4 固氮速率的測定

基于沉積物泥漿培養(yǎng)，結(jié)合氮?dú)馔凰兀?5N2）示蹤技術(shù)，測定潛在固氮速率.具體地，將沉積物和過濾的上覆水以質(zhì)量比為1∶7比例混合均勻，并在充滿氦氣的手套箱中用氦氣將泥漿曝氣30min以去除背景氮?dú)?隨后，將泥漿轉(zhuǎn)移到12mL頂空瓶中密封并原位溫度預(yù)培養(yǎng)24h.預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，為使微生物適應(yīng)設(shè)計(jì)溫度（5、10、15、20、25、30℃），在相應(yīng)的溫度條件下再進(jìn)行24h預(yù)培養(yǎng).然后，取一半數(shù)量的頂空瓶注入0.2mL飽和的ZnCl2溶液作為起始樣品.同時，另外一半數(shù)量的頂空瓶注射0.5mL15N2（99%15N;CamproScientific，Germany）作為終止樣品，充分震蕩之后分別在5、10、15、20、25、30℃條件下培養(yǎng)24h.培養(yǎng)結(jié)束后，將終止樣品注入0.2mL50%飽和的ZnCl2溶液結(jié)束培養(yǎng).整個培養(yǎng)過程產(chǎn)生的含15N產(chǎn)物用次溴酸鹽碘溶液氧化后，利用膜進(jìn)樣質(zhì)譜儀（MIMS）測定，并計(jì)算潛在固氮速率，公式為

式中：R表示固氮速率（nmol·g–1·h–1）;CInitial和CFinal分別表示起始和終止樣品中15N標(biāo)記的產(chǎn)物濃度（nmol·mL–1）;V表示培養(yǎng)泥漿的體積（mL）;W表示沉積物的干重（g）;T表示培養(yǎng)時間（h）.

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差（One-wayANOVA）分析不同培養(yǎng)溫度下固氮過程的差異性，采用LSD（leastsignificantdifferencetest）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用Peason相關(guān)分析揭示沉積物理化性質(zhì)與固氮速率的相關(guān)性.用Origin2021制圖.

2結(jié)果與分析

2.1 沉積物的理化性質(zhì)

各采樣點(diǎn)沉積物理化性質(zhì)如表1所示.采樣期間（8月份或9月份），長江口沉積物溫度范圍為20.5～30.8℃.沉積物鹽度和pH值分別介于0.15～31.68和7.62～8.40，其中長江口內(nèi)（LHK、WSK、BLG、CMDT）沉積物鹽度和pH值均顯著低于長江口外（A1和A2）.長江口內(nèi)沉積物硫化物濃度（0.08～1.22μmol·g–1）顯著低于長江口外沉積（3.31～6.48μmol·g–1），且在A2站點(diǎn)具有最高值.沉積物Fe2+和Fe3+濃度分別為1.51～3.10mg·g–1和0.88～1.35mg·g–1，其中，F(xiàn)e2+濃度在LHK最高，而Fe3+濃度在CMDT最高.沉積物NH4+和NO3–濃度范圍分別為3.35～188.96μg·g–1和1.73～24.81μg·g–1，其中，WSK的NH4+濃度最高，而CMDT的NO3–濃度最高.沉積物TOC濃度范圍為6.70～11.59mg·g–1，其中，A2樣點(diǎn)TOC含量最高，而CMDT最低.

2.2 不同溫度對固氮過程速率的影響

各站點(diǎn)原位固氮速率范圍為0.72～2.85nmol·g–1·h–1，具有顯著的空間變異性，LHK和A2站點(diǎn)固氮速率最高，而BLG固氮速率最低（表1）.不同培養(yǎng)溫度條件下各采樣點(diǎn)潛在固氮速率如圖2所示.在5、10、15、20、25、30℃培養(yǎng)條件下，沉積物固氮速率介于0.07～3.38nmol·g–1·h–1.LHK、WSK、BLG、CMDT、A1和A2固氮速率的均值分別為（1.07±0.28）、（1.92±0.88）、（0.83±0.29）、（0.94±0.43）、（1.11±0.29）和（1.35±0.95）nmol·g–1·h–1，其中，WSK樣點(diǎn)的平均固氮速率最大為（1.92±0.88）nmol·g–1·h–1，而樣點(diǎn)BLG的平均固氮速率最小為（0.83±0.29）nmol·g–1·h–1.

不同溫度培養(yǎng)下，沉積物固氮速率有所不同（圖2）.除CMDT外，各站位在20℃條件下具有最高固氮速率，而在10℃條件下具有最低固氮速率（除A2外）.總體而言，各采樣點(diǎn)沉積物潛在固氮過程速率對溫度變化的響應(yīng)相似（圖2）.具體看，5℃條件培養(yǎng)下的固氮速率均顯著高于10℃條件下的固氮速率.而后，隨著溫度的升高，固氮速率呈顯著的上升趨勢，并在20℃左右達(dá)到最高值.而當(dāng)溫度高于20℃時，隨溫度升高，固氮速率總體呈顯著下降趨勢.雖然各站點(diǎn)沉積物理化性質(zhì)差異較大，但其固氮過程速率對溫度變化的響應(yīng)總體是一致的.

2.3 沉積物固氮速率與理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系

如表2，在5℃條件下培養(yǎng)時，沉積物固氮速率與硫化物的含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（p<0.05）.當(dāng)溫度上升到10℃時，沉積物固氮速率與硫化物含量仍呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，但與硝酸鹽的含量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（p<0.05）.當(dāng)溫度達(dá)到15℃甚至更高時，溫度與理化參數(shù)無明顯的相關(guān)性.隨著溫度的升高，固氮速率與沉積物中氨氮和Fe3+的相關(guān)程度逐漸增加，但與TOC濃度和硫化物含量的相關(guān)關(guān)系則逐漸降低.除此之外，不同溫度條件下，沉積物的固氮速率與鹽度、pH值、Fe2+均無顯著相關(guān)關(guān)系.

3討論

3.1 長江口沉積物固氮過程的溫度敏感性

河口沉積物生物固氮過程在調(diào)節(jié)該生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)力中具有重要的作用，但也可能是氮負(fù)荷增強(qiáng)的主要途徑[21].固氮過程是將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨或者其他分子的過程，在這個過程中，溫度作為基礎(chǔ)影響參數(shù)扮演著非常重要的角色[22].本文研究發(fā)現(xiàn)，除CMTD樣點(diǎn)外，固氮速率隨溫度的升高總體表現(xiàn)為先降低（5到10℃），然后升高（10到20℃），再降低（20到30℃）的變化特征（圖2）.許多研究表明，硫酸鹽還原菌參與沉積物的固氮過程，Narrangaset沉積物中的nifH基因是從硫酸鹽還原菌中獲取的[8，23-24];而Brauer等[4]指出，短時間培養(yǎng)的硫酸鹽還原菌最適溫度為2～9℃.在低于10℃溫度條件下，隨著溫度增加，沉積物中硫酸鹽還原菌會加速硫酸鹽異化還原成硫化物，導(dǎo)致沉積物中硫化物大量堆積，在一定程度上會抑制固氮微生物的活性，進(jìn)而降低固氮速率[25].當(dāng)溫度介于10～20℃時，溫度增加對沉積物固氮過程具有顯著的促進(jìn)作用.Wang等[17]指出，溫度和有機(jī)質(zhì)是影響濕地沉積物固氮速率的主要環(huán)境因子.溫度升高可以加速有機(jī)質(zhì)的分解進(jìn)而降低氧氣可利用性含量，為固氮過程提供厭氧環(huán)境、電子受體和足夠的能量.前人研究報道指出，固氮菌最適溫度范圍介于15～20℃[26]，且溫度變化能夠影響固氮菌的菌群結(jié)構(gòu)和酶的活性[22].溫度增加能夠促進(jìn)沉積物中鐵的礦化，細(xì)胞會提高吸收固氮酶合成所需要鐵元素的效率，合成更多的固氮酶[6].在河口偏堿性環(huán)境中，活性鐵大多以二價鐵的形式存在，可與沉積物中硫化物結(jié)合形成FeS或者FeS2，進(jìn)而降低沉積物硫化物的生物毒性，并提高固氮速率.因此，在10～20℃培養(yǎng)溫度條件下，沉積物固氮速率隨著溫度的上升顯著變大（圖2）.當(dāng)溫度增加到一定程度后，固氮酶活性對溫度的依賴性逐漸由強(qiáng)變?nèi)酰瑴囟葘痰俾实挠绊懸仓饾u減弱.較高的呼吸速率需要為固氮酶提供非常低的氧水平，從而提高固氮過程所需的能量.同時，溫度的持續(xù)升高將促進(jìn)沉積物的礦化速率，沉積物釋放大量的NH4+會對固氮過程產(chǎn)生一定的抑制作用[27].本研究也顯示，當(dāng)溫度超過固氮過程的最適溫度時，固氮速率反而有所降低.然而，CMDT沉積物固氮速率在15℃培養(yǎng)條件下達(dá)到最高值，而后隨著溫度的升高其速率表現(xiàn)出下降趨勢.Knapp[28]提出，高濃度的無機(jī)氮會抑制固氮過程，主要是微生物直接從環(huán)境中吸收NH4+所需要的能量要比固氮過程的低.溫度升高，沉積物中高濃度的NO3–為DNRA提供豐富的底物，大量的NO3–轉(zhuǎn)化成NH4+[29]，而較高濃度的氨氮將會抑制固氮速率[28，30].CMDT沉積物中高濃度的硝酸鹽是導(dǎo)致固氮速率在15℃以上溫度時呈現(xiàn)下降趨勢的主要原因.

3.2 長江口沉積物固氮過程影響因素

沉積物微生物固氮過程受多個環(huán)境因子的影響，且不同溫度培養(yǎng)條件下的影響因素也具有一定的差異性.由表2可知，當(dāng)溫度高于25℃時，固氮速率與pH值有較大相關(guān)性.有研究報道指出，固氮菌最適合在接近中性的環(huán)境中生長[31-32].隨著溫度的升高，固氮速率與pH值的相關(guān)性增加，表明pH值可以通過調(diào)節(jié)固氮原核生物的新陳代謝過程而影響固氮速率.此外，鹽度可通過轉(zhuǎn)變固氮菌的結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)而影響固氮菌的新陳代謝[33].本研究中隨著溫度的增加，固氮速率與鹽度并沒有顯著的相關(guān)關(guān)系，這與不同固氮菌對于鹽度的敏感性不同有很大的關(guān)系.研究報道指出，Azotobacter固氮菌屬在有鹽或者海水的情況下將不會進(jìn)行固氮，而Clostridium的固氮過程受鹽度的影響不顯著[21].

從表2中可以看出，溫度較低時沉積物固氮速率與硫化物含量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，而隨著溫度的升高，相關(guān)關(guān)系逐漸降低.這主要是因?yàn)榱蛩猁}還原菌將硫酸鹽異化還原成硫化物的同時也參與了固氮過程[34].有研究表明，短時間培養(yǎng)時，硫酸鹽還原菌的最適溫度在2～9℃，超過最適溫度后硫酸鹽還原菌活性受到抑制[35]，是溫度升高硫化物與固氮速率的相關(guān)性減弱的重要原因之一.同時，我們觀察到沉積物中Fe2+和固氮速率具有顯著的相關(guān)關(guān)系.之前的研究也表明了鐵還原菌也能進(jìn)行固氮[36]，且沉積物鐵的可利用性取決于硫酸鹽異化還原的產(chǎn)物H2S和HS，其能與沉積物的Fe2+形成硫鐵礦（FeS2）[37].因此，隨著溫度增高，沉積物中可利用性Fe2+可以消耗硫酸鹽還原過程中產(chǎn)生的硫化物，從而間接提高固氮速率.

沉積物NH4+和NO3–受到多種過程的影響，其中徑流輸入影響最為重要[19，38].一些研究表明NH4+和NO3–會抑制固氮過程[39].Knapp[28]研究表明，該抑制效果是因?yàn)楣痰⑸飳2轉(zhuǎn)化成NH4+再吸收利用比直接從環(huán)境中吸收或者將NO3–異化還原成NH4+要消耗更多的能量.本研究也發(fā)現(xiàn)，在10℃培養(yǎng)條件下，固氮速率與NO3–呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（表2）.然而，一些研究表明，在NH4+濃度較高的環(huán)境下，固氮微生物會通過產(chǎn)生過量的電子來維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)而進(jìn)行固氮作用[40].除此之外，一些研究也表明，有機(jī)質(zhì)可利用性能夠緩解高濃度NH4+對固氮過程的抑制作用[41].隨著溫度的增加，NH4+濃度與固氮速率的相關(guān)關(guān)系逐漸變大（表2），其高呼吸速率局部耗盡NH4+是促進(jìn)固氮作用的重要因素.TOC對固氮過程有較大的影響[42]，其能為異養(yǎng)微生物提供能量[43].在5～10℃培養(yǎng)期間，微生物活性對于溫度的敏感性較強(qiáng).隨著溫度的升高，TOC的消耗為固氮過程提供大量的能量，而當(dāng)達(dá)到最適溫度甚至更高時，由于高溫會破壞固氮酶的活性從而導(dǎo)致固氮速率與TOC呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系.總體來看，硫化物、二價鐵、NO3–和TOC是固氮過程對溫度變化響應(yīng)的主要環(huán)境因子.

4結(jié)論

本文基于同位素示蹤技術(shù)，探討了長江口沉積物固氮過程速率對溫度變化的響應(yīng)，得出主要的結(jié)論如下：

（1）研究區(qū)域內(nèi)，原位溫度沉積物固氮速率變化范圍為0.83～2.85nmol·g–1·h–1，具有顯著的空間變異性.LHK和A2站點(diǎn)固氮速率最高，分別為2.14nmol·g–1·h–1和2.85nmol·g–1·h–1，而BLG速率最低為0.83nmol·g–1·h–1.

（2）各個站點(diǎn)不同溫度下固氮速率的變化范圍為0.07～3.38nmol·g–1·h–1，固氮速率對溫度的響應(yīng)規(guī)律大致一致.從5到30℃溫度變化范圍內(nèi)，固氮速率總體表現(xiàn)為先降低（5到10℃），后升高（10到20℃），再降低（20到30℃）的變化特征.

（3）硫化物、二價鐵、NO3-和TOC是調(diào)節(jié)長江口沉積物固氮作用對溫度敏感性的重要環(huán)境因子.