郭晶晶 孟超 劉茜

摘要：膽紅素是血紅蛋白的代謝產(chǎn)物，主要涉及肝臟代謝，血清膽紅素水平是肝膽疾病的重要診斷指標(biāo)。體內(nèi)的膽紅素包括直接膽紅素、間接膽紅素，二者之和稱為總膽紅素，臨床對(duì)膽紅素的生化檢測(cè)有多種方法，本文使用重氮鹽法和釩酸鹽法對(duì)血清總膽紅素進(jìn)行測(cè)定，比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度均能滿足臨床要求，釩酸鹽法的準(zhǔn)確度高于重氮鹽法。

關(guān)鍵詞：膽紅素代謝 ?膽紅素測(cè)定方法 ?重氮鹽法 ?釩酸鹽法 ?方法比較

肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)性器官，具有復(fù)雜而重要的生理功能，參與代謝是肝臟最主要的功能。肝臟參與三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過(guò)程：肝臟可以合成蛋白質(zhì)，亦可以分解蛋白質(zhì)。人體有超過(guò)40%的蛋白質(zhì)是在肝臟合成的，血漿白蛋白則完全由肝臟合成。肝臟細(xì)胞含有蛋白質(zhì)脫氨酶和轉(zhuǎn)氨酶，從而分解蛋白質(zhì)，氨進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成尿素排泄。人體攝入的糖類(lèi)在肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，?dāng)血糖濃度升高時(shí)，血糖可轉(zhuǎn)變成葡萄糖聚合物以糖原的形式貯存于肝臟，當(dāng)血糖濃度降低時(shí)，肝糖原可以迅速分解成葡萄糖，向人體供能，從而保持血糖的穩(wěn)定。當(dāng)人體攝入的糖類(lèi)物質(zhì)較少時(shí)，肝臟可以將氨基酸、丙酮酸等非糖類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成肝糖原，以滿足機(jī)體對(duì)葡萄糖的消耗。肝臟可以合成膽固醇，膽固醇轉(zhuǎn)變成膽汁酸鹽，膽汁酸鹽使脂肪乳化成微粒，脂肪微?？杀簧眢w吸收。脂類(lèi)物質(zhì)可直接與肝臟中的蛋白質(zhì)結(jié)合成脂蛋白。肝臟參與維生素的代謝。一些脂溶性維生素可長(zhǎng)期大量?jī)?chǔ)存于肝臟中，如維生素A、維生素D、維生素B12的儲(chǔ)存量可滿足幾個(gè)月甚至是一兩年的使用。肝臟中可形成有多種凝血因子，如凝血因子I。同時(shí)，肝臟可形成抗凝血因子，如肝素。因?yàn)楦闻K的體積大，可以貯存的血量多，因此肝臟也是主要的貯血器官[1]。肝臟是已知的最重要的解毒場(chǎng)所，內(nèi)源性毒物，如激素、血氨等，以及外源性毒物，如藥物、毒物等，均可在肝臟轉(zhuǎn)化，降低毒性或解毒后，隨尿液、膽汁等途徑排出體外。

肝臟的再生和代償能力很強(qiáng)，切除部分肝臟，肝功能不受影響，剩余肝細(xì)胞通過(guò)再生使肝臟恢復(fù)完整。但是肝臟也是很敏感和脆弱的，當(dāng)肝功能發(fā)生紊亂時(shí)，會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生各種影響，嚴(yán)重者可危害生命。已知多種物質(zhì)均可引起肝功能異常，如酒精、病毒、化學(xué)藥物和有毒物質(zhì)，肝細(xì)胞損傷后可產(chǎn)生各種肝臟疾病，包括酒精性肝病、慢性病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病等[2]。

血清生化檢查是臨床常用的肝功能檢測(cè)項(xiàng)目，包含多種檢測(cè)指標(biāo)，如反映肝細(xì)胞損傷的ALT、AST和GGT，反映肝臟合成功能的白蛋白、凝血酶原時(shí)間、肝纖維化的透明質(zhì)酸、IV型膠原，以及反映膽紅素代謝的總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素。通過(guò)分析生化指標(biāo)與正常值的偏離程度，有助于對(duì)肝臟相關(guān)疾病的鑒別診斷及治療藥物和方案的選擇等[3]。

膽紅素主要來(lái)源于衰老的紅細(xì)胞，其中的血紅蛋白代謝產(chǎn)生，此部分占膽紅素總量的80%左右，其余少量的膽紅素來(lái)源于其他含血紅素的蛋白，如肌紅蛋白、細(xì)胞色素P450等。血紅蛋白在組織蛋白酶的作用下，分解產(chǎn)生亞鐵血紅素，亞鐵血紅素經(jīng)微粒體酶等作用形成膽綠素，膽綠素經(jīng)膽綠素還原酶作用形成游離膽紅素[4]，即間接膽紅素。

肝臟是膽紅素主要代謝場(chǎng)所，膽紅素的代謝包含多個(gè)環(huán)節(jié)，即肝細(xì)胞對(duì)血液中膽紅素的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，間接膽紅素轉(zhuǎn)化為直接膽紅素，直接膽紅素經(jīng)膽汁排泄，這一系列的過(guò)程相互連接和影響，任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，均可導(dǎo)致膽紅素的代謝異常[5]。血清膽紅素水平反映了肝臟細(xì)胞對(duì)膽紅素?cái)z取、結(jié)合和排泄的能力。血清膽紅素包括總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素。當(dāng)肝功能受損時(shí)，肝臟對(duì)膽紅素的代謝能力下降，血清膽紅素濃度升高。臨床上將血清膽紅素水平作為肝膽疾病和溶血疾病鑒別診斷的重要指標(biāo)[6]。總膽紅素增高，同時(shí)直接膽紅素和間接膽紅素也增高，常見(jiàn)于肝細(xì)胞性黃疸，如急性黃疸型肝炎、重癥肝炎、慢活肝、肝硬化等疾病?？偰懠t素和直接膽紅素升高，常見(jiàn)于阻塞性黃疸，如膽道結(jié)石、膽道梗阻等疾病?？偰懠t素和間接膽紅素升高，常見(jiàn)于溶血性黃疸和遺傳性疾病[7]。

臨床對(duì)膽紅素的測(cè)定有多種方法，目前市面上常見(jiàn)的測(cè)定總膽紅素的試劑盒，主要包括兩種方法學(xué)，即重氮鹽法和釩酸鹽法。重氮鹽法是最早被發(fā)現(xiàn)使用的，且是全國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)推薦的方法，具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，線性范圍較寬，基本能滿足臨床使用需求，但是重氮法有其局限性，試劑穩(wěn)定性較低，受干擾因素多，溶血對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確度影響尤其嚴(yán)重。隨著技術(shù)的發(fā)展，多種膽紅素檢測(cè)方法被發(fā)現(xiàn)，釩酸鹽法是其中性能比較好且被普遍選擇的一種方法[8]。本文采用了同一家公司生產(chǎn)的兩種方法學(xué)的膽紅素測(cè)定試劑盒，對(duì)膽紅素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，以此分析兩種方法學(xué)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的：總膽紅素測(cè)定試劑盒（重氮鹽法）（批號(hào)：200326）及配套臨床化學(xué)校準(zhǔn)血清（批號(hào)：190201）和定值多項(xiàng)質(zhì)控血清（批號(hào)：190929）;總膽紅素測(cè)定試劑盒（釩酸鹽氧化法）（批號(hào)：200526）及配套臨床化學(xué)校準(zhǔn)血清（批號(hào)：190201）和定值多項(xiàng)質(zhì)控血清（批號(hào)：190929）。中國(guó)食品藥品檢定研究院研制的：總膽紅素冰凍人血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：360033-201901），水平1：（7.01±0.28）?mol/L和水平2：（27.10±0.54）?mol/L。

1.2 儀器

日立7180型全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 方法

重氮鹽法在7180上主要參數(shù)如下。主波長(zhǎng)：546 nm，副波長(zhǎng)：660 nm，試劑1量：160 ?L，試劑2量：40 ?L，樣品量：8 ?L，方法：2 point end。釩酸鹽法在7180上主要參數(shù)：主波長(zhǎng)：450 nm，副波長(zhǎng)：546 nm，試劑1量：224 ?L，試劑2量：56 ?L，樣品量：8 ?L，方法：2 point end。使用臨床化學(xué)校準(zhǔn)血清校準(zhǔn)儀器，測(cè)定定值多項(xiàng)質(zhì)控血清，質(zhì)控測(cè)定值符合要求后，測(cè)試樣本?？偰懠t素冰凍人血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品兩個(gè)濃度水平，避光恢復(fù)至室溫后，取適量用于測(cè)定，每個(gè)水平各測(cè)定10次。BE7B49A7-BB89-4384-B0BD-08972D762372

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

測(cè)定結(jié)果的平均值（X）與標(biāo)準(zhǔn)品靶值的相對(duì)偏差（RD），如表1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重氮鹽法測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品靶值的相對(duì)偏差均大于±10%，釩酸鹽法測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品靶值的相對(duì)偏差均小于±5%，說(shuō)明釩酸鹽法的準(zhǔn)確度更好。

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

測(cè)定結(jié)果的平均值（X）、變異系數(shù)（CV），如表2所示：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法測(cè)定的精密度良好，CV均小于10%，兩種方法測(cè)定水平2的CV均小于水平1，說(shuō)明高濃度樣本相對(duì)于低濃度樣本，受到的干擾更小，因此精密度更好。

3 討論

隨著科技的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，臨床檢測(cè)水平不斷提升，不僅是檢測(cè)儀器更加智能化、自動(dòng)化和高通量化，檢測(cè)試劑也逐步變得更為精準(zhǔn)、快捷、無(wú)毒和高效，同時(shí)為了適應(yīng)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)，試劑成本也需要不斷降低。

本次實(shí)驗(yàn)采用的是北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的兩種試劑盒。重氮鹽法的檢驗(yàn)原理為：在酸性條件下，膽紅素與重氮化二氯苯胺發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，生成有色偶氮化合物，其生成量與總膽紅素的濃度成正比，偶氮化合物在中性溶液中呈現(xiàn)紅色，在酸性和堿性溶液中呈現(xiàn)藍(lán)色[9]。釩酸鹽法的檢驗(yàn)原理為：在pH值為3的條件下，界面活性劑與釩酸作用，將樣本中的總膽紅素氧化成膽綠素，由此測(cè)定釩酸作用前后的吸光度差，并與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，從而計(jì)算出樣本中膽紅素的濃度[10]。

本次實(shí)驗(yàn)分別用重氮鹽法和釩酸鹽法對(duì)血清總膽紅素進(jìn)行了準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)。

準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)濃度水平的樣本測(cè)量中，重氮鹽法測(cè)定結(jié)果與樣本靶值的相對(duì)偏差均大于10%，但是小于15%，釩酸鹽法測(cè)定結(jié)果與樣本靶值的相對(duì)偏差均小于5%，說(shuō)明釩酸鹽法的準(zhǔn)確度高于重氮鹽法，能更好地適用于臨床使用。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)均小于10%;兩個(gè)濃度水平的樣本測(cè)量中，重氮鹽法的變異系數(shù)均小于釩酸鹽法;兩個(gè)濃度水平的樣本測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較，高濃度樣本的變異系數(shù)均小于低濃度樣本。說(shuō)明兩種方法的精密度良好，均能滿足臨床試驗(yàn)的要求，重氮鹽法的精密度高于釩酸鹽法，高濃度樣本的精密度高于低濃度樣本。

重氮鹽法在測(cè)定臨床樣本時(shí)，受到的干擾因素較多，如溶血、脂血、黃疸等因素對(duì)測(cè)定結(jié)果影響大[11]，因此臨床使用范圍較窄。釩酸鹽法不受樣本溶血、脂血因素的影響，因此臨床使用范圍廣，且測(cè)定結(jié)果更能反映真實(shí)的濃度。重氮鹽法試劑長(zhǎng)期穩(wěn)定性較差，已知北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的兩種試劑盒均使用疊氮鈉作為防腐劑，而疊氮鈉可能破壞偶氮試劑，從而影響重氮反應(yīng)[12]，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)偏離真實(shí)值。釩酸鹽法的試劑更穩(wěn)定，且雙試劑可直接使用，操作簡(jiǎn)單，適合臨床上全自動(dòng)生化分析儀的操作。北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的兩種試劑盒，重氮鹽法的線性區(qū)間為3.0～513.0 ?mol/L，釩酸鹽法的線性區(qū)間為3.0～684.0 ?mol/L，可知釩酸鹽法的線性范圍更廣，臨床適用范圍廣泛。

4 結(jié)語(yǔ)

肝臟是人體重要的器官，參與人體多種物質(zhì)的代謝，包括三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝，同時(shí)肝臟是人體最重要的解毒器官，內(nèi)源性和外源性毒物均需要在肝臟代謝轉(zhuǎn)化成無(wú)毒物質(zhì)后排泄。如果肝臟出現(xiàn)問(wèn)題，肝臟所參與的各種物質(zhì)的代謝過(guò)程均可能出現(xiàn)紊亂，從而對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，甚至危及生命。臨床對(duì)肝功能評(píng)價(jià)包括多種指標(biāo)，主要是血清生化檢測(cè)指標(biāo)，其中檢測(cè)膽紅素水平可反映肝臟對(duì)膽紅素代謝的能力。人體內(nèi)膽紅素有兩種存在形式，即直接膽紅素和間接膽紅素，二者之和為總膽紅素。肝臟是膽紅素的主要代謝場(chǎng)所，包括肝細(xì)胞對(duì)膽紅素的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄等一系列的過(guò)程。當(dāng)肝功能受損時(shí)，肝臟對(duì)膽紅素的代謝能力下降，血清中膽紅素水平升高。臨床對(duì)膽紅素測(cè)定有多種方法，其中重氮鹽法是最早被發(fā)現(xiàn)使用的，但是其受溶血等影響較大，線性范圍較窄，且試劑穩(wěn)定性較差，臨床使用具有一定的局限性。隨著技術(shù)的發(fā)展，多種膽紅素檢測(cè)方法被發(fā)現(xiàn)，其中釩酸鹽氧化法因具有多種的優(yōu)越性而被普遍接受。本文對(duì)重氮鹽法和釩酸鹽氧化法檢測(cè)血清總膽紅素進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法均具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，其中釩酸鹽氧化法的準(zhǔn)確度高于重氮鹽法。

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