王進(jìn)華, 柏彬彬, 鄧婉菲, 鄒婷, 應(yīng)雪萍

溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,溫州 325035

近年來,由于工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展,重金屬污染已逐漸成為海洋污染的主要污染源之一[1]。重金屬污染來源廣、毒性高,不能在物質(zhì)循環(huán)和能量交換中降解,并且會通過食物鏈在生物體中富集[1-2],對生物體造成巨大的損傷作用。 鎘(Cd)是一種較為常見的有毒重金屬,在人體內(nèi)的半衰期長達(dá)10 ~30 a,極易在體內(nèi)積蓄并對細(xì)胞、組織和器官產(chǎn)生毒性效應(yīng)[3]。 Cd 等重金屬可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)。 ROS 可以和生物體內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)反應(yīng),致使膜出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基化(PCO)和 DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)率升高[4],引發(fā)細(xì)胞凋亡甚至癌變[5-6]。 但生物體在進(jìn)化過程中形成了有效的抗氧化防御系統(tǒng),該防御系統(tǒng)由低分子量化合物(維生素 A、C、E、尿酸等)、抗氧化酶及非酶抗氧化物等組成。 機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx),其中SOD 能將超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫(H2O2),CAT 催化H2O2產(chǎn)生分子氧和水,而GPx 催化谷胱甘肽(GSH)使有毒的過氧化氫還原成無毒的羥基化合物,能有效地清除自由基并降低氧化損傷[7-8]。 但過量的ROS 超過了機(jī)體的抗氧化能力時,將會破壞抗氧化酶的功能[8]。Na+-K+ATP 酶和Ca2+-Mg2+ATP 酶是廣泛存在于生物膜上的酶,對維持細(xì)胞的正常生命活動具有積極作用。 ATP 酶既可以作為酶催化ATP 釋放大量能量供應(yīng)機(jī)體代謝所需,也可以作為載體運(yùn)輸細(xì)胞所需的物質(zhì)[9]。 研究表明,過量的ROS 會破壞機(jī)體內(nèi)ATP 酶系統(tǒng),Na+-K+ATP 酶和 Ca2+-Mg2+ATP 酶的損傷可能會導(dǎo)致離子失衡和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的蓄積[10]。 金屬硫蛋白(MT)是富含半胱氨酸的非酶抗氧化劑,能夠結(jié)合金屬離子來減緩自由基的產(chǎn)生,直接參與抗氧化防御反應(yīng),以保護(hù)細(xì)胞免受重金屬的毒害作用[11]。

軟體動物是水生生態(tài)系統(tǒng)中的主要組成成分,可通過攝食、呼吸和體表滲透等方式富集水體環(huán)境中的Cd[12-13]。 雙殼類軟體動物由于其埋棲和濾食的生活方式,對重金屬十分敏感,故在水生毒理學(xué)研究及評價上具有重要的意義。 而作為呼吸器官的鰓直接與水體長期接觸,Cd 等重金屬易在鰓中富集并對其產(chǎn)生氧化損傷效應(yīng)[14]。 有研究表明,鰓比其他器官更易受到重金屬的污染,可作為環(huán)境中重金屬污染的指示組織[13,15]。 文蛤(Meretrix meretrix)隸屬于雙殼綱(Bivalvia)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤?qū)?Meretrix),具有較高的營養(yǎng)及生態(tài)價值,是我國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖種類之一,文蛤已逐漸被用于水環(huán)境中重金屬污染的指示生物[16-17]。 有研究報道,Cd 等重金屬對文蛤具有很強(qiáng)的毒性效應(yīng),如能抑制文蛤性腺抗氧化酶的活性,并導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化[18],能誘導(dǎo)幼體酶活性和抗氧化能力下降[19],高濃度Cd2+會顯著誘導(dǎo)肝胰腺細(xì)胞凋亡[7]。 我們的前期研究發(fā)現(xiàn),文蛤鰓對Cd2+的富集顯著高于肝胰腺、足和外套膜[15],但Cd2+對文蛤鰓造成的氧化損傷、對抗氧化生物標(biāo)志物的影響以及凋亡機(jī)制尚不清楚。 故本研究以文蛤為研究對象,旨在探討急性Cd2+暴露對文蛤鰓組織的毒理效應(yīng),并探討抗氧化生物標(biāo)志物在Cd2+誘導(dǎo)文蛤鰓細(xì)胞凋亡中的響應(yīng)情況。 該研究結(jié)果可以讓我們更好地了解文蛤等雙殼類動物的抗氧化防御系統(tǒng)是如何應(yīng)對Cd2+的毒性效應(yīng),為進(jìn)一步研究文蛤鰓細(xì)胞凋亡機(jī)制提供理論基礎(chǔ);同時為水生環(huán)境中Cd2+污染檢測生化標(biāo)志物的篩選提供了潛在的應(yīng)用前景。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)(AR,≥99%)購自天聯(lián)精細(xì)化工有限公司。 KCl(AR,99.5%)、HCl(36% ~38%)、無水乙醇(AR,≥99.7%)、乙酸乙酯(AR,99.9%)和三氯乙酸(AR,99%)購自浙江中星化工試劑有限公司。 蛋白酶 K 溶液(20 mg·mL-1)、鹽酸胍(99%)和硫酸鏈霉素(98%)均購自麥克林公司。 三羥甲基氨基甲烷(Tris,99.9%)、2,4-二硝基苯肼(DNPH,98%)和十二烷基硫酸鈉(SDS,95%)均購自Solarbio 公司。 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染料購自南京基根生物技術(shù)有限公司。 DNA 提取測定試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司。 SOD、CAT、GPx、ROS、總抗氧化能力(T-AOC)、Na+-K+ATP、Ca2+-Mg2+ATP 和總ATP 酶試劑盒均購自南京建成生物公司。 DNA marker 和 PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒均購自 Takara 公司。 AccuPower 2X Greenstar qPCR Master Mix 試劑盒購自 Bioneer 公司,UNIQ-10 柱式Tizol 總RNA 提取試劑盒購自生工股份有限公司。

1.2 動物處理

實驗所用的文蛤購自浙江省靈昆養(yǎng)殖場,殼長(52.72±2.20) mm,殼寬(26.95±1.26) mm,殼高(43.41±1.88)mm,體質(zhì)量(39.06±4.81)g。 文蛤養(yǎng)殖場的海水和沉積物中 Cd 含量分別為0.54 μg·L-1和0.89 mg·kg-1。 將文蛤放置在6個裝有10 L 15‰人工海水的養(yǎng)殖缸(67 cm×46 cm×36.5 cm)中適應(yīng)養(yǎng)殖2 d,溫度為(22±1) ℃,pH 為 7.9。 根據(jù) Cd2+對文蛤 96 h LC50(15.01 mg·L-1)[7]的 1/10、1/5、1/2.5 和 1/1.25 設(shè)置 Cd2+的染毒濃度分別為 0、1.5、3、6 和 12 mg·L-1。各濃度組均設(shè)3個平行樣,共15個養(yǎng)殖缸,每個養(yǎng)殖缸分別加入不同濃度的Cd2+溶液5.5 L,大小相近的625 只文蛤平均放入15個裝有不同濃度Cd2+溶液的養(yǎng)殖缸中,24 h 更換新鮮的不同濃度Cd2+溶液,期間不喂食。 染毒5 d 后于冰上取文蛤鰓組織,立即放入液氮冷凍,然后置于-80 ℃冰箱中備用,用于各指標(biāo)的測定。

1.3 鰓細(xì)胞氧化損傷和凋亡檢測

1.3.1 AO/EB 雙熒光檢測鰓細(xì)胞凋亡

按照Ribble 等[20]描述的方法以及AO/EB 試劑盒中的相關(guān)說明對鰓細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。 取不同Cd2+濃度組的鰓組織各50 mg,在預(yù)冷的1% PBS(pH=7.2)中制備細(xì)胞懸液,取制備好的細(xì)胞懸液各25 μL 與 1 μL AO/EB 水溶液混合并孵育 5 min,用熒光顯微鏡(尼康Ti-s,日本)觀察并拍照。

1.3.2 DNA 片段檢測鰓細(xì)胞凋亡

取不同Cd2+濃度組的鰓組織50 mg 至裝有500 μL 生理鹽水的離心管中,在冰上充分研磨成懸浮液,并在 11 200 r·min-1(4 ℃)下離心 1 min。 除去上清液,將沉淀物用于DNA 片段的提取。 根據(jù)DNA提取試劑盒說明書的相關(guān)要求和步驟提取DNA。將 DNA 樣品混合物(8 μL DNA 提取物,3 μL 溴酚藍(lán))添加到每個泳道中,泳道中有含1%瓊脂糖凝膠(包含 0.1 mg·mL-1溴化乙錠)的 0.5×TBE 緩沖液,并于58 V 進(jìn)行電泳1 h。 用Gel Doc 2000 凝膠成像系統(tǒng)(Tanon,上海,中國)在紫外線下對所得的條帶進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.3 蛋白質(zhì)羰基(PCO)含量檢測

取不同濃度Cd2+溶液染毒后的鰓組織50 mg,加入9 倍體積的HEPES 緩沖液進(jìn)行研磨,勻漿液于3 000 r·min-1下離心 10 min,取 200 μL 上清液,加入9 倍體積的10%硫酸鏈霉素溶液,室溫放置10 min,然后取樣品各100 μL,分別加入2 mol·L-1HCl溶液400 μL 作為對照管以及 400 μL DNPH 溶液作為測定管,在黑暗中反應(yīng)1 h,每10 min 搖勻一次。再在對照管和測定管中加入500 μL 的20% 三氯乙酸(TCA)溶液,離心 15 min(4 ℃、12 000 r·min-1)后棄上清,沉淀物加乙醇-乙酸乙酯溶液(V(無水乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1 ∶1)1 mL 洗滌并離心 10 min(4 ℃ 、12 000 r·min-1),重復(fù) 3 次后加鹽酸胍 1 mL 溶解沉淀,37 ℃水浴15 min 后再離心15 min(4 ℃、12 000 r·min-1),取上清液用分光光度計于370 nm 波長處測 OD 值。

1.3.4 DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率(DPC)檢測

參照Xie 等[21]的方法進(jìn)行DPC 檢測,即取不同濃度Cd2+溶液染毒后的鰓組織0.1 g,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1 ∶9 的比例加入 9 倍 PBS 緩沖液進(jìn)行研磨,得10%的組織勻漿液。 取500 μL 勻漿液于離心管中,加入500 μL SDS 溶液進(jìn)行輕微振蕩,65 ℃水浴 10 min 后加 100 μL Tris-HCl-KCl 液,移液槍吹打 8 次。 冰上驟冷樣品 5 min,4 ℃ 下 12 000 r·min-1離心10 min(以下離心條件相同),收集上清液于另一離心管。 向沉淀中加入1 mL 緩沖液重懸65℃水浴10 min,冰上驟冷5 min 后離心,將上清液轉(zhuǎn)入上述離心管中(此步驟重復(fù)3 次)。 將終沉淀重懸于 500 μL 清洗緩沖液中,加 500 μL 蛋白酶 K,50℃消化3 h,冰上驟冷5 min 后離心,收集上清消化液于另一離心管中。 上清液和消化液各取100 μL于酶標(biāo)板,分別加入100 μL 熒光染料后置于暗處反應(yīng)30 min。 用多功能酶標(biāo)儀(Biotek Epoch,USA)(Ex=350 nm,Em=460 nm)測定待測樣品熒光強(qiáng)度。

1.3.5 ROS 和 T-AOC 測定

ROS 測定:取不同濃度Cd2+溶液染毒后的新鮮鰓組織0.1 g,剪碎放在200 目尼龍網(wǎng)上,并將網(wǎng)扎在小燒杯上,用眼科鑷邊搓邊用PBS 沖洗,將組織搓完,加 PBS 至 2 000 μL,用 300 目尼龍網(wǎng)過濾,取800 μL 于 1.5 mL 離心管,4 ℃下 3 000 r·min-1離心10 min,棄上清。 加 400 μL 熒光染料 DCFH-DA 混勻后37 ℃水浴孵育1 h,每3 ~5 min 顛倒混勻;孵育1 h 后,在離心管中加入 800 μL PBS 在 4 ℃下3 000 r·min-1離心 5 min 后棄上清液,重復(fù)操作 2 次后加 1 mL PBS 混勻。 取 200 μL 待測樣品于 96 孔板,用酶標(biāo)儀(Biotek Epoch, USA)(Ex=488,Em=525)測熒光強(qiáng)度。

T-AOC 檢測:稱取文蛤鰓組織0.1 g,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1 ∶9,加入 9 倍生理鹽水,冰浴機(jī)械勻漿,制備10%的組織勻漿,4 ℃、2 500 r·min-1,離心10 min,取上清液。 按照南京建成提供的T-AOC 試劑盒使用說明進(jìn)行操作,用多功能酶標(biāo)儀(Biotek Epoch, USA)對其進(jìn)行檢測。

1.4 抗氧化生物標(biāo)志物的測定

1.4.1 氧化應(yīng)激酶活性測定

樣本前處理:稱取文蛤鰓組織0.1 g,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1 ∶9,加入9 倍生理鹽水,冰浴機(jī)械勻漿,制備10%的組織勻漿,4 ℃、2 500 r·min-1,離心10 min,取上清液用于氧化應(yīng)激酶活性的測定。 SOD、CAT、GPx、Na+-K+ATP、Ca2+-Mg2+ATP 和總 ATP 酶活性的測定均按照南京建成提供的試劑盒使用說明進(jìn)行。 酶活性單位采用U·mg-1表示。

1.4.2MTmRNA 表達(dá)量測定

用UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒對鰓組織總RNA 進(jìn)行抽提,凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量,紫外分光光度法測定RNA 含量。 以文蛤鰓總RNA 為模板,使用 PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒將總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫已公布的文蛤金屬硫蛋白MT-1基因序列(GenBank:GU233466)[19]設(shè)計文蛤MT特異性引物。 以文蛤鰓cDNA 為模板,以文蛤MT引物為特異性引物,β-actin 引物作為內(nèi)參,使用Roche LC480 熒光定量 PCR 儀和 AccuPower 2X Greenstar qPCR Master Mix 試劑盒對鰓組織中MTmRNA 表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。 PCR 條件如下:95℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72℃延伸20 s,共40個循環(huán)。 同時設(shè)置陰性對照,反應(yīng)體系中不加入cDNA,總體積為20 μL 不變。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗所得的數(shù)據(jù)均用SPSS 25 軟件進(jìn)行分析,用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和LSD 檢測差異顯著性,用OriginPro 9.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)圖形的繪制。 數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示,P＜0.05 即為差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 文蛤鰓細(xì)胞AO/EB 熒光顯微觀察

如圖1 所示,對照組及1.5 mg·L-1Cd2+處理組的鰓細(xì)胞形態(tài)圓潤無褶皺,綠色熒光著色均勻,表明細(xì)胞無明顯凋亡現(xiàn)象(圖1(a)~(b))。 隨Cd2+濃度的升高,呈橙黃色和紅色熒光的細(xì)胞逐漸增多,說明細(xì)胞正常的生理結(jié)構(gòu)有破損,并開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象(圖1(c)~(e))。 3 mg·L-1Cd2+實驗組中,部分鰓細(xì)胞出現(xiàn)橘黃色熒光,呈綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量變少(圖1(c))。 較高 Cd2+濃度組(6 ~12 mg·L-1)的鰓細(xì)胞形態(tài)異常,細(xì)胞核皺縮,個別細(xì)胞呈現(xiàn)“新月形”,且以橙黃色和紅色熒光細(xì)胞為主(圖1(d)~(e))。 由此可見,隨著Cd2+濃度的加大,細(xì)胞凋亡逐漸增強(qiáng)。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢驗文蛤鰓細(xì)胞DNA 完整性

對照組、1.5 mg·L-1和 3 mg·L-1Cd2+濃度組的文蛤鰓細(xì)胞無明顯的梯形條帶出現(xiàn)(圖1(f) g ~i),說明細(xì)胞DNA 相對完好;隨Cd2+染毒濃度的增加(6 mg·L-1和12 mg·L-1Cd2+),文蛤鰓細(xì)胞DNA 梯狀斷裂條帶逐漸明顯,每個條帶的間隔約200 bp(圖1(f) j~k),說明隨著Cd2+濃度的增加細(xì)胞凋亡程度不斷加劇。

圖1 不同濃度Cd2+染毒組文蛤鰓細(xì)胞AO/EB 和DNA Ladder 檢測圖注:(a)~(e) AO/EB 圖,(f) 凝膠電泳圖;(a)0 mg·L-1,(b)1.5 mg·L-1,(c)3 mg·L-1,(d)6 mg·L-1,(e)12 mg·L-1,(f) m 表示 marker,g 表示 0 mg·L-1,h 表示 1.5 mg·L-1,i 表示 3 mg·L-1,j 表示 6 mg·L-1,k 表示 12 mg·L-1。Fig.1 AO/EB fluorescence microscopy analysis and DNA fragmentation in the gill of M. meretrix exposed to different Cd2+ concentrationsNote: (a)~(e) AO/EB fluorescence microscopy analysis, (f) Gel electrophoresis image; (a)0 mg·L-1,(b)1.5 mg·L-1, (c)3 mg·L-1, (d)6 mg·L-1, (e)12 mg·L-1, (f) m represents marker, g represents 0 mg·L-1,h represents 1.5 mg·L-1, i represents 3 mg·L-1, j represents 6 mg·L-1, and k represents 12 mg·L-1.

2.3 Cd2+對文蛤鰓DPC 和PCO 水平的影響

文蛤鰓DPC 和PCO 水平均隨Cd2+濃度上升而上升,在12 mg·L-1Cd2+濃度組中達(dá)到最大值,呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖2)。 對照組的 DPC 水平與各Cd2+濃度組均有顯著差異(P＜0.05),但1.5 mg·L-1和3 mg·L-1Cd2+濃度組差異不顯著(P＞0.05)(圖2 黑色柱子)。 而文蛤鰓中PCO 水平在對照組和各Cd2+濃度組均有顯著差異(P＜0.05) (圖2 白色柱子)。

圖2 Cd2+對文蛤鰓DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)率(DPC)和蛋白質(zhì)羰基(PCO)水平的影響注:不同字母表示有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),n=6;下同。Fig.2 Effect of Cd2+ on DNA-protein crosslinks (DPC)and protein carbonyl (PCO) level of M. meretrix gillsNote: The different letters indicate significant differences among groups (P＜0.05), n=6; the same below.

2.4 Cd2+對文蛤鰓T-AOC 和ROS 水平的影響

隨著Cd2+濃度的上升,ROS 水平不斷上升,在12 mg·L-1Cd2+濃度組達(dá)到最大值。 對照組文蛤鰓中ROS 含量除與1.5 mg·L-1Cd2+處理組無顯著差異外(P＞0.05),與其他Cd2+濃度組均有顯著差異(P＜0.05)(圖 3 黑色柱子)。 T-AOC 水平隨 Cd2+濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在1.5 mg·L-1Cd2+濃度組達(dá)最高水平,且與對照組及其他Cd2+濃度組均有顯著差異;12 mg·L-1Cd2+濃度組達(dá)最低水平且與對照組及其他實驗組均差異顯著(P＜0.05),但對照組、3 mg·L-1Cd2+及 6 mg·L-1Cd2+濃度組間無顯著差異(圖 3 白色柱子)。

圖3 Cd2+對文蛤鰓總抗氧化能力(T-AOC)和活性氧(ROS)水平的影響Fig.3 Effect of Cd2+ on total antioxidant capacity (T-AOC)and reactive oxygen species (ROS) level of M. meretrix gills

2.5 Cd2+對文蛤鰓抗氧化酶活性的影響

如圖4 ~6 所示,文蛤鰓抗氧化酶(SOD、CAT 和GPx)活性隨著Cd2+濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢。 SOD 和 CAT 活性均在 1.5 mg·L-1Cd2+濃度達(dá)最大值,與對照組和其他Cd2+濃度組均差異顯著(P＜0.05)。 對照組的 SOD 活性與 3 mg·L-1和 6 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異(P＞0.05),12 mg·L-1濃度組SOD 活性最小,與對照組及其他各Cd2+濃度組均有顯著差異(P＜0.05) (圖 4)。 對照組的 CAT 活性除與12 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異外,與其他各組均差異顯著(P＜0.05) (圖 5)。 對照組 GPx 活性與其他各組均無顯著差異(圖6)。

圖4 Cd2+對文蛤鰓超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.4 Effect of Cd2+ on superoxide dismutase (SOD)activity of M. meretrix gills

圖5 Cd2+對文蛤鰓過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig.5 Effect of Cd2+ on catalase (CAT)activity of M. meretrix gills

圖6 Cd2+對文蛤鰓谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性的影響Fig.6 Effect of Cd2+ on glutathione peroxidase (GPx)activity of M. meretrix gills

2.6 Cd2+對文蛤鰓ATP 酶活性的影響

ATP 酶活性隨Cd2+染毒濃度的增加呈現(xiàn)明顯的抑制狀態(tài),對照組ATP 酶活性與1.5 mg·L-1和3 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異,但 12 mg·L-1Cd2+濃度組的ATP 酶活性顯著低于對照組及其他染毒組(P＜0.05)(圖7 ~ 圖9)。 Na+-K+ATP 酶活性在6 mg·L-1和12 mg·L-1Cd2+濃度組顯著低于對照組,且與其他各組均有顯著差異(P＜0.05) (圖 7)。 Ca2+-Mg2+ATP 酶活性在 12 mg·L-1與6 mg·L-1Cd2+濃度組間無顯著差異(圖8)。 6 mg·L-1和12 mg·L-1Cd2+濃度組的T-ATP 酶活性顯著低于對照組,且與其他各組均有顯著差異(P＜0.05) (圖9)。

圖7 Cd2+對文蛤鰓Na+-K+ATP 酶活性的影響Fig.7 Effect of Cd2+ on Na+-K+ATPase activity of M. meretrix gills

圖8 Cd2+對文蛤鰓Ca2+-Mg2+ATP 酶活性的影響Fig.8 Effect of Cd2+ on Ca2+-Mg2+ATPase activity of M. meretrix gills

圖9 Cd2+對文蛤鰓總ATP 酶活性的影響Fig.9 Effect of Cd2+ on total ATPase (T-ATPase)activity of M. meretrix gills

2.7 Cd2+對文蛤鰓MT mRNA 表達(dá)量的影響

文蛤鰓MTmRNA 的表達(dá)量隨Cd2+染毒濃度增大出現(xiàn)先增后減的趨勢(圖10)。 1.5 mg·L-1Cd2+濃度組MTmRNA 的表達(dá)量最大,除與3 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異外,與其他各組均差異顯著(P＜0.05);但對照組與12 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異(P＞0.05)。

圖10 Cd2+對文蛤鰓MT mRNA 表達(dá)量的影響Fig.10 Effect of Cd2+ on MT mRNA expression of M. meretrix gills

3 討論(Discussion)

3.1 Cd2+對水生動物的氧化損傷和細(xì)胞凋亡效應(yīng)

3.2 Cd2+脅迫下氧化應(yīng)激酶和金屬硫蛋白mRNA(MT mRNA)的作用特點(diǎn)

SOD、CAT 和GPx 等抗氧化酶的活性變化可作為檢驗環(huán)境中重金屬污染的生化標(biāo)志物,這些酶活性的降低會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷[29-30]。 Cd2+可通過結(jié)合抗氧化酶的活性位點(diǎn)來改變酶的空間結(jié)構(gòu),使得其活性下降,導(dǎo)致機(jī)體清除ROS 的能力下降[19,31]。 文蛤鰓 SOD 和 CAT 的活性隨著 Cd2+濃度的增加呈先上升后下降趨勢,均在1.5 mg·L-1濃度組達(dá)到最大值(圖4 ~圖6),說明較低Cd2+濃度下(0~1.5 mg·L-1)SOD 和CAT 的誘導(dǎo)可能是機(jī)體應(yīng)對外來重金屬的防御反應(yīng)機(jī)制。 邢慧芳等[32]和于慶云等[33]分別研究了重金屬對無齒蚌(A. woodiana woodiana)和菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)抗氧化酶的影響,也得出相似的結(jié)果。 這可能是在較低濃度Cd2+脅迫下,機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生少量的作為底物誘導(dǎo)SOD 的表達(dá);但較高濃度的Cd2+(3 ~12 mg·L-1)可置換SOD 活性中心中的必需金屬并與其結(jié)合導(dǎo)致其酶活性降低,這與前人對文蛤(M. meretrix)幼體[19]、斑馬魚(Danio rerio)[22]和海洋纖毛蟲(Euplotes crassus)[34]的研究結(jié)果一致。 同時,低濃度Cd2+誘導(dǎo)下機(jī)體中SOD 酶活性增加會催化產(chǎn)生大量的H2O2,過多的H2O2刺激CAT 或通過線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的GPx 將其分解轉(zhuǎn)化為無毒的O2和H2O,但隨著Cd2+濃度的增加會產(chǎn)生過量的H2O2使得機(jī)體內(nèi)的CAT 和GPx 酶過度消耗,從而出現(xiàn)CAT 和GPx 酶活性下降的趨勢[15,18,30,35]。

ATP 酶是不可或缺的膜蛋白,能介導(dǎo)Na+、K+和Ca2+等離子在細(xì)胞中進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[36];并能調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓和膜通透性,金屬離子可與ATP 酶的半胱氨酸巰基(—SH)作用來改變蛋白質(zhì)功能[37]。 ATP 酶的活性取決于其與富含多不飽和脂肪酸(PUFA)的磷脂的相互作用[38]。 有研究表明,Na+-K+ATP 酶和Ca2+-Mg2+ATP 酶可作為器官功能的生物標(biāo)記物[39]。Abdulkareem 等[10]發(fā)現(xiàn)污水能顯著降低小鼠(Mus musculus)心臟Na+-K+ATP 酶活性,并略微降低小鼠心臟Ca2+-Mg2+ATP 酶活性。 Wang 和 Horisberger[40]認(rèn)為Hg2+與Na+-K+ATP 酶的半胱氨酸殘基結(jié)合是Hg 抑制 Na+-K+ATP 酶的機(jī)制之一。 Pivovarova 和Lagerspetz[41]認(rèn)為二價重金屬陽離子可能通過與Ca2+位點(diǎn)或Mg2+位點(diǎn)結(jié)合而抑制Ca2+-Mg2+ATP 酶活性。 文蛤鰓細(xì)胞 Na+-K+ATP 酶、Ca2+-Mg2+ATP酶、總 ATP 酶活性均與 Cd2+濃度(0 ~12 mg·L-1)呈負(fù)相關(guān)(圖7 ~圖9),說明Cd2+可能與ATP 酶的半胱氨酸巰基(—SH)或離子結(jié)合,從而影響其氧化應(yīng)激功能。 吳眾望等[42]對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的研究表明,在較低重金屬濃度處理時,鰓短時間內(nèi)表現(xiàn)為促進(jìn)作用,而較高濃度下為顯著性抑制。 但本研究發(fā)現(xiàn)較低Cd2+濃度(1.5 ~3 mg·L-1)對文蛤鰓ATP 酶影響不大,與對照組無顯著差異;但較高 Cd2+濃度(6 ~12 mg·L-1)文蛤鰓中 ATP 酶活性顯著下降。 McGeer 等[43]認(rèn)為虹鱒(Oncorhynchus mykiss)長時間暴露于低濃度Cu2+時,鰓絲Na+-K+ATP 酶活性顯著升高,這可能會導(dǎo)致代謝負(fù)擔(dān)增加。Zhao 等[37]研究發(fā)現(xiàn)Ca2+-Mg2+ATP 酶活性的降低會破壞中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)鰓上皮細(xì)胞中Ca2+和Mg2+的穩(wěn)態(tài),并影響ATP 的合成,可能會導(dǎo)致能量代謝出現(xiàn)問題,并最終損害鰓的正常生理功能。 本研究發(fā)現(xiàn)較高 Cd2+濃度(6 ~12 mg·L-1)誘導(dǎo)下文蛤鰓細(xì)胞凋亡率明顯上升,說明ATP 活性的降低直接破壞鰓上皮,影響其生理功能。

MT 是一種低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白,由2個功能獨(dú)立的球形結(jié)構(gòu)域組成,促進(jìn)其與二價金屬(例如Cd2+和Zn2+)的結(jié)合,在金屬元素的平衡、調(diào)節(jié)和解毒等方面具有重要的作用[44-45]。Cd2+(0 ~12 mg·L-1)會誘導(dǎo)文蛤鰓MTmRNA 的表達(dá)(圖10),機(jī)體可通過合成更多的MT 來抵抗Cd2+的毒害。 這可能是重金屬Cd2+進(jìn)入細(xì)胞后,產(chǎn)生的“毒物興奮效應(yīng)”,誘使MTmRNA 迅速表達(dá),對重金屬進(jìn)行解毒作用[46-47]。 但當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)增加(3~12 mg·L-1)時,文蛤鰓組織MTmRNA 的表達(dá)量出現(xiàn)下降的趨勢(圖10),這可能是過多的Cd 進(jìn)入細(xì)胞后將誘導(dǎo)MT 表達(dá)并與之結(jié)合形成Cd-MT 復(fù)合物,該復(fù)合物有可能進(jìn)入核內(nèi)促使DNA 雙鏈的降解[44,48]。 MT 是生物抵御重金屬毒害的重要防線,MT 結(jié)合重金屬達(dá)到飽和時,剩余的重金屬將會在體內(nèi)累積并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ROS,或直接與酶活性中心的巰基(—SH)結(jié)合占據(jù)其活性中心的位置,降低抗氧化酶活性和清除自由基的能力,致使機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[11,47]。 Rocha 等[11]的研究也發(fā)現(xiàn),當(dāng)貽貝(Mytilus galloprovincialis)暴露在不同濃度Cd2+3 d和14 d 后,貽貝鰓和消化腺中MT 的表達(dá)取決于Cd2+濃度和暴露時間。 目前的研究都表明水生動物對重金屬的耐受性與富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)含量之間具有一定的相關(guān)性,但MT 在文蛤細(xì)胞氧化損傷和凋亡中的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,在Cd2+濃度低于1.5 mg·L-1時文蛤機(jī)體中的酶和非酶抗氧化劑在短時間內(nèi)能抵御Cd2+對機(jī)體的毒害作用,但隨著濃度的增加,即使在遠(yuǎn)低于LC50的濃度下,機(jī)體也會產(chǎn)生氧化損傷甚至細(xì)胞凋亡,且具濃度依賴關(guān)系。 其潛在的毒性機(jī)制可能是Cd2+誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ROS,促使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基化以及DNA 和蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞ATP 酶活性受抑制,能量代謝紊亂。 在Cd2+濃度較低(0 ~1.5 mg·L-1)時,MT 和抗氧化酶被激活有助于緩解Cd2+的毒性作用,但環(huán)境中Cd2+濃度的持續(xù)增加(3 ~12 mg·L-1)會導(dǎo)致MT 的耗盡和抗氧化酶的失活,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。