馮國楊，楊 波，邢俊德，范曉軍

（1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，山西 太原 030600；2.山西杏花村汾酒集團有限責(zé)任公司，山西 汾陽 032205；3.太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030600）

2,3,5,6-四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又稱川芎嗪，是一種含氮雜環(huán)化合物，天然存在于可可豆、榛子、番石榴等堅果和水果中，也存在于豆制品、乳制品、陳醋、白酒等多種發(fā)酵食品中，具有令人愉快的烘烤香味[1]。TTMP被認(rèn)為是一類重要的香味化合物，作為一種安全的食品調(diào)味劑，已被廣泛應(yīng)用于食品中以改善風(fēng)味[2]。TTMP可通過微生物代謝和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，作為在曲霉酸之后第二個在天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的吡嗪化合物，TTMP最早由KOSUGE T等[3]在枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)并分離出來。因TTMP具有極低的風(fēng)味閾值，其對白酒、食醋等發(fā)酵食品的風(fēng)味形成具有重要貢獻[4]，同時也賦予食品健康保健的作用。已有的科學(xué)研究表明，TTMP具有抑制血小板聚集和血栓形成、擴張外周血管、增強免疫力、防治肝纖維化等藥理作用[5]，此外，TTMP還可以對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多種作用，吳斌等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TTMP具有抑制心源性腦梗死患者神經(jīng)功能損傷的作用。基于對上述研究成果的認(rèn)識與理解，釀造行業(yè)也越來越關(guān)注產(chǎn)品中TTMP的含量，特別是在食醋和白酒行業(yè)，使用微生物工程和發(fā)酵工程等領(lǐng)域的科學(xué)技術(shù)方法來提高釀造食品中TTMP的含量已成為當(dāng)前研究熱點之一[7-8]。本文對發(fā)酵食品中TTMP的檢測方法、微生物合成途徑及發(fā)酵食品中TTMP的增產(chǎn)策略等幾個方面進行了總結(jié)分析，為提高發(fā)酵食品中TTMP含量和更加深入的研究TTMP的生物合成機理提供可以參考的理論依據(jù)。

1 發(fā)酵食品中TTMP的檢測方法

國標(biāo)GB 1886.295—2016《食品添加劑2,3,5,6-四甲基吡嗪》中規(guī)定了四甲基吡嗪采用氣相色譜法進行測定，現(xiàn)階段針對食醋、白酒等發(fā)酵食品中TTMP的檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、高效液相色譜法（high performance liquid ghromatography，HPLC）、氣質(zhì)聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等。氣相色譜與液相色譜法都可以對發(fā)酵食品中的TTMP進行有效分離，且操作簡單，方便快捷，聯(lián)合使用質(zhì)譜檢測器時可獲得更低的目標(biāo)化合物檢出限[5]。

1.1 樣品前處理

發(fā)酵食品中TTMP的含量較低，且其他組分復(fù)雜[9]，所以發(fā)酵食品的前處理就尤為重要，通過樣品前處理在去除干擾物質(zhì)同時可將TTMP有效富集。對發(fā)酵食品或發(fā)酵液的前處理主要有液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）、液液微萃取（liquid-liquid microextraction，LLME）、頂空固相微萃取法（headspacesolid-phasemicroextraction，HS-SPME）等。液液萃取最常用的是利用有機溶劑進行常規(guī)萃取。溫丹華等[10]使用有機溶劑與酸交替的方法萃取山西老陳醋中的TTMP，首先通過三氯甲烷將TTMP從食醋中萃取出來，再利用0.2 mol/L鹽酸溶液將三氯甲烷中的TTMP萃取到水相，后續(xù)用HPLC進行檢驗，此方法平均回收率可以達到85.44%。FAN W L等[11]報道一種從大曲中提取香味物質(zhì)的方法，同樣可以用來提取TTMP，該方法將NaCl飽和的樣品用重蒸溶劑（戊烷∶乙醚=1∶1，V/V）進行萃取，通過調(diào)pH的方法可以將萃取組分逐步分成酸性/水溶性、中性和堿性組分，然后將其干燥、氮吹后通過氣相色譜進行檢測。

為了減少有機溶劑的使用，同時增加萃取效率，液液微萃取也被成功運用到發(fā)酵食品TTMP的檢測中。WU J H等[12]通過液液微萃取技術(shù)萃取了食醋中的TTMP，以400 μL的二氯乙烷作為萃取溶劑，以2.4 mL乙醇作為分散溶劑，萃取5 mL樣品的回收率可以達到97.97%以上。為了縮短萃取時間，可以利用超聲和渦旋處理進行輔助[13]，孫嘯濤等[14]建立了一種利用渦旋輔助液液微萃取方法，在對白酒中TTMP萃取時，通過渦旋60 s即可以使樣品溶液和萃取溶劑達到萃取平衡。

近些年來隨著固相微萃取法的發(fā)展，頂空固相微萃取技術(shù)因具有無溶劑、成本低、使用方便、檢測快速的優(yōu)點，在食品行業(yè)的研究和應(yīng)用也越來越廣泛，特別是對低分子質(zhì)量、低沸點的化合物萃取效果較好[15]。黃璇等[16]利用頂空固相微萃取方法對納豆的揮發(fā)性成分進行了提取，然后用GC-MS進行檢測，共檢測出包括TTMP在內(nèi)的6種吡嗪類物質(zhì)。頂空固相微萃取技術(shù)的萃取效果主要與萃取頭材質(zhì)、萃取溫度、萃取時間等因素相關(guān)[17]，同時還可以通過增加鹽濃度來降低分析物的溶解度，從而提高目標(biāo)物的萃取效率[15]。吳建峰[5]用二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷固相微萃取萃取頭在萃取溫度50 ℃、萃取時間40 min時，加入NaCl至0.3 g/mL的條件下對白酒中的TTMP進行萃取，實驗結(jié)果表明，加標(biāo)回收率可以達到108.05%。

1.2 檢測方法

前處理后的發(fā)酵食品樣品，一般采用氣相色譜或者是高效液相色譜進行樣品中各組分的分離，并使用相應(yīng)的檢測器進行檢測。通過液液萃取的樣品一般采用配有紫外檢測器的液相色譜儀來檢測，此檢測方法快速、簡單、回收率高，準(zhǔn)確性和重復(fù)性也比較好[18]。通過頂空固相微萃取法處理的樣品一般采用氣相色譜進行檢測，除了紫外檢測器以外，還可以利用氫離子火焰檢測器進行檢測[19]。氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用可以對組分進行精準(zhǔn)的分析，但是對于定量分析具有一定的局限性。黃杰等[20]建立了一種利用三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀來檢測白酒中TTMP的方法，通過二次碰撞對目標(biāo)物進行定性定量的分析，其抗干擾能力較強，更適用于復(fù)雜成分的分析。

2 食品中TTMP的來源

烷基吡嗪類物質(zhì)既存在于植物種子和水果中，也存在于豆制品、乳制品、咖啡、陳醋、白酒等加工食品中，對食品的風(fēng)味調(diào)節(jié)起著重要作用。對于發(fā)酵食品來說，其中的烷基吡嗪主要來源于美拉德反應(yīng)（Maillard reaction，MR）與微生物代謝。

2.1 美拉德反應(yīng)

美拉德反應(yīng)（MR）指的是氨基化合物（如氨基酸）和羰基化合物（通常指還原糖）之間發(fā)生的一系列非酶褐變反應(yīng)，可以給食品帶來多重變化，對食品風(fēng)味、顏色的形成有十分重要的作用[21]。MR顏色的改變主要與MR產(chǎn)物類黑素的生成有關(guān)，類黑素也與抗氧化活性有關(guān)[22]，吡嗪類物質(zhì)主要影響的是食品的風(fēng)味。也有研究發(fā)現(xiàn)，MR會產(chǎn)生像丙烯酰胺這樣對人體健康不利的物質(zhì)[21]。

MR分三個階段進行，其初始階段是還原糖的羰基與氨基化合物發(fā)生縮合反應(yīng)生成希夫堿（schiff base），隨即環(huán)化生成N-葡萄糖基胺，進一步通過阿馬多利（amadori）分子重排生成amadori化合物。進入中間階段后，amadori化合物迅速發(fā)生烯醇化，釋放氨基，裂解生成二羰基化合物；二羰基化合物進一步與氨基化合物發(fā)生斯特勒克降解（Strecker degradation）反應(yīng)，生成的羰氨類化合物經(jīng)過縮合生成吡嗪類物質(zhì)。最終階段中MR將中間階段生成的各種產(chǎn)物進一步聚合生成類黑素[21]。羰基化合物和氨基化合物的種類對MR有顯著影響，且氨基化合物對吡嗪類物質(zhì)的生成影響更大，如以甘氨酸、絲氨酸為原料進行MR合成生成的吡嗪類物質(zhì)比脯氨酸、亮氨酸為原料時的產(chǎn)量更高。在食醋和白酒釀造環(huán)境中氨基化合物的來源主要是植物降解產(chǎn)生的天然蛋白水解產(chǎn)物，研究表明以分子質(zhì)量低的（＜1 000 Da）天然蛋白水解產(chǎn)物為原料時產(chǎn)生的吡嗪含量更高[23]。此外MR還與反應(yīng)時間、溫度、pH值等多種因素有重要關(guān)系，一般來說MR最適pH為5.0～8.0，在弱堿性的條件下更利于吡嗪物質(zhì)的生成。在合適的條件下，溫度越高、維持時間越長反應(yīng)生成物種類越多、含量越高[24]。因此，白酒釀造過程中的MR主要存在于溫度較高的制曲、高溫堆積、蒸餾等階段[25]，食醋釀造過程中MR則更多的是在熏醅、晾曬和陳釀階段發(fā)生[26]。

2.2 微生物發(fā)酵

研究發(fā)現(xiàn)，在不具有MR發(fā)生條件的食品釀造過程中，也有TTMP的生成[25，27]，由此可見，食品發(fā)酵過程中除MR以外還有別的途徑會產(chǎn)生TTMP。KOSUGE T等[28]在納豆和用于發(fā)酵生產(chǎn)納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）的培養(yǎng)物中都分離出了TTMP。另有研究發(fā)現(xiàn)，在大豆釀造的環(huán)境中添加TTMP生物合成途徑的前體物質(zhì)乙偶姻會使產(chǎn)品的TTMP含量顯著提高[29]。另外，從大曲和酒醅中篩出的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），在以高粱為主要原料的營養(yǎng)環(huán)境中固態(tài)發(fā)酵，也檢測到了TTMP的生成[30]。由此可以推測，釀造過程中的TTMP產(chǎn)生很有可能來源于微生物代謝。已有很多研究者在釀造食品的發(fā)酵生產(chǎn)過程中篩選出了可以生產(chǎn)TTMP的菌株（見表1），微生物代謝生產(chǎn)TTMP的研究也越來越受到科研工作者的廣泛關(guān)注。

表1 食品釀造過程中的產(chǎn)四甲基吡嗪菌株Table 1 Tetramethylpyrazine producing strains in food brewing process

3 微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP

3.1 產(chǎn)TTMP菌株

3.1.1 芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)TTMP

在微生物合成TTMP途徑被提出后，許多學(xué)者開展了芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的研究，XIAO Z J等[38]報道了一株從蘋果園和葡萄園土壤中分離出的芽孢桿菌可以利用葡萄糖和豆粕的酶消化產(chǎn)物來生產(chǎn)高純度的TTMP，產(chǎn)量可以達到4.33 g/L。此外，還有一些提高TTMP產(chǎn)量的方法被應(yīng)用于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵過程中，ZHU B F等[39]通過控制pH來提高產(chǎn)量，將發(fā)酵分為了兩個階段，第一個階段是細(xì)菌的生長和前體物質(zhì)的積累，第二個階段是TTMP的形成。前者需要在弱酸性條件下進行，在pH值為5.5時，得到了細(xì)胞的最大生長速率0.833 g/（L·h）和前體物質(zhì)乙偶姻的最大積累量1.118 g/（L·h）；在產(chǎn)物形成階段調(diào)節(jié)pH值為7.0，得到TTMP的最大生長速率0.095 g/（L·h），最終得到的產(chǎn)物質(zhì)量濃度為7.43 g/L，相比于之前的研究，TTMP產(chǎn)量得到較大提高。且枯草芽孢桿菌對人無毒無害、無治病性、不污染環(huán)境，可以安全的添加到發(fā)酵環(huán)境中[40]。

3.1.2 乳酸桿菌與其他菌種發(fā)酵生產(chǎn)TTMP

乳酸桿菌等一些其他種屬的微生物也逐漸被發(fā)現(xiàn)可用于TTMP的生產(chǎn)，SOO K等[41]通過乳酸桿菌生產(chǎn)TTMP，該科研工作首先通過發(fā)酵使TTMP的前體物質(zhì)乙偶姻大量積累，所需的氮源通過加入精氨酸來代謝產(chǎn)生。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液升溫即可產(chǎn)生TTMP，在121 ℃條件下，乙偶姻的轉(zhuǎn)化率可以達到15%。DEMAIN A L等[42]報道了一株谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）的突變體具有生產(chǎn)TTMP的能力，產(chǎn)量可達3 g/L，但此突變株的生長需要異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和泛酸鹽等物質(zhì)，且TTMP的大量積累需要加入硫胺素。XU Y Q等[43]利用基因工程技術(shù)改造出了高產(chǎn)TTMP菌株，該研究工作對大腸桿菌（Escherichia coli）的改造部分包括對比不同菌株的乙偶姻合成基因簇，找出高效基因簇；改變核糖體結(jié)合位點到起始密碼子的距離，提高翻譯效率；微調(diào)還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶的表達等。通過基因改造和優(yōu)化發(fā)酵條件，使菌在分批補料發(fā)酵條件下有效的利用底物葡萄糖生成乙偶姻，質(zhì)量濃度可以達到68.4 g/L。將發(fā)酵液上清直接用于生產(chǎn)TTMP，在初始pH值為7.5的條件下，加入磷酸氫二銨40 min內(nèi)TTMP產(chǎn)量達到了16.1 g/L。

近些年來微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的技術(shù)取得了長足的進步，產(chǎn)量也得到了大幅提高。然而，食品發(fā)酵往往是一個復(fù)雜的多菌種發(fā)酵系統(tǒng)，將高產(chǎn)TTMP的菌種應(yīng)用到食品發(fā)酵環(huán)境中還面臨諸多挑戰(zhàn)，如適應(yīng)復(fù)雜的發(fā)酵環(huán)境、添加方式和添加量、發(fā)酵微環(huán)境和營養(yǎng)調(diào)節(jié)等都是需要深入研究的問題。

3.2 微生物生產(chǎn)TTMP的合成途徑

自從發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可以生產(chǎn)TTMP以后，對其代謝通路的研究就成為微生物生產(chǎn)TTMP一個關(guān)鍵領(lǐng)域。KOSUGE T等[28]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能產(chǎn)生TTMP后，依據(jù)實驗結(jié)果對生物合成途徑進行了合理推測，首先吡嗪中胺部分來自氨基酸，碳部分來自糖。通過Voges-Proskauer（V-P）試驗發(fā)現(xiàn)，此枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生乙偶姻，從化學(xué)角度分析TTMP可以由乙偶姻合成（見圖1a）。此方法奠定了研究TTMP生物合成途徑的基本框架，越來越多的發(fā)現(xiàn)證明并豐富了此路線。

圖1 四甲基吡嗪的生物合成通路Fig.1 Biosynthetic pathways of tetramethylpyrazine

3.2.1 前體物質(zhì)乙偶姻

乙偶姻即3-羥基-2-丁酮，具有令人愉快的酸奶氣味和脂肪奶油味道，在化學(xué)合成中乙偶姻是多種化合物特別是雜環(huán)化合物的前體物質(zhì)[44]。LARROCHE C等[29]在研究枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）固態(tài)發(fā)酵大豆生產(chǎn)吡嗪時，加入乙偶姻可使TTMP的產(chǎn)量大幅度提高，在一定程度上解釋了乙偶姻作為TTMP的前體物質(zhì)的可能性。HUANG T C等[45]通過同位素標(biāo)記法在體外建立了乙偶姻與不同銨鹽反應(yīng)體系模型，證明由乙偶姻首先生成3-氨基-2-丁酮，再二聚為二氫吡嗪的過程是可行的。DICKSCHAT J S等[46]通過構(gòu)建乙偶姻合成基因突變體菌株與同位素標(biāo)記的方法證明了在產(chǎn)TTMP的菌體內(nèi)存在由乙偶姻到二氫吡嗪的過程，該研究進一步明確了乙偶姻為微生物合成TTMP的前體物質(zhì)。

3.2.2 TTMP生物合成途徑

由乙偶姻到TTMP這一合成途徑在微生物體內(nèi)是否有相關(guān)酶的參與，這一問題成為了該領(lǐng)域的一個爭論熱點。目前大多數(shù)研究者傾向于此過程是非酶促反應(yīng)，RIZZI G P[47]在溫和條件下觀察到了水溶液中乙偶姻和銨鹽自發(fā)形成TTMP的現(xiàn)象。吳建峰等[48]在體外以乙偶姻和氨為底物研究溫度對TTMP生成的影響，發(fā)現(xiàn)高溫可以加快反應(yīng)速率，并通過從釀酒曲中篩選出的高產(chǎn)TTMP的枯草芽孢桿菌進行原位反應(yīng)驗證，在發(fā)酵液中提高乙偶姻與氨的反應(yīng)階段的溫度后，合成產(chǎn)物的量明顯增多，60 ℃條件下的產(chǎn)物是37 ℃的5倍左右，證明了乙偶姻和氨反應(yīng)生成TTMP的過程可通過簡單的熱力學(xué)反應(yīng)得以實現(xiàn)。但DICKSCHATJ S等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在瓊脂糖固體培養(yǎng)基中乙偶姻與氨無法自發(fā)的生成TTMP，而在微生物的參與下是可以生成的。微生物的來源和多樣性極其豐富，其對環(huán)境的適應(yīng)性和應(yīng)激性也非常強，且體內(nèi)代謝合成機制極其復(fù)雜，其體內(nèi)是否存在酶促反應(yīng)仍有待進一步研究。綜合上述內(nèi)容，目前TTMP的生物合成機制逐步清晰，首先是經(jīng)糖酵解等途徑生成的丙酮酸，再由酶催化生成乙偶姻，最終由乙偶姻與氨生成TTMP（見圖1b）。

4 提高發(fā)酵食品中TTMP含量的策略

發(fā)酵食品中的TTMP來自于美拉德反應(yīng)和微生物代謝，美拉德反應(yīng)十分復(fù)雜，過程中會產(chǎn)生多種產(chǎn)物，難以控制[21]。為此人們更希望通過微生物合成途徑來提高發(fā)酵食品中TTMP的含量。乙偶姻作為TTMP的前體，通過提高乙偶姻的含量來提高TTMP產(chǎn)量是可行的，且乙偶姻也可以增加食品的風(fēng)味[44]。MENG W等[49]通過對地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）進行基因工程操作，過表達α-乙酰乳酸脫羧酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因，使乙偶姻的產(chǎn)量增加了23.06%，繼而使TTMP的產(chǎn)量提高了15.47%。白酒釀造過程的酸性環(huán)境并不適合α-乙酰乳酸合成酶催化反應(yīng)，為此ZHAO T等[50]通過定點突變提高了酶的耐酸性，使其更適合釀造環(huán)境，但以上兩個研究在發(fā)酵食品的進一步應(yīng)用面臨基因工程菌的安全性評價問題。陳詩佳等[7]將高產(chǎn)乙偶姻的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）應(yīng)用到白酒釀造中，酒醅中乙偶姻含量提高了320.38%，TTMP提高了74.66%，相比芽孢桿菌，釀酒酵母可能更適用于白酒釀造過程的厭氧和偏酸性環(huán)境。

現(xiàn)階段向發(fā)酵環(huán)境中加入菌的方式多為在發(fā)酵曲中加入菌制成強化曲，再將強化曲按照發(fā)酵工藝加入發(fā)酵環(huán)境中。葛向陽等[8]將地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的懸液按照0.5%的比例加入制曲原料中，結(jié)果表明大曲中的TTMP提高了4～10倍。ZHANG L Q等[51]將接種高產(chǎn)TTMP菌株的加強曲與未接種菌株的曲按照不同比例混合后用于發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)當(dāng)比例為5∶5時效果最好，可以將食醋中的乙偶姻與TTMP分別提高了191.84%和123.17%。因此，通過加強曲的方式將微生物菌株應(yīng)用到發(fā)酵過程來提高釀造食品的TTMP含量較為可行和便捷。

5 總結(jié)與展望

隨著生活水平的不斷提高，人們更加追求生活的品質(zhì)，對于食品更注重風(fēng)味與健康，這促使著食品行業(yè)的健康發(fā)展。另外分子生物學(xué)、發(fā)酵工程等技術(shù)的融合和集成創(chuàng)新，也為進一步研發(fā)健康發(fā)酵食品提供了新的思路。針對現(xiàn)階段已經(jīng)篩選出的高產(chǎn)TTMP的菌株，可以通過合成微生物組的研究探索出最佳的菌種組合方式，提高菌株的穩(wěn)定性和綜合應(yīng)用性能。另外，通過分子生物學(xué)技術(shù)手段進一步明確TTMP的微生物合成途徑，可為減少發(fā)酵副產(chǎn)物和提高轉(zhuǎn)化率提供理論基礎(chǔ)。