王麗瑋 萬中義 宋亞迪 修志君 于世成 杜美娥 張笑宇*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北武漢 430070；3 鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017010）

馬鈴薯（L.）是一種重要的全球性作物，在國內(nèi)外大面積種植，其種植面積僅次于水稻、小麥和玉米，在經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。2018 年全球馬鈴薯產(chǎn)量約為3.68 億t，我國馬鈴薯總產(chǎn)量達9 000 萬t，成為馬鈴薯產(chǎn)量第一大國（Liu et al.，2020；Li et al.，2021）。

馬鈴薯瘡痂?。╬otato common scab）是由多種植物病原鏈霉菌（spp.）引起的世界范圍內(nèi)重要的土傳病害，被稱為馬鈴薯第四大病害，發(fā)生日趨嚴重（Chi et al.，2021），給全世界各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)帶來了嚴重威脅（Dees &Wanner，2012）。馬鈴薯感染瘡痂病菌后，在塊莖表面形成木栓狀隆起、凹陷或平狀病斑（Kinga &Calhoun，2005），對馬鈴薯的品質(zhì)造成影響，降低其經(jīng)濟價值。在美國，瘡痂病是馬鈴薯五大病害之一（Wanner，2009）。加拿大82%的馬鈴薯生產(chǎn)區(qū)都會發(fā)生馬鈴薯瘡痂病，每年因該病害造成的經(jīng)濟損失在1 530 萬～1 730 萬美元之間（Hill &Lazarovits，2005）。我國多個省份報道有該病的發(fā)生（杜魏甫，2016），在內(nèi)蒙古自治區(qū)，馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生尤為嚴重，商品田發(fā)生面積達16.6 萬hm，種薯田發(fā)生面積為0.07 萬hm（張建平 等，2018），一些馬鈴薯微型薯種植區(qū)的發(fā)病率已高達90%（梁宏杰 等，2021）。尋找一種綠色高效的瘡痂病防治方法，成為了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)亟待解決的問題。

使用抗病品種是馬鈴薯瘡痂病最經(jīng)濟有效的防治措施，但是抗瘡痂病的馬鈴薯品種較少，且未發(fā)現(xiàn)對瘡痂病菌具有完全抗性的品種（Dees &Wanner，2012）。有的采用輪作和降低土壤pH 值的方法，但效果不理想（陳利達 等，2020）；化學(xué)防治在一定程度上可減輕該病害的發(fā)生，但不能達到徹底防治的目的，使用不當還會產(chǎn)生副作用（李爽 等，2018；Yang et al.，2021）；生物防治不會造成環(huán)境污染和毒素殘留，可連續(xù)持久地控制該病害（Alamri et al.，2012）。近年來的研究結(jié)果表明，生防菌芽孢桿菌（spp.）對馬鈴薯瘡痂病有明顯的防治效果，包括側(cè)孢芽孢桿菌（）（Chen et al.，2017）、解淀粉芽孢桿菌（）（Lin et al.，2018）和高地芽孢桿菌（）（Li et al.，2019）等。此外，一些非致病鏈霉菌也可有效地防治馬鈴薯瘡痂病，如玫瑰黃鏈霉菌（）Menmyco-93-63 發(fā)酵液與蛭石混合后對馬鈴薯瘡痂病的防效為49.02%（許華民，2015）；橄欖色鏈霉菌（）和褶皺鏈霉菌（）也被報道具有抗馬鈴薯瘡痂病菌的活性（Zadeh et al.，2006）。

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)課題組前期從馬鈴薯瘡痂病病斑上分離到1 株生防鏈霉菌PBSH9，經(jīng)鑒定為鏈霉菌的1 個新種（Zhang et al.，2020），命名為sp.nov.（登錄號：JAKZEO000000000）。本試驗研究該生防菌及其代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌形態(tài)的影響，并用單因素試驗優(yōu)化PBSH9 的發(fā)酵條件，為該生防菌的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

生防鏈霉菌PBSH9（sp.nov），馬鈴薯瘡痂病菌加利利鏈霉菌PS1（），均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室分離保存。

1.2 培養(yǎng)基

高氏1 號培養(yǎng)基：MgSO·7HO 0.5 g、FeSO·7HO 0.01 g、KNO1 g、NaCl 0.5 g、KHPO0.5 g、淀粉20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下滅菌30 min。

ISP培養(yǎng)基：葡萄糖4 g、酵母浸粉4 g、麥芽浸粉10 g、瓊脂16 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下滅菌30 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 生防鏈霉菌PBSH9 對馬鈴薯瘡痂病菌PS1的抑制作用 2021 年6月利用平板對峙法評價菌株P(guān)BSH9 對病原菌PS1 的抑制作用。將PS1 置于液體ISP培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)2 d，使其菌懸液濃度為1 × 10cfu·mL，再取200 μL 菌懸液均勻涂在ISP固體培養(yǎng)基上，用直徑為5 mm 的無菌打孔器取菌株P(guān)BSH9 菌餅，倒置于涂有PS1 的ISP固體培養(yǎng)基平板中央，以沒有菌的固體培養(yǎng)基作對照，設(shè)置5 個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察抑菌效果。將菌株P(guān)BSH9連續(xù)培養(yǎng)3 代，用相同的方法觀察PBSH9 對PS1 抑制效果的穩(wěn)定性，十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算抑制率，并在光學(xué)顯微鏡下觀察PS1 的菌絲和分生孢子形態(tài)變化。

1.3.2 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用 將菌株P(guān)BSH9 接種在固體高氏1 號培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)3 d，取2 個直徑為5 mm 的菌餅，置于80 mL 液體高氏1 號培養(yǎng)基中，180 r·min、28 ℃恒溫下振蕩培養(yǎng)。從0 h 開始每隔12 h 取樣測定菌液在波長為600 nm 處的吸光值（OD），繪制生長曲線，確定PBSH9 對數(shù)生長期，并以此時期的菌懸液作為后續(xù)培養(yǎng)試驗的種子液。每組試驗3 次重復(fù)。

每100 mL 液體高氏1 號培養(yǎng)基中接入5 mL OD在1.189 左右的PBSH9種子液，28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d，10 000 r·min離心10 min，取上清液，再用孔徑為0.22 μm 的過濾器將其過濾，得到PBSH9 代謝物，置于滅菌的離心管中，4 ℃保存 備用。

以打孔法檢測代謝物的抑菌活性。向直徑為90 mm 的培養(yǎng)皿中倒入20 mL 固體ISP培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后取200 μL 病原菌PS1（1 × 10cfu·mL）菌液均勻地涂在培養(yǎng)基表面，用滅菌的打孔器在距離平板中央2 cm 處分別打3 個直徑為5 mm的孔，向孔中分別注入菌株P(guān)BSH9 的代謝物、125 μg·mL氯霉素（陽性對照，CK1）、液體高氏1號培養(yǎng)基（空白對照，CK2）各100 μL。3 次重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算抑制率。同時在光學(xué)顯微鏡下觀察PS1 的菌絲和分生孢子形態(tài)。

1.3.3 生防鏈霉菌PBSH9 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ①培養(yǎng)時間及接種量對PBSH9 抑菌活性的影響。在100 mL 液體高氏1 號培養(yǎng)基中，分別接入OD約為1.189 的PBSH9 種子液3、5、7、9 mL，180 r·min、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)1～12 d，每隔24 h 取1 次樣，10 000 r·min條件下離心10 min 后用孔徑為0.22 μm 的過濾器過濾得到代謝物，置于滅菌的離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆?。按?.3.2 的方法在涂有病原菌PS1 的固體高氏1 號培養(yǎng)基上打孔，每個孔中接入100 μL 代謝物，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。以抑菌圈直徑判斷最優(yōu)培養(yǎng)時間及接種量。每組試驗3 次重復(fù)。

② 培養(yǎng)溫度對PBSH9 抑菌活性的影響。在100 mL 液體高氏1 號培養(yǎng)基中接入7 mL PBSH9 種子液，轉(zhuǎn)速為180 r·min，設(shè)置溫度梯度為22、25、28、31 ℃和34 ℃，分別振蕩培養(yǎng)9 d，按照①中的方法獲得代謝物并用打孔法判斷最優(yōu)培養(yǎng)溫度。每個處理3 次重復(fù)。

③培養(yǎng)基pH 對PBSH9 抑菌活性的影響。調(diào)節(jié)液體高氏1 號培養(yǎng)基的pH 為4～12，每個pH 梯度分別接入7 mL PBSH9 種子液，180 r·min、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)9 d，按照①中的方法獲得代謝物并用打孔法判斷最優(yōu)培養(yǎng)pH。每個處理3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果利用Excel 2010 軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結(jié)果利用SPSS 20.0.0分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，并檢驗處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防鏈霉菌PBSH9 對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用

PBSH9 對病原菌PS1 具有顯著的抑制作用，培養(yǎng)3 代的抑制率均大于70%，一代、二代、三代的抑制率分別為74.79%、74.13%、75.00%，抑制效果穩(wěn)定，三者間無顯著差異。由圖1 可知，PBSH9 對PS1 菌絲有明顯的致畸作用，氣生菌絲與基內(nèi)菌絲都會出現(xiàn)生長畸形的情況，菌絲發(fā)生交聯(lián)，基內(nèi)菌絲交聯(lián)尤其嚴重（圖1-E、1-F）；氣生菌絲變短、由彎變直、明顯膨脹變粗，且菌絲出現(xiàn)斷裂，原生質(zhì)滲漏（圖1-E）。此外，PBSH9 會使PS1 的孢子變形，產(chǎn)孢數(shù)量降低。共培養(yǎng)24 h 時，與對照（圖1-G）相比，孢子變小且數(shù)量明顯減少（圖1-H）。

圖1 生防鏈霉菌PBSH9 對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的影響

2.2 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用

2.2.1 生防鏈霉菌PBSH9 的生長曲線 如圖2 所示，PBSH9 在液體高氏1 號培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)0～24 h 為菌株緩慢增長期；培養(yǎng)36～72 h 菌株生長速度最快，為對數(shù)生長期；72 h 后菌液OD值趨于穩(wěn)定，菌株生長處于穩(wěn)定期。

圖2 生防鏈霉菌PBSH9 的生長曲線

2.2.2 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用 由圖3 可見，PBSH9 代謝物對病原菌PS1 有較強的抑制作用，平均抑菌圈直徑20.17 mm，抑制率為75.21%，顯著高于陽性對照氯霉素對PS1 的抑制率59.45%（平均抑菌圈直徑12.33 mm）。由圖4 可知，經(jīng)PBSH9 代謝物處理后，PS1 的菌絲畸形，膨脹變粗、變短，出現(xiàn)嚴重的交聯(lián)、斷裂，產(chǎn)孢量降低，孢子由圓形變?yōu)樗螤?。?jīng)氯霉素處理的PS1 菌絲也會畸形，與PBSH9 代謝物處理相比菌絲會更粗，有少數(shù)菌絲會斷裂，孢子變?yōu)樗笮?，中間粗，兩端較細。此外，PBSH9抑制了PS1 的菌絲生長，在透明抑菌圈內(nèi)可以觀察到少量的PS1 孢子，將抑菌圈內(nèi)的孢子轉(zhuǎn)移到新的ISP培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，發(fā)現(xiàn)有菌落長出，說明抑菌圈內(nèi)的孢子仍有活性（圖5）。

圖3 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制作用

圖4 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的影響

圖5 生防鏈霉菌PBSH9 代謝物對抑菌圈內(nèi)馬鈴薯瘡痂病菌PS1 孢子的影響

2.3 生防鏈霉菌PBSH9 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)時間及接種量對生防鏈霉菌PBSH9 代謝物抑菌活性的影響 不同培養(yǎng)時間及接種量都會對PBSH9 代謝物的抑菌效果產(chǎn)生影響（表1），當PBSH9 種子液接種量為3 mL 時，培養(yǎng)9 d 的代謝物的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為22.67 mm；接種量為5 mL 時，培養(yǎng)3 d 和4 d 的抑菌圈不清晰，但較大（圖6），培養(yǎng)5 d 時，抑菌圈內(nèi)無菌絲生長，對病原菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑為19.83 mm；接種量為7 mL、培養(yǎng)9 d 和10 d 時代謝物的抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別為24.00 mm 和23.17 mm；接種量為9 mL、培養(yǎng)6 d 和7 d 時抑菌圈直徑分別為20.50 mm 和19.83 mm。綜合比較，每100 mL 液體高氏1 號培養(yǎng)基中接入7 mL 種子液，培養(yǎng)9 d 時代謝物的抑菌效果最好。

圖6 接種量為5 mL 培養(yǎng)3 d（左）和4 d（右）時生防鏈霉菌PBSH9 的抑菌活性

表1 培養(yǎng)時間及接種量對生防鏈霉菌PBSH9 代謝物抑菌圈直徑的影響 mm

2.3.2 培養(yǎng)溫度對生防鏈霉菌PBSH9 抑菌活性的影響 當培養(yǎng)溫度為28 ℃時PBSH9 代謝物的抑菌效果最好，抑菌圈直徑最大，為23.67 mm。溫度升高或降低，其抑菌活性都有所下降（圖7）。

圖7 培養(yǎng)溫度對生防鏈霉菌PBSH9 抑菌活性的影響

2.3.3 培養(yǎng)基pH 對生防鏈霉菌PBSH9 抑菌活性的影響 由圖8 可知，PBSH9 在培養(yǎng)基pH 為4～12的范圍內(nèi)都可生長，當pH 為7 時，PBSH9 代謝物的抑菌效果最好，抑菌圈直徑最大，為23.67 mm。酸性和堿性培養(yǎng)條件下抑菌活性都有所下降。

圖8 培養(yǎng)基pH 對生防鏈霉菌PBSH9 抑菌活性的影響

3 討論

瘡痂病在世界范圍內(nèi)給馬鈴薯生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，在眾多的防治措施中，生物防治備受學(xué)者關(guān)注。非致病鏈霉菌屬于土壤習(xí)居菌，能在致病鏈霉菌存在的地方生存，因此作為生防菌具有一定的優(yōu)勢（楊冰 等，2021）。Kobayashi 等（2012）從野生燕麥栽培地分離出的鏈霉菌sp.WoRs-501 對馬鈴薯瘡痂病菌有較強的抑制作用，與干土混合后可使病害嚴重程度降低78%～94%。劉萍萍（2016）發(fā)現(xiàn)鏈霉菌sp.CC5 可以抑制馬鈴薯瘡痂病菌的生長，抑菌圈大小為10.5 mm，經(jīng)紫外誘變后，該鏈霉菌的抑菌作用提高了25%，且經(jīng)過傳代培養(yǎng)10 代后，抑菌作用沒有減弱。本試驗中生防鏈霉菌PBSH9 也可抑制馬鈴薯瘡痂病菌的生長，傳代培養(yǎng)3 代，對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 的抑制率均大于70%，抑制效果穩(wěn)定。

生物防治的機制主要是利用微生物種內(nèi)或種間的競爭、溶菌、抗生、重寄生等作用，也有一些是通過合成次級代謝產(chǎn)物來誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，同時促進植物生長?？咕钚晕镔|(zhì)通常是拮抗放線菌發(fā)揮生物學(xué)作用的基礎(chǔ)，而鏈霉菌具有較高的天然產(chǎn)物生物合成能力，因生產(chǎn)抗生素而聞名（Chater，2006；Nett et al.，2009）。Sarwar 等（2018）發(fā)現(xiàn)鏈霉菌A1RT 的甲醇提取物對馬鈴薯瘡痂病菌表現(xiàn)出較高的抑菌活性，抑菌圈直徑為26 mm。同時該團隊還從紫黑鏈霉菌AC12AB 中發(fā)現(xiàn)了阿扎霉素RS-22A，使馬鈴薯瘡痂病的發(fā)病率降低83%，馬鈴薯產(chǎn)量增加26.8%（Sarwar et al.，2019）。Eckwall 和Schottel（1997）從strain PonSSII 中發(fā)現(xiàn)了1個只對馬鈴薯瘡痂病菌有抑制作用的分子量在500 左右的化合物。本試驗中，生防鏈霉菌PBSH9 的代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 也具有明顯的抑制作用，平均抑菌圈直徑為20.17 mm，今后有必要對該菌活性物質(zhì)進行進一步研究。

莽春霞（2016）在研究灰色鏈霉菌（）對煙草靶斑病菌（Kühn）的抑制作用時發(fā)現(xiàn)，煙草靶斑病菌被抑制后，菌絲會出現(xiàn)節(jié)間變短、變粗、扭曲變形、菌絲分隔增多等現(xiàn)象。本試驗中，利用生防鏈霉菌PBSH9 及其代謝物抑制馬鈴薯瘡痂病菌PS1 時，被抑制的病原菌菌絲也會出現(xiàn)交聯(lián)、變粗和斷裂等畸形現(xiàn)象。

抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)率決定抑菌效果，發(fā)酵是獲得大量微生物活性代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)（Duan et al.，2020）。邸墊平等（2006）從玫瑰黃鏈霉菌Menmyco-93-63 的代謝產(chǎn)物中分離具有抑制馬鈴薯瘡痂病菌的化合物時，發(fā)酵7 d 就進行萃取分離。戴蓬博等（2016）利用極長鏈霉菌（）SL01 代謝產(chǎn)物防治蘋果樹腐爛?。∕iyabe et Yamada）時，50 mL 液體培養(yǎng)基中只接入1 mL 培養(yǎng)3 d 的種子液，發(fā)酵培養(yǎng)7 d 后的代謝物就可對蘋果樹腐爛病菌有較強的抑制效果。項仁鑫等（2018）在30 mL 培養(yǎng)基中接入1.5 mL生長32 h 的種子液，發(fā)酵7 d，鏈霉菌HY6-S36 的星孢菌素產(chǎn)量最高。不同接種量對代謝物抑菌活性的影響較大，主要是因為接種量較小時，會影響菌株的生長繁殖速度，而接種量過大，會引起搖瓶內(nèi)溶氧不足，間接影響菌株生長，這兩種情況都會導(dǎo)致菌株次級代謝產(chǎn)物含量降低，最終影響代謝物的抑菌效果（周躍慧，2018）?；诖嗽颍驹囼炛胁煌臃N量的代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用。此外，菌株P(guān)BSH9 在培養(yǎng)72 h 后處于生長穩(wěn)定期，但接入7 mL 種子液、培養(yǎng)9 d 時代謝物的抑菌效果最好。雖然從生產(chǎn)角度來說培養(yǎng)9 d 浪費大量資源，生產(chǎn)成本顯著增加，但3 d 與9 d 的代謝物抑菌效果差異顯著，因此確定培養(yǎng)周期為9 d。不同研究得出的結(jié)論不盡相同，可能和不同菌株有關(guān)，也可能與培養(yǎng)條件等多種因素有關(guān)，還需進一步研究，為該菌株的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

生防鏈霉菌PBSH9 及其代謝物對馬鈴薯瘡痂病菌PS1 有明顯的抑制作用，菌株傳代培養(yǎng)3 代對PS1 的抑制率均大于70%，抑制效果穩(wěn)定；PBSH9代謝物的平均抑制率為75.21%。該生防菌及其代謝物使病原菌菌絲發(fā)生交聯(lián)，變短，變粗，孢子變形，產(chǎn)孢量明顯減少，但透明抑菌圈內(nèi)的少量孢子仍有活性。每100 mL 液體高氏1 號培養(yǎng)基中接入7 mL OD在1.189 左右的生防菌PBSH9 種子液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 為7，轉(zhuǎn)速為180 r·min、28 ℃下恒溫培養(yǎng)9 d 得到的代謝物抑菌效果最好，抑菌圈直徑為23.67 mm。