魏曉雪，田 晨，馮劍豐,2，朱 琳*

1. 南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300350

2. 天津市跨介質(zhì)復(fù)合污染環(huán)境治理技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350

營(yíng)養(yǎng)鹽濃度過(guò)高是造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的必要因素，然而研究發(fā)現(xiàn)，有害藻華形成后，水環(huán)境中某種營(yíng)養(yǎng)鹽濃度反而處于較低水平，并形成營(yíng)養(yǎng)鹽限制狀態(tài). 以N/P(摩爾比，下同)為營(yíng)養(yǎng)鹽限制判斷標(biāo)準(zhǔn)，其大于16∶1 時(shí)，藻類生長(zhǎng)受磷限制. 研究表明，中國(guó)長(zhǎng)江口、遼東灣、大鵬灣、渤海灣等水域N/P 范圍為17～490，浮游植物生長(zhǎng)主要受磷限制. 磷是浮游植物生長(zhǎng)和繁殖必需的營(yíng)養(yǎng)元素，參與有機(jī)體的化學(xué)組成和物質(zhì)傳遞，也是導(dǎo)致有害藻華形成過(guò)程中，是否產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)限制的重要因子. 在磷限制條件下，有害藻華生態(tài)系統(tǒng)中磷元素的能量流和物質(zhì)流同浮游植物體內(nèi)的組分存在供需動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，藻細(xì)胞內(nèi)的不同組分在磷限制環(huán)境中具有高度可變性. 研究表明，微藻存在磷儲(chǔ)存現(xiàn)象，以應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)匱乏的環(huán)境條件，而不同種類藻的磷儲(chǔ)存能力存在顯著差異. 這種差異可能與藻的生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)鹽吸收、細(xì)胞形態(tài)等密切相關(guān)，并且可能與有害藻華的形成存在重要聯(lián)系.

近年對(duì)長(zhǎng)江口鄰近海域大規(guī)模赤潮的研究表明，營(yíng)養(yǎng)鹽濃度和構(gòu)成的變化是導(dǎo)致赤潮大規(guī)模暴發(fā)和有害藻華優(yōu)勢(shì)類群演替的重要原因. Ji 等通過(guò)分析赤潮異灣藻()藻華前后的差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，赤潮異灣藻對(duì)磷的快速吸收和對(duì)溶解性有機(jī)磷的有效利用可能促進(jìn)藻華的形成. 已有研究表明，微藻可以根據(jù)水體中磷濃度的改變，調(diào)整胞內(nèi)磷儲(chǔ)量及其代謝過(guò)程，以優(yōu)化其細(xì)胞的生長(zhǎng).

利用Droop 模型，可以計(jì)算細(xì)胞內(nèi)磷的最小配額(, the minimal cell quota for P)，以量化表征海洋微藻細(xì)胞內(nèi)磷儲(chǔ)量，并且設(shè)定為磷限制的研究條件. 有研究表明，與最大生長(zhǎng)速率和營(yíng)養(yǎng)鹽最大吸收速率相比，最小胞內(nèi)配額更易影響Droop 模型的輸出結(jié)果，且對(duì)微藻生長(zhǎng)影響較大. Baklouti 等利用以為基礎(chǔ)建立的浮游生物功能類型(PET,Plankton Functional Type)模型，從細(xì)胞內(nèi)磷配額的角度深入解釋了地中海西北部藻華的發(fā)生.

綜上，研究不同微藻細(xì)胞內(nèi)磷最小配額的差異，可以更好地了解有害藻華的形成過(guò)程. 因而，該文選擇硅藻門的三角褐指藻()和多列擬菱形藻()、定鞭藻門的球等鞭金藻()以及甲藻門的海洋原甲藻()等4 種海洋藻華代表性種類為研究對(duì)象，在磷限制條件下分析其細(xì)胞內(nèi)磷儲(chǔ)量與生長(zhǎng)速率的關(guān)系及種間差異性，探究胞內(nèi)磷的最小配額與藻類性狀的關(guān)系，以期為后續(xù)深入研究藻類生長(zhǎng)狀態(tài)與有害藻華形成機(jī)制提供支持.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用藻種三角褐指藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院海藻種質(zhì)庫(kù)，藻種編號(hào)MASCC17，分離自中國(guó)黃海海域；多列擬菱形藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，藻種編號(hào)FACHB-2584，分離自臺(tái)灣海峽；球等鞭金藻和海洋原甲藻購(gòu)自上海光語(yǔ)生物科技有限公司，分別分離自中國(guó)廈門和東海海域. 用人工海水和f/2 改良培養(yǎng)基培養(yǎng)至指數(shù)期后饑餓3 d 開(kāi)始試驗(yàn)，所有藻種均以1 000 mL 錐形玻璃瓶為培養(yǎng)容器，并將其置于光照培養(yǎng)箱(KRG-250BP，上海柏欣儀器設(shè)備廠)內(nèi)培養(yǎng)，溫度設(shè)為(20±1) ℃，光照強(qiáng)度為110 μmol/(m·s)，光暗比為12 h:12 h，每天搖動(dòng)3～4 次，每天在同一時(shí)間取樣.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

預(yù)試驗(yàn)中設(shè)計(jì)N/P 為50:1、100:1、150:1、200:1，結(jié)果表明，當(dāng)N/P 為150:1 時(shí)Droop 模型能較好地?cái)M合海洋微藻比生長(zhǎng)速率和其胞內(nèi)磷含量之間的關(guān)系，因而后續(xù)試驗(yàn)磷限制培養(yǎng)條件N/P 為150:1，即f/2改良培養(yǎng)基中NaNO濃度為75 mg/.L，NaHPO·HO濃度為0.811 mg/.L，其他營(yíng)養(yǎng)元素濃度不變.

該研究采用光密度法測(cè)定并計(jì)算微藻干質(zhì)量，以計(jì)算比生長(zhǎng)速率()；利用Droop 模型計(jì)算胞內(nèi)磷的最小配額(). 試驗(yàn)采用批次培養(yǎng)的方式，分兩個(gè)批次進(jìn)行.

a) 第一批次：確定光密度曲線. 4 種微藻的接種密度均為1×10cells/mL. 以正常f/2 改良培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)3 個(gè)平行. 每日取100 mL 搖勻后的藻液(三角褐指藻、多列擬菱形藻和球等鞭金藻，共計(jì)8 d，海洋原甲藻共計(jì)10 d)，用0.22 μm 醋酸纖維膜過(guò)濾，濾得藻樣品經(jīng)真空冷凍干燥后在恒溫干燥器中放至恒重并稱量；同時(shí)用UV755B 紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定藻液在680 nm(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明該波長(zhǎng)下微藻光密度曲線線性最佳，其＞0.9，＜0.01)下的吸光度，繪制藻液干質(zhì)量(Mass)-吸光度(Abs)標(biāo)準(zhǔn)曲線.

b) 第二批次：確定Droop 模型參數(shù). 4 種海洋單胞藻的初始接種密度均為1×10cells/mL. 以磷限制條件(N/P=150:1)培養(yǎng)，每組設(shè)3 個(gè)平行. 每天取40 mL藻液在5 000下離心10 min(共計(jì)12 d)，棄去上清液，用去離子水洗滌并再次離心、棄去上清液，如此反復(fù)3 次. 所得樣品采用鉬酸鹽分光光度法測(cè)定其胞內(nèi)磷含量(均以正磷酸鹽計(jì))，即加入4 mL 50 g/L 的過(guò)硫酸鉀后將其置于溫度為120 ℃、壓力為1.08×10Pa的高壓滅菌鍋(HVE-50，日本HIRAYAMA 公司)內(nèi)消解30 min，冷卻后加入鉬酸鹽等顯色劑，顏色穩(wěn)定后測(cè)定其在700 nm 下的吸光度. 用UV755B 紫外分光光度計(jì)測(cè)定過(guò)濾前藻液在680 nm 下的吸光度，并用顯微鏡(HFX，日本Nikon 公司)和圖像分析系統(tǒng)觀察藻類生長(zhǎng)狀態(tài)，測(cè)定細(xì)胞長(zhǎng)()、寬().

1.3 光密度曲線與Droop 模型

a) 第一批次試驗(yàn)結(jié)果. 三角褐指藻(Pt)、多列擬菱形藻(Pnm)、球等鞭金藻(Ig)、海洋原甲藻(Pm)的光密度曲線擬合結(jié)果分別為Mass=476.53×Abs、

Mass=851.23×Abs、 Mass=363.29×Abs、 Mass=1 232.84×Abs，其相關(guān)性系數(shù)均大于0.95，表明這4 種單胞藻樣品干質(zhì)量與吸光度均為顯著線性相關(guān)，所得光密度曲線可用于磷限制條件下藻類比生長(zhǎng)速率計(jì)算，其計(jì)算公式：

式中：為藻類比生長(zhǎng)速率，d；為某一時(shí)間間隔終結(jié)時(shí)的藻類生物量，μg/mL；為某一時(shí)間間隔開(kāi)始時(shí)的藻類生物量，μg/mL；—為某一時(shí)間間隔，即1 d.

b) 第二批次試驗(yàn)結(jié)果. 用Droop 模型作-1/線性分析，得到線性回歸方程.

式中：為藻類最大比生長(zhǎng)速率，d；為胞內(nèi)磷的最小配額，μg/g；為微藻胞內(nèi)磷含量(以干質(zhì)量計(jì))，μg/mg.

從式(2)可知，該回歸方程在軸的截距為藻細(xì)胞生長(zhǎng)所能達(dá)到的最大比生長(zhǎng)速率()，回歸系數(shù)為與乘積的負(fù)值，由此可知磷限制條件下4種藻的和.

1.4 細(xì)胞體積

根據(jù)Hillebrand 等方法，假設(shè)三角褐指藻、球等鞭金藻、海洋原甲藻的相似幾何形狀分別為橢圓底棱鏡、球形、橢圓體，以此計(jì)算細(xì)胞體積，計(jì)算公式：

式中：、、分別為三角褐指藻、球等鞭金藻、海洋原甲藻的細(xì)胞體積，μm；為藻細(xì)胞長(zhǎng)度，μm；為藻細(xì)胞寬度，μm；為三角褐指藻細(xì)胞中心寬度，μm；為三角褐指藻細(xì)胞最小寬度，μm；為海洋原甲藻高度，μm.

多列擬菱形藻的細(xì)胞體積計(jì)算公式根據(jù)Hillebrand 等和Lundholm 等的描述修改為

式中：為多列擬菱形藻的細(xì)胞體積，μm；為藻細(xì)胞長(zhǎng)度，μm；為藻細(xì)胞寬度，μm.

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Pearson 相關(guān)性分析，4 種微藻與、與藻細(xì)胞體積的關(guān)系. 采用線性回歸分析(linear regression analysis)構(gòu)建上述指標(biāo)之間的線性回歸方程. 在線性回歸分析前，對(duì)和藻細(xì)胞體積進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，與不做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換.

2 結(jié)果與討論

2.1 藻類胞內(nèi)磷含量隨時(shí)間的變化

如圖1 所示，4 種藻的隨時(shí)間均呈先升后降的趨勢(shì). 三角褐指藻在第2 天達(dá)(3.02±0.08) μg/mg，增加了18.43%，隨后迅速下降；多列擬菱形藻和球等鞭金藻的在第3 天分別增至(4.20±0.06)和(5.37±0.25) μg/mg，分別增加了117.62%和25.17%；其中球等鞭金藻在第4 天降至(4.88±0.23) μg/mg，而后迅速下降，多列擬菱形藻在第4 天逐漸降低；海洋原甲藻在10 d 內(nèi)逐漸增至(100.70±4.99) μg/mg 且呈S 型生長(zhǎng)趨勢(shì)，增加了319.06%，而后迅速降低. 不同微藻隨時(shí)間變化的差異可能與其生物量隨時(shí)間變化不同有關(guān).

圖 1 磷限制條件下不同海洋微藻胞內(nèi)磷含量(Q)隨時(shí)間的變化Fig.1 Temporal variation of phosphorus content in different marine microalgae (Q) under phosphorus limitation

由圖2 可知，三角褐指藻和球等鞭金藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)呈近S 型，其最大生物量分別為196.01 和126.97 μg/mL，三角褐指藻和球等鞭金藻的生物量分別增加了28 和32 倍；多列擬菱形藻和海洋原甲藻的生物量隨時(shí)間逐漸增加，分別增加了6 和3 倍，其最大生物量分別為129.10 和44.79 μg/mL.

圖 2 磷限制條件下不同海洋微藻生物量隨時(shí)間的變化Fig.2 Temporal variation in the biomass of different marine microalgae under phosphorus limitation

易文利等研究發(fā)現(xiàn)，磷限制條件下處于饑餓狀態(tài)的微藻會(huì)快速吸收并儲(chǔ)備磷，但細(xì)胞內(nèi)磷含量會(huì)隨微藻的生長(zhǎng)而逐漸降低；這可能是該試驗(yàn)中微藻出現(xiàn)先升后降的原因. 與其余3 種微藻相比，海洋原甲藻生長(zhǎng)緩慢，其生物量較低(見(jiàn)圖2)，對(duì)外部磷需求量較小，這可能導(dǎo)致海洋原甲藻胞內(nèi)磷增長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng). 與其余3 種微藻相比，海洋原甲藻的對(duì)磷限制響應(yīng)不明顯，可能與其胞內(nèi)磷儲(chǔ)量較大，對(duì)磷脅迫耐受力較強(qiáng)有關(guān). 研究表明，藻細(xì)胞的磷儲(chǔ)存能力與其對(duì)磷脅迫的耐受能力相關(guān)，并且不同微藻磷儲(chǔ)存能力的差異對(duì)種群的競(jìng)爭(zhēng)能力具有重要作用. 該文研究結(jié)果與野外調(diào)查結(jié)果類似，如中國(guó)東海長(zhǎng)江口和舟山海域連續(xù)3 年赤潮的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，在磷限制條件下，甲藻門具有比其他門類更強(qiáng)的種間競(jìng)爭(zhēng)力，這對(duì)解釋藻華的誘發(fā)和維持具有重要意義.

2.2 不同藻類Qmin 與μmax 的差異分析

磷限制條件下，4 種微藻的-1/線性曲線如圖3 所示. 4 種微藻的與呈正相關(guān). Droop 模型認(rèn)為藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與細(xì)胞配額有關(guān)，并且適用于硝酸鹽、磷酸鹽和硅酸鹽等營(yíng)養(yǎng)鹽限制條件，與該研究的結(jié)果一致. 海洋原甲藻樣品間平行性較差，可能與其個(gè)體較大、生長(zhǎng)速率慢、生物量較小有關(guān).

圖 3 磷限制條件下不同海洋微藻的Droop 模型曲線Fig.3 Droop model of different marine microalgae under phosphorus limitation

磷限制條件下，4 種微藻1/曲線擬合結(jié)果、與(以干質(zhì)量計(jì))如表1 所示. 由表1 可知，4種微藻的與1/顯著相關(guān)(＜0.01).和存在種間差異，即不同門間和差異明顯，同門不同種間和也存在較大差異. Sterner 等提出的生長(zhǎng)速率假說(shuō)認(rèn)為，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率對(duì)胞內(nèi)元素含量變化起決定性作用，即微藻的與1/存在相關(guān)性，與該研究的結(jié)果一致. 而不同藻種間與表現(xiàn)出的差異可能是因生物種類生長(zhǎng)策略的不同，或不同微藻對(duì)環(huán)境變化生理響應(yīng)的差異.

表 1 磷限制條件下不同海洋微藻的主要試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Main experimental results of different marine microalgae under phosphorus limitation

浮游植物在不同營(yíng)養(yǎng)鹽濃度中存在不同生理響應(yīng)策略. Kilham 等認(rèn)為微藻r-策略者具有較高的最大生長(zhǎng)速率和死亡率，不能長(zhǎng)時(shí)間維持種群的高密度；而k-策略者則具有較低的最大生長(zhǎng)速率和死亡率，其將資源用于非增殖性活動(dòng)中，如獲得并儲(chǔ)存資源、產(chǎn)生藻毒素、增大藻細(xì)胞體積和共生等，以保證個(gè)體的生存機(jī)會(huì)最大化. 研究表明，硅藻屬于r-策略者，具有較高的，吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于細(xì)胞增殖；海洋卡盾藻()、東海原甲藻()、鏈狀亞歷山大藻()等鞭毛藻多屬于k-策略者，其較低，對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽限制環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受能力；而這種生態(tài)策略的差異可能導(dǎo)致二者在赤潮發(fā)生過(guò)程中的種類演替. 該研究的海洋原甲藻屬于k-策略者，該藻個(gè)體較大，其主要將磷酸鹽用于非增殖性活動(dòng)中，因而小且大. 而其他3 種藻因?yàn)閭€(gè)體小而將資源主要用于細(xì)胞分裂增殖，具有較高的，是典型的r-策略者. r-策略者在營(yíng)養(yǎng)鹽較為充足時(shí)會(huì)迅速吸收資源用于生長(zhǎng)，使其胞內(nèi)磷儲(chǔ)量較低，因而三角褐指藻與球等鞭金藻高而小. 但多列擬菱形藻與之相反，其生長(zhǎng)速率較小而胞內(nèi)磷儲(chǔ)量較大，可能與Droop 模型對(duì)該藻細(xì)胞形狀的適用性較差有關(guān).

藻種間與出現(xiàn)差異的原因可能與藻細(xì)胞最適生長(zhǎng)條件及其對(duì)各理化指標(biāo)的響應(yīng)有關(guān). 與相關(guān)研究比較可知，該研究試驗(yàn)條件中除磷含量外，其他元素含量均滿足各藻種最適生長(zhǎng)條件對(duì)應(yīng)含量.但N/P 均小于最適生長(zhǎng)條件，使試驗(yàn)藻種生長(zhǎng)處于磷限制條件. 此外，與最適生長(zhǎng)條件相比，三角褐指藻和球等鞭金藻的培養(yǎng)條件與其較為相近，海洋原甲藻與其相差較大.

此外，各藻種性質(zhì)的差異也可能是、不同的原因. 已有研究顯示：球等鞭金藻生長(zhǎng)速率快，受環(huán)境影響較小；三角褐指藻和多列擬菱形藻生長(zhǎng)速率均較快，且由于其外層的硅質(zhì)外殼，在自然界中生命力較強(qiáng)；海洋原甲藻個(gè)體較大，生長(zhǎng)較緩慢. 因此，不同藻種間與出現(xiàn)較大差異.

近年來(lái)，中國(guó)近岸海域不斷爆發(fā)大規(guī)模有害藻華. 已有研究證明，長(zhǎng)江口春夏季出現(xiàn)甲藻、硅藻藻華優(yōu)勢(shì)種演替的原因是二者不同的磷競(jìng)爭(zhēng)能力. 不同藻種間和較大的差異可能是造成藻類具有不同磷競(jìng)爭(zhēng)能力的原因，也可能是不同種類微藻伴生赤潮出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的原因.

2.3 胞內(nèi)磷的最小配額Qmin 與藻種性狀差異的關(guān)系

在試驗(yàn)過(guò)程中鏡檢4 種海洋微藻的細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其與正常培養(yǎng)下的藻細(xì)胞均無(wú)明顯差異. 由此可知，磷限制不會(huì)導(dǎo)致4 種微藻形態(tài)發(fā)生明顯變化.

試驗(yàn)所用海洋微藻在性狀方面差異較大，這些差異可能反映不同種的不同. 由表2 可知，在物理性狀方面，微藻體積表現(xiàn)為海洋原甲藻＞多列擬菱形藻＞三角褐指藻＞球等鞭金藻，表現(xiàn)為海洋原甲藻＞多列擬菱形藻＞球等鞭金藻＞三角褐指藻.Edwards 等研究表明，不同種類海洋微藻的隨藻體積的增加而增加，且的差異源于細(xì)胞體積的不同. 藻細(xì)胞體積越大，具有合成磷元素功能的細(xì)胞組件的可利用空間增加，因而其越大. 該研究(也包括Edwards 等的研究，即選取相同門類藻種的文獻(xiàn)數(shù)據(jù))分析表明，藻類細(xì)胞的與細(xì)胞體積呈顯著正相關(guān)(＜0.01，R=0.82)(見(jiàn)圖4).

表 2 不同海洋微藻的物理性質(zhì)指標(biāo)Table 2 The physical properties of different marine microalgae

圖 4 藻細(xì)胞體積與Qmin 的線性關(guān)系Fig.4 The linear regression results between Qmin and cell volume

在生長(zhǎng)方面，由表1 可知，微藻表現(xiàn)為三角褐指藻＞球等鞭金藻＞多列擬菱形藻＞海洋原甲藻；而表現(xiàn)為海洋原甲藻＞多列擬菱形藻＞球等鞭金藻＞三角褐指藻. Edwards 等研究證明，海洋微藻的細(xì)胞體積與呈顯著負(fù)相關(guān)，而該試驗(yàn)的藻細(xì)胞體積與呈顯著正相關(guān)；因而，該試驗(yàn)微藻的和可能存在相關(guān)性，即較大的藻種其較小.這可能是微藻在磷限制條件下為了維持較高的生長(zhǎng)速率，利用非磷膜脂(如硫脂)代替磷脂以降低細(xì)胞內(nèi)磷含量. Yamaguchi 等研究發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)鹽濃度較低的環(huán)境中，卵圓卡盾藻()以較小的實(shí)現(xiàn)較高的細(xì)胞密度，可能是其成為日本瀨戶內(nèi)海有害藻華優(yōu)勢(shì)種的原因.

藻細(xì)胞的體積和生長(zhǎng)速率等性狀影響其對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收能力，而藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收能力與有關(guān). 該研究結(jié)果也證明，藻細(xì)胞的體積、生長(zhǎng)速率等性狀可能影響，門的差異可能對(duì)其影響較小.Edwards 等研究發(fā)現(xiàn)，微藻的不同主要源于藻體積的差異，藻門類的影響可忽略，與該研究的結(jié)果一致. 這說(shuō)明是影響微藻種間競(jìng)爭(zhēng)的因素和赤潮出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短的原因之一.

3 結(jié)論

a) 磷限制條件下，三角褐指藻、多列擬菱形藻、球等鞭金藻和海洋原甲藻的值隨時(shí)間分別增加了18.43%、117.62%、25.17%和319.06%，而后減小，且不同藻種間的變化響應(yīng)時(shí)間存在差異，響應(yīng)程度也不同.

b) 4 種微藻的與均呈顯著正相關(guān). 不同浮游植物具有不同的生長(zhǎng)策略，其對(duì)環(huán)境變化的不同生理響應(yīng)或各藻種性質(zhì)的差異可能造成和不同門間及同門不同種間的差異.

c) 4 種微藻的與藻體積均呈顯著正相關(guān)，其與可能存在一定的相關(guān)關(guān)系，即較大的藻種其較小.

d) 與藻體積、相比，門水平上的差異可能對(duì)影響較?。欢牟町惪赡苁窃斐珊Ｑ笪⒃寰哂胁煌赘?jìng)爭(zhēng)力的原因，因而在赤潮中出現(xiàn)不同微藻優(yōu)勢(shì)種演替的現(xiàn)象.