姚蔣龐，唐婧紅，肖 洋，李 祝，趙妗頤，孫 冉

(1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025；2.貴州大學 生命科學學院，貴陽 550025；3.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴陽 550003)

黑曲霉(Aspergillusniger)是生物技術(shù)應用中非常重要的微生物，具有代謝旺盛、生長迅速、發(fā)酵周期短、無毒素產(chǎn)生、菌體和發(fā)酵產(chǎn)物不危害人畜健康，不影響環(huán)境等特點[1-2]。據(jù)研究報道，黑曲霉Y-1發(fā)酵液對西甜瓜細菌性果斑病有一定的防治效果[3]，黑曲霉代謝產(chǎn)物在盆栽試驗中對番茄根結(jié)線蟲有良好的防治效果，且對水稻稻瘟病菌等真菌性病害和魔芋白絹病菌等細菌性病害均有較強的抑制作用，表現(xiàn)出較廣的抗菌譜[4-7]。李祝等[8-9]從土壤中分離出一株黑曲霉xj，研究其對細菌性根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和常見病原真菌腐霉菌(Pythiumpringsheim)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)等均有抑制作用。這些研究表明黑曲霉是一種抗菌能力強、應用前景廣闊的生防菌。

水分散片劑(WDT)是一種新型環(huán)境友好、易于生產(chǎn)加工、又利于拮抗菌存活的具廣闊發(fā)展前景的農(nóng)藥劑型，水分散片劑型避免了粉劑在施用過程中粉塵飄移污染，定量不準的缺點[10-11]。唐婧紅等[12-13]研制出黑曲霉孢子粉泡騰片劑且在盆栽試驗中其對煙草的農(nóng)藝性狀有促進作用及對煙草青枯病的防治效果達92.9%。李祝等[14]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉發(fā)酵液具有很好的拮抗青枯菌的活性、耐高溫，且在田間施用對病原菌起抑制作用等優(yōu)點，但由于其液體的性質(zhì)不宜大量貯存運輸，長期貯存不當會受到雜菌污染。

本研究以黑曲霉xj發(fā)酵浸膏為試驗材料，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗設(shè)計和中心組合試驗設(shè)計[15]對黑曲霉浸膏水分散片劑進行制備工藝優(yōu)化，并探討黑曲霉浸膏水分散片劑對植株生長及抗病防治的影響，為黑曲霉開發(fā)為微生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉(Aspergillusniger)xj：由貴州大學真菌資源研究所分離，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，CCTCC編號 M206021；供試煙草品種為云煙87。

PDA 培養(yǎng)基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂 15～20 g；PDB 培養(yǎng)基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL。

聚乙二醇6000(重慶茂業(yè)化學試劑有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(上海藍季生物)；酒石酸(上海盛思生化科技有限公司)；碳酸氫鈉(天津市永大化學試劑有限公司)；可溶性淀粉(河南圣斯德實業(yè)有限公司)；多黏類芽孢桿菌可濕性粉劑(武漢科諾生物科技股份有限公司)；SFY10液體發(fā)酵罐(江大科技有限責任公司)；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；BIOMATE 3S紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；Allegra X-30R離心機(美國BECKMAN公司)。

1.2 黑曲霉浸膏水分散片劑的制備工藝優(yōu)化1.2.1 黑曲霉浸膏的制備

取保存的黑曲霉xj菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，制備最終濃度為107個/mL黑曲霉孢子懸浮液，按體積分數(shù)2%的接種量接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min恒溫搖床培養(yǎng)48 h，制成種子液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

種子液按體積分數(shù)10%轉(zhuǎn)接到裝有80 L沙氏液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，28 ℃、150 r/min、通氣量為1.5 L/min的條件下培養(yǎng)5 d終止發(fā)酵。過濾收集發(fā)酵液和菌絲體，得到的發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃左右減壓濃縮得到黑曲霉浸膏(含水率約為59%)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黑曲霉浸膏水分散片劑(WDT)的制備工藝

將黑曲霉浸膏、酒石酸(崩解劑)、可溶性淀粉(填料)、聚乙二醇6000(潤滑劑)和聚乙烯吡咯烷酮(黏結(jié)劑)混勻烘干，再加入碳酸氫鈉(崩解劑)粉碎混勻，壓片。

1.3 單因素試驗

以黑曲霉浸膏水分散片劑崩解時間為指標，考察5個影響崩解時間的因素，得出單因素對崩解時間的變化規(guī)律，并確定5個單因素的最佳值。單因素試驗采用固定參數(shù)分別為崩解劑比例1∶1、50%崩解劑、8%潤滑劑、8%黏合劑、5%黑曲霉浸膏，因素變化范圍分別為酸堿比1∶0.5～1∶2.5、30%～80%崩解劑、1%～13%黏合劑、4%～14%潤滑劑、1%～13%黑曲霉浸膏。

1.4 響應面優(yōu)化設(shè)計試驗

1.4.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對黑曲霉浸膏質(zhì)量分數(shù)、崩解劑比例、崩解劑用量、潤滑劑用量和黏合劑用量等5個因素進行考察，每個因素選取高低2個水平，另設(shè)3個虛擬列，設(shè)計實驗次數(shù)N=12的Plackett-Burman試驗。

1.4.2 水分散粒劑最陡爬坡試驗設(shè)計

根據(jù)1.4.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果和各種因素對響應值的影響，設(shè)計最陡爬坡試驗的方向和步長。按照一定梯度改變浸膏質(zhì)量分數(shù)、崩解劑比例、崩解劑用量，通過測定崩解時間確定以上3個因素的最適添加量。

1.4.3 中心組合試驗設(shè)計

在前期試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)響應面法的中心組合試驗(central composite design, CCD)設(shè)計，選取浸膏質(zhì)量分數(shù)、崩解劑比例、崩解劑用量等3個因素，采用三因素五水平的響應面分析方法，每個試驗做3個重復，測定崩解時間。試驗因素和水平見表1。

表1 中心復合設(shè)計(CCD)響應面設(shè)計的因素及水平編碼表

1.5 黑曲霉浸膏水分散片劑質(zhì)量檢測

黑曲霉浸膏水分散片劑懸浮率測定按照GB/T 14825—2006進行，pH值測定按照GB/T 1601—1993進行檢測；分別取制成的水分散片劑在室溫條件下貯存，每隔3個月測定樣品崩解時限、pH值和懸浮率，測定時長為12個月，評估黑曲霉浸膏水分散片劑的貯藏穩(wěn)定性。

1.6 黑曲霉浸膏水分散片劑(WDT)對煙草抗病促生的田間試驗

黑曲霉浸膏水分散片劑對煙草生長試驗于2019年3月至7月在畢節(jié)、金沙地區(qū)試驗基地進行，試驗設(shè)3個處理如表2，每個處理設(shè)3個重復區(qū)組，以清水為對照。每區(qū)組60株煙株，行距1.2 m，株距0.5 m，隨機區(qū)組排列。在煙草旺長期到田間取樣，參照行業(yè)標準YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》調(diào)查其葉片數(shù)、最大葉長、葉寬、株高等農(nóng)藝性狀指標，并在煙草旺長期采集葉片，進行生理生化指標檢測。煙草田間青枯病發(fā)病情況調(diào)查，參照GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》，調(diào)查各處理的病情指數(shù)，并計算相對防效。

表2 不同處理的試驗設(shè)計

1.7 數(shù)據(jù)處理

以Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用Graphpad prism 5.0、Origin 17.0和SPSS Statistics 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉浸膏水分散片劑制備工藝優(yōu)化2.1.1 單因素試驗

黑曲霉浸膏水分散片劑在不同制備條件下崩解時間差異顯著(P<0.05)，見圖1。崩解劑比例對水分散粒劑的崩解時間具有顯著影響，當崩解比例為1∶2時，崩解時間最短，且與其他比例比較差異顯著(P<0.05)，見圖1(a)。崩解劑用量也具有顯著影響，當質(zhì)量分數(shù)為40%時，崩解時間最短，其他處理組組間差異不顯著(P>0.05)，見圖1(b)。黏合劑用量有顯著影響，質(zhì)量分數(shù)為2%時，與其他處理組對比差異顯著(P<0.05)，見圖1(c)，且黏性好，干顆粒經(jīng)過手捻能粉碎成有粗糙感的細粉，崩解時間符合農(nóng)藥劑型質(zhì)量技術(shù)指標。潤滑劑用量對水分散粒劑崩解時間具有顯著影響(P<0.05)，見圖1(d)，用量為6%時，能在壓片中有效地改善顆?；蚍勰┑牧鲃有?，所得片劑的崩解時間最短，無黏沖現(xiàn)象。黑曲霉浸膏質(zhì)量分數(shù)對水分散片劑崩解時間具有顯著影響，選取黑曲霉浸膏質(zhì)量分數(shù)為10%，考慮到水分散片劑藥用使用效果，是在允許崩解時間內(nèi)的最佳添加量，且處理組間差異均顯著(P<0.05)，見圖1(e)。

不同小寫字母表示各組數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計

表3、表4中A、B、C、D、E分別代表浸膏質(zhì)量分數(shù)、崩解劑比例、崩解劑用量、黏合劑用量、潤滑劑用量等5個因素對應的水平。5個因素中B、C 因素的可信度都大于90%以上，另外3個因素低于90%，綜合來看，各因素對黑曲霉浸膏WDT崩解時間影響的主次順序為C>B>A>E>D。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計表及其響應值

表4 Plackett-Burman試驗結(jié)果統(tǒng)計分析

2.1.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果統(tǒng)計分析，A、B、C因素相關(guān)系數(shù)為正，說明其與崩解時間呈正相關(guān)，根據(jù)上述結(jié)果，設(shè)計出最陡爬坡試驗方案及試驗結(jié)果見表5。由表5可知，各因素在第6組試驗附近取值時，崩解時間最快，因此采用崩解劑比例0.45、36%崩解劑、10%浸膏為后續(xù)響應面試驗的中心點。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

2.1.4 中心組合設(shè)計及響應面分析結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗的結(jié)果，選擇浸膏質(zhì)量分數(shù)(A)、崩解劑比例(B)、崩解劑用量(C)等3 個因素，利用中心組合試驗設(shè)計和響應面分析方法，中心組合試驗響應值結(jié)果見表6。對其進行多元回歸擬合分析得到響應值與浸膏質(zhì)量分數(shù)(A)、崩解劑比例(B)、崩解劑用量(C)如多元二次回歸方程所示：

表6 中心復合設(shè)計(CCD)響應面設(shè)計結(jié)果

Y=130.54+1.153A+2.215B+2.948C+0.35AB+1.10BC+0.90AC+11.264A2+10.892B2+9.549C2

由表7模型回歸系數(shù)方差分析可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，線性回歸系數(shù)值P<0.01，表現(xiàn)為顯著性；失擬項P=0.000>0.05，表現(xiàn)為不顯著性，表明實驗模型擬合度較好，并且復相關(guān)系數(shù)R2=97.69%，二次方程的擬合度高，自變量與響應值之間線性關(guān)系顯著，說明此模型預測結(jié)果比較準確，能較準確的分析和預測工藝條件。

表7 回歸方程的方差分析

2.1.5 各因素之間響應面交互作用分析

響應曲面圖及等高線圖直觀反映各因素及其之間的交互作用(圖2)。由響應曲面可知，隨著制備條件中浸膏質(zhì)量分數(shù)、崩解劑比例、崩解劑質(zhì)量分數(shù)的改變，響應值均呈先降后升的趨勢，由等高線圖可知三者均有最小值且在試驗范圍內(nèi)，通過對回歸方程求一階偏導數(shù)可得最佳值，即崩解劑比值為0.45 g，36%崩解劑，10%浸膏。利用優(yōu)化后的工藝進行重復驗證試驗，黑曲霉浸膏WDT崩解時間為130.2 s，與預測值136.7 s擬合度高，驗證了基于響應面法所得的優(yōu)化條件參數(shù)的可靠性，具有實用價值。

(a)黑曲霉浸膏添加量；(b)崩解劑比例；(c)崩解劑用量。

2.1.6 黑曲霉浸膏水分散片劑(WDT)的性能指標測定

研制出的黑曲霉浸膏水分散片劑懸浮率為80.56%，pH 5.71，崩解時間為130.2 s，強度適中；黑曲霉浸膏水分散片劑在室溫下儲藏12個月，懸浮率為77.16%，pH 5.56，崩解時間為143.0 s，表明黑曲霉浸膏水分散片劑在常溫下長時間儲存也可以保持較高穩(wěn)定性，各項指標均符合農(nóng)藥劑型質(zhì)量技術(shù)指標。

2.2 黑曲霉浸膏水分散片劑(WDT)應用對煙草生長的影響

由表8、表9可知，浸膏水分散片劑處理的煙草葉片數(shù)、葉長、葉寬、莖圍和株高均與清水(CK)間存在顯著差異(P<0.05)。畢節(jié)地區(qū)施用浸膏水分散片劑后旺長期的葉片數(shù)、葉長、葉寬、莖圍、株高分別比對照增加68.35%、9.54%、23.37%、66.40%和5.80%；金沙地區(qū)施用黑曲霉浸膏水分散片劑的煙草旺長期葉片數(shù)、葉長、葉寬、莖圍、株高分別比對照增加89.83%、30.18%、29.38%、97.36%和16.30%。綜上，黑曲霉浸膏水分散片劑應用于煙草有明顯的促生效果。

表8 畢節(jié)地區(qū)不同處理旺長期農(nóng)藝性狀

表9 金沙地區(qū)不同處理旺長期農(nóng)藝性狀

2.3 黑曲霉浸膏水分散片劑(WDT)對煙草青枯病的田間防治效果

由表10 可知，試驗結(jié)果表明施用黑曲霉浸膏水分散片劑對煙草青枯病的防治均有較好的效果，在清水+黑曲霉浸膏WDT處理時，防治效果為39.97%和38.9%，而黑曲霉浸膏水分散片劑的防治效果分別達到50.06%和50%，結(jié)果表明，在煙草苗床時期開始施用黑曲霉浸膏水分散片劑時達到的防治效果更好。

表10 不同處理對煙草青枯病的田間防治效果

3 討論與結(jié)論

近年來，生物菌劑加工技術(shù)的改進與創(chuàng)新是農(nóng)藥發(fā)展重要的方面，傳統(tǒng)生物菌劑劑型主要是乳油、可濕性粉劑和粉劑，其含有苯類有機溶劑及粉塵，對環(huán)境和人員造成了嚴重的污染和危害，而且田間試驗性狀表現(xiàn)極不穩(wěn)定，隨著現(xiàn)代社會對環(huán)保越來越重視，傳統(tǒng)生物菌劑劑型對環(huán)境存在一些不容忽視的影響[16-17]。農(nóng)藥水分散片劑是一種較新穎的劑型，由原藥、適宜的助劑和填料混合均勻造粒所形成的[18]，與傳統(tǒng)的劑型相比，解決了田間條件下可濕性粉劑的接觸和呼吸毒性、粉劑使用時粉塵飛揚的危害和乳油易燃問題和使用時芳烴溶劑對皮膚的接觸毒性問題；且具有運輸、使用方便，易計量且崩解快等優(yōu)點，以環(huán)境友好性、工藝簡單、生產(chǎn)設(shè)備投資費用低等優(yōu)勢，在生產(chǎn)上具有廣泛的應用前景[10]。水分散片劑的貯存穩(wěn)定性直接影響其產(chǎn)品質(zhì)量與應用效果，選擇合適助劑可以提高微生物菌劑的崩解速度和貯存穩(wěn)定[19]。馬超等[20]利用干法壓片工藝研制出21%丙草胺·二氯喹啉酸·芐嘧磺隆除草劑，入水具有優(yōu)異的崩解分散性能，篩選出其崩解劑比例為0.6；楊景涵等[21]采用直接壓片法研制10%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殺蟲劑，崩解時間短、硬度大和表面光滑，篩選出聚乙烯吡咯烷酮黏合劑6%，聚乙二醇6000 潤滑劑6%。王小兵等[22]研制出復合芽孢桿菌水分散粒劑，具有優(yōu)異的分散性能及有效防治辣椒青枯??；Wiwattanapatapee等[23]將聚乙烯吡咯酮、檸檬酸、酒石酸和碳酸氫鈉組合制備得到芽孢桿菌泡騰劑，崩解性能優(yōu)異。在我國，劑型的研究主要集中于化學農(nóng)藥的制備，而真菌微生物農(nóng)藥劑型的報道較少，本研究通過對黑曲霉浸膏水分散片劑的工藝優(yōu)化，在崩解劑比值0.45、36%崩解劑、2%黏合劑、6%潤滑劑條件下制備得到的10%黑曲霉浸膏水分散片劑，其外觀整齊、表面光滑，懸浮率80.56%，pH 5.71，崩解時間為130.2 s。且該制劑生產(chǎn)成本低，使用方便，為黑曲霉農(nóng)藥開發(fā)的產(chǎn)業(yè)化奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

通過使用微生物大量生命活動的產(chǎn)物或有效活性成分，生物菌劑可改善作物營養(yǎng)條件和生長環(huán)境，促進作物生長發(fā)育，抵抗病蟲危害，提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)[24-25]。宋志偉等[26]報道微生物制劑顯著提高草莓促生、增產(chǎn)作用；微生物菌劑施用能改善土壤性質(zhì)、防治病害及促進生長發(fā)育，提高其株高，增加單株葉片數(shù)、維生素C含量和產(chǎn)量[27-29]。本研究黑曲霉浸膏水分散片劑的施用，對煙草植株的葉片數(shù)、葉長、葉寬、莖圍和株高都有明顯的促進作用，畢節(jié)地區(qū)施用浸膏水分散片劑后旺長期的葉片數(shù)、葉長、葉寬、莖圍、株高分別比對照增加68.35%、9.54%、23.37%、66.40%和5.80%；金沙地區(qū)施用黑曲霉浸膏水分散片劑的煙草旺長期葉片數(shù)、葉長、葉寬、莖圍、株高分別比對照增加89.83%、30.18%、29.38%、97.36%和16.30%。在大田試驗中，研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉浸膏水分散片劑對煙草青枯病的防治效果達到50%以上，且有良好的抗病促生效果，且該制劑生產(chǎn)成本低，使用方便，為微生物菌劑的產(chǎn)業(yè)化奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。