鄭 蕊 郭 朋 劉 宇 孔 偉 陳 艷

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100091

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在世界范圍內(nèi)廣泛流行。持續(xù)感染HBV 可引起肝硬化、肝功能衰竭甚至誘發(fā)肝癌[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道的數(shù)據(jù)顯示，截至2015 年，全球約有2.57 億人感染HBV[2]。我國(guó)屬于HBV 中度流行區(qū)[3]。目前，我國(guó)共有HBV 感染者約8600 萬(wàn)例，人群感染HBV 流行率為5%～6%[4]。鑒于HBV 攜帶者人群規(guī)模較大，開(kāi)發(fā)一種有效抗HBV 藥物迫在眉睫。

我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥為開(kāi)發(fā)有效抗HBV 藥物提供了一個(gè)重要途徑。中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院肝病科在前輩岳美中、關(guān)茂會(huì)、尚爾壽等老先生長(zhǎng)期治療慢性乙型肝炎經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的基礎(chǔ)上，用苦參烏梅湯抗HBV 取得了良好的臨床療效。苦參烏梅湯由苦參、烏梅兩味中藥組成，多年臨床實(shí)踐證實(shí)，疏肝健脾治法加用苦參烏梅湯清熱利濕養(yǎng)陰，對(duì)乙型肝炎患者HBV 標(biāo)志物乙型肝炎E 抗原（Hepatitis Be antigen，HBeAg）、乙型肝炎病毒基因（Hepatitis B virus gene，HBVDNA）具有顯著的干預(yù)作用[5]。課題組前期工作研究發(fā)現(xiàn)，苦參烏梅湯能夠顯著抑制HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠血清中乙型肝炎表面抗原（Hepatitis Bs antigen，HBsAg）的表達(dá)[6-7]；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，其能抑制HepG 2.2.15 細(xì)胞HBsAg、HBeAg 的分泌和HBVDNA的復(fù)制[8]。盡管苦參烏梅湯抗HBV 的療效確切，但尚缺乏其藥效作用機(jī)制方面的系統(tǒng)研究。

中藥及其復(fù)方成分復(fù)雜，常通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮治療作用，傳統(tǒng)的中藥作用機(jī)制研究可以整體分析有效成分、生物靶標(biāo)及代謝物之間的相互作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)理論指導(dǎo)下衍生出的以藥物多成分、多靶點(diǎn)為切入點(diǎn)研究中藥治療疾病作用機(jī)制的研究學(xué)科[9]，代謝組學(xué)技術(shù)是以代謝物組分析為基礎(chǔ)，借助高通量檢測(cè)和多元化數(shù)據(jù)處理手段，整合多維生物信息系統(tǒng)，闡明中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制[10]。這兩種研究方法符合中醫(yī)藥系統(tǒng)性和整體性的思維模式。張?jiān)讫埖萚11]將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于解毒化瘀湯改善阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）小鼠認(rèn)知功能的機(jī)制的研究，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，解毒化瘀湯通過(guò)調(diào)控NMDA/ATPase/AMPK 信號(hào)通路上調(diào)AD 模型小鼠海馬腺苷和腸道Dorea 菌屬水平，顯著改善AD 模型小鼠的學(xué)習(xí)、記憶障礙，重塑大腦和腸道的溝通。因此，本研究基于系統(tǒng)生物學(xué)的整體觀思想，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)，探究苦參烏梅湯抑制HepG 2.2.15 細(xì)胞HBVDNA 的作用機(jī)制，為探索中藥作用機(jī)制提供研究方法和策略。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DIONEX Ultimate 3000 超高效液相色譜儀、Thermo Q Exactive 質(zhì)譜儀（Themo Fisher 公司）；十萬(wàn)分之一電子天平（XP-205 型，Mettler Toledo公司）；離心機(jī)（Allegra X-30R 型，美國(guó)Beckman 公司）；-80℃冰箱（Thermo Fisher 公司）；超純水儀（Milli-Q Advantage A10型，美國(guó)Millipore公司）；超聲波清洗器（KQ-250型，昆山市超聲儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma 3111 型，Thermo Fisher公司）。

HepG 2.2.15 細(xì)胞株（廣州吉妮歐生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（HyClone 公司）；精品胎牛血清、G418、胰酶（Solarbio 公司）；苦參飲片（批號(hào)：1806011，廠家：河北百草康神藥業(yè)有限公司）；烏梅飲片（批號(hào)：1806012，廠家：河北百草康神藥業(yè)有限公司）；乙腈（LC/MS 級(jí)，Merck 公司）、甲醇（色譜級(jí)，Merck 公司）；甲酸（色譜級(jí)，CNW 公司）；其他試劑均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 研究方法

1.2.1 苦參烏梅湯的制備

稱取苦參、烏梅飲片各400 g，加水煎煮兩次，每次30 min，煎液濾過(guò)，濾液合并，以離心半徑12 cm、3500 r/min 離心20 min，上清減壓濃縮至0.5 g/ml，再以離心半徑12 cm、20000 r/min 離心30 min，去除殘?jiān)锨逡豪鋬龈稍?，得浸膏粉（每克含生?.78 g），置干燥器中備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

配制混合高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、400 μg/ml G418、1%青霉素、鏈霉素），將HepG 2.2.15 細(xì)胞接種其中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照1×106/ml 接種于96 孔板中，每孔100 μl，培養(yǎng)箱孵育24 h；細(xì)胞貼壁后，棄上清液，給藥組分別加入含有不同藥物濃度（156、313、625、1250、2500 μg/ml）的完全培養(yǎng)基，空白組加入等量完全培養(yǎng)基，每組3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；棄上清液，每孔加入10% CCK-8 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。每個(gè)孔的吸光度值（OD）在450 nm 下測(cè)量[12]。計(jì)算細(xì)胞存活率，以最大無(wú)毒劑量應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HepG 2.2.15 細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，取出，胰酶消化2 min，棄去消化液，加培養(yǎng)液輕輕吹打。細(xì)胞數(shù)調(diào)整為6×105/ml，接種于6 孔板，每孔2 ml，37℃，5% CO2培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后，給藥組加入最大無(wú)毒劑量的藥物，空白組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集樣品。

1.2.3 樣品收集與處理

細(xì)胞培養(yǎng)完成后，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定HBVDNA 拷貝數(shù)。收集細(xì)胞，加入500 μl 含0.1%甲酸的甲醇-水（1∶1）反復(fù)吹打，超聲破碎細(xì)胞，以離心半徑13.5 cm、10 000 r/min 離心10 min 后上清液50 μl 加入450 μl 沉淀劑（甲醇∶乙腈=1∶1）沉淀蛋白，渦旋20 s，4 ℃下靜置10 min，以離心半徑13.5 cm、10 000 r/min 離心10 min 后，取5 μl 進(jìn)樣，進(jìn)行UPLC/LTQ-Orbitrap-MS 分析。

1.2.4 代謝組學(xué)檢測(cè)

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters 公司）；流動(dòng)相A 為水溶液（含2 mmol/l 甲酸銨和0.1%甲酸），B 為乙腈。梯度洗脫：0～1 min，5% B；1～5 min，5%～60% B；5～8 min，60%～100% B；8～11 min，100% B；11～14 min，100%～60% B；14～15 min，60%～5% B；15～18 min，5%B。流速0.25 ml/min，樣品室溫度保持在4℃，柱溫40℃，進(jìn)樣量5 μl。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI（±）源，負(fù)離子檢測(cè)模式，噴霧電壓2.80 kV，正離子檢測(cè)模式，噴霧電壓3.50 kV，離子傳輸管溫度350℃，S-lens 電壓50%，離子源溫度350℃，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，吹掃氣流速1 arb。

1.2.5 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

利用Trace Finder 軟件自行建立數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)UPLC/LTQ-Orbitrap-MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，獲得保留時(shí)間-質(zhì)荷比、分子量、觀察量（樣本）和峰強(qiáng)。利用Metabo-Analyst 4.0 軟件將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行過(guò)濾及歸一化后，進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA），篩選OPLS-DA 分析中VIP 值＞1 的化合物，利用MetaboAnalyst 4.0 軟件和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）網(wǎng)站進(jìn)行相關(guān)的代謝通路分析。

1.2.6 生物靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別以“苦參”“烏梅”為檢索詞，在中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索各中藥的主要活性成分，篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的活性候選成分，并獲取其相應(yīng)的靶點(diǎn)，同時(shí)刪除不含有靶點(diǎn)的活性成分。將篩選的化合物導(dǎo)入PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)，轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的SMILES 文件，并輸入到Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選其中Probability*＞0.12 的靶標(biāo)作為中藥活性成分對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)GeneCard 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取乙型肝炎相關(guān)疾病靶標(biāo)。使用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制苦參烏梅湯治療乙型肝炎的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖[13]。通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)將網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出來(lái)的核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和KEGG 通路富集分析，選擇物種“Homo sapiens”，篩選出苦參烏梅湯治療乙型肝炎的潛在信號(hào)通路。GO 富集分析包括分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）和細(xì)胞組分（cellular components，CC）三個(gè)部分。

2 結(jié)果

2.1 基于HepG 2.2.15 細(xì)胞的苦參烏梅湯抗HBV 研究

不同濃度苦參烏梅湯（156、313、625、1250、2500 μg/ml）作用于HepG 2.2.15 細(xì)胞后，細(xì)胞存活率分別為（99.2±3.7）%、（89.4±8.4）%、（78.5±5.8）%、（71.2±4.1）%和（63.5±5.0）%。與空白組比較，1250 μg/ml 組和2500 μg/ml 組細(xì)胞存活率更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)圖1A。與空白組比較，2500 μg/ml 組HBVDNA 含量更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)圖1B。因此，本研究選擇無(wú)毒劑量下具有顯著抗HBV 作用的劑量2500 μg/ml 進(jìn)行苦參烏梅湯抗HBV 作用的代謝組學(xué)研究。

圖1 苦參烏梅湯對(duì)HepG 2.2.15 細(xì)胞的細(xì)胞毒性及HBVDNA 含量的影響

2.2 苦參烏梅湯抗HBV 的代謝組學(xué)研究

PCA 分析，空白組與給藥組有效分離，且相同給藥組數(shù)據(jù)聚集性較好（圖2A）；OPLS-DA 分析（圖2B），基于VIP＞1.0，| P（corr）|≥0.5 且（P ＜0.05，| log2FC |>0）的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出組間具有顯著性差異的代謝物40 個(gè)，見(jiàn)表1。從KEGG 中得到40 種差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析（圖3），將影響值＞0.10 且-log（P）＞2 的代謝通路作為潛在的靶標(biāo)代謝通路，發(fā)現(xiàn)這些代謝物主要影響苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、鞘脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等代謝途徑。

圖2 正、負(fù)離子模式下的多元統(tǒng)計(jì)分析

圖3 差異代謝物相關(guān)代謝通路

表1 潛在生物標(biāo)志物

2.3 苦參烏梅湯抗HBV 的生物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析

苦參、烏梅中符合條件（OB≥30%，DL≥0.18）的化合物共78 個(gè)，潛在靶點(diǎn)416 個(gè)。乙型肝炎相關(guān)的靶點(diǎn)976 個(gè)，兩者取交集，最終獲得苦參烏梅湯候選活性成分的潛在治療乙型肝炎靶點(diǎn)共115 個(gè)。苦參烏梅湯治療乙型肝炎的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖4。degree 值排名前3 位的活性成分分別是kusukactone（苦參內(nèi)脂）、kosamolA（考薩莫A）、kaempferol（山奈酚），可認(rèn)為是苦參烏梅湯治療乙型肝炎的關(guān)鍵成分?？鄥趺窚委熞倚透窝椎?15 個(gè)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖5，degree 值排名前5 位的靶點(diǎn)依次為：蛋白激酶B、人體表皮生長(zhǎng)因子受體、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、腫瘤壞死因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A，可認(rèn)為是靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。GO 功能共富集到679 個(gè)條目，包括BP 2162個(gè)，主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾等方面；CC 56 個(gè)，涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等；MF 133 個(gè)，涉及蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、激素受體結(jié)合等。排在前20 位的富集條目進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖6。KEGG 通路富集分析中，P 值排名前20 位的通路主要有PI3K-Akt、乙型肝炎、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號(hào)通路，見(jiàn)圖7。

圖4 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 基因本體富集分析

圖7 京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析

3 討論

HBV 感染是病毒與宿主細(xì)胞之間進(jìn)行相互作用的復(fù)雜過(guò)程，HBV 的復(fù)制和表達(dá)依賴宿主細(xì)胞的能量和代謝過(guò)程[14-16]。本研究結(jié)果顯示，苦參烏梅湯能夠顯著抑制HepG 2.2.15 細(xì)胞分泌HBVDNA，對(duì)HepG 2.2.15 細(xì)胞代謝物具有顯著的調(diào)節(jié)作用。因此，推斷中藥干預(yù)后影響了宿主細(xì)胞的代謝，進(jìn)而抑制HBV 的表達(dá)和復(fù)制。

磷脂是組成生物膜的主要成分，參與信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。有研究表明，HBV 感染能引起小鼠肝臟中磷脂酰膽堿的組成發(fā)生改變[17]，同時(shí)，HBV 感染的HBsAg陽(yáng)性患者血清中鞘磷脂的含量顯著降低[16]，由此推斷磷脂在HBV 感染和復(fù)制及致病的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究代謝組學(xué)結(jié)果顯示，苦參烏梅湯干預(yù)HepG 2.2.15 細(xì)胞能夠顯著回調(diào)部分差異代謝物鞘磷脂的含量，調(diào)節(jié)鞘脂代謝通路。

氨基酸是蛋白質(zhì)的重要組成部分，氨基酸代謝在氨基酸的生物合成和代謝中發(fā)揮著重要作用，是細(xì)胞增殖、生存和發(fā)育的必經(jīng)途徑[18-19]。苯丙氨酸是人體必需的芳香族氨基酸之一，在正常情況下可以作為氨基酸殘基在人體組織細(xì)胞中參與合成各種蛋白質(zhì)，可在肝臟中產(chǎn)生酪氨酸，而酪氨酸可促進(jìn)某些酶、激素和神經(jīng)遞質(zhì)的分泌[20]，苯丙氨酸代謝的穩(wěn)定狀態(tài)有助于人體正常生長(zhǎng)發(fā)育和生理機(jī)能的維持[21]。本研究顯示，苦參烏梅湯干預(yù)HepG 2.2.15 細(xì)胞后，L-苯丙氨酸水平顯著降低，提示其可通過(guò)作用于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成及苯丙氨酸代謝通路發(fā)揮抗HBV 的作用。

此外，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)有蛋白激酶B、人體表皮生長(zhǎng)因子受體、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、腫瘤壞死因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A 等，所富集的關(guān)鍵相關(guān)通路為PI3K/Akt，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等功能的重要通路[22-24]，代謝組學(xué)篩選出組間具有顯著性差異的代謝物40 個(gè)，其中包括葡萄糖含量顯著改變，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果相吻合。研究表明，HBV 感染患者隨著病情的不斷發(fā)展，其肝臟損傷會(huì)不斷加重，進(jìn)而影響其機(jī)體葡萄糖代謝，容易出現(xiàn)血糖升高，誘發(fā)糖尿病[25-26]。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與代謝組學(xué)的聯(lián)用，對(duì)中藥干預(yù)的機(jī)體代謝組群進(jìn)行整合分析，更有益于揭示中藥治療疾病機(jī)制[27-29]。

綜上所述，本研究采用代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的策略，更加全面地解釋了苦參烏梅湯在抗HBV 方面的可能機(jī)制。該方法為進(jìn)一步研究中藥抗HBV 潛在的治療靶點(diǎn)提供線索，為藥物作用機(jī)制研究與闡釋提供了新思路。