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限時喂養(yǎng)對DNA疫苗免疫效果的影響

2022-06-18 09:13:12李方琳粟雨芯馬忠仁蘇君鴻
甘肅畜牧獸醫(yī) 2022年4期
關(guān)鍵詞:限時抗原紅細(xì)胞

李方琳,梁 鵬,粟雨芯,馬忠仁,蘇君鴻

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心,甘肅 蘭州 730030;2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染性疾病。流感病毒是一種高度傳染性呼吸道病原體,對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅[1]。目前預(yù)防和控制流感最為有效的措施就是接種疫苗。近年來,DNA疫苗因其免疫效果好、危險性低、操作方法簡便、價格低廉、易于貯藏和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)引起廣泛關(guān)注[2-5]。

營養(yǎng)、免疫功能和病理狀態(tài)間的作用是相互的[6-7],營養(yǎng)攝入和營養(yǎng)狀況影響宿主的免疫能力和身體對疾病或感染的反應(yīng);免疫缺陷影響營養(yǎng)利用,一些致病微生物或疾病可能引起營養(yǎng)不良和免疫缺陷,人體的生化指標(biāo)測定與飲食攝入和臨床檢查相關(guān)聯(lián),也與免疫學(xué)測量相關(guān)聯(lián)[8-9]。此外,飲食攝入量的定性和定量也參與免疫調(diào)節(jié)[10-11]。限時喂養(yǎng)(Time-restricted feeding,TRF)是將進(jìn)食限制在特定時間。最受歡迎的TRF進(jìn)食時間是8:16,意味著8 h的進(jìn)食窗口之后是16 h的空腹窗口[12-15]。有研究表明,在禁食期間腸道微生物群中與抗生素活性相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著增加,同時與宿主免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)[16]。本試驗(yàn)探討8 h進(jìn)食窗口對小鼠免疫效果的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

pcDNA3.1(+)-HA重組質(zhì)粒、小鼠淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)、RPMI-1640培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)、35 mm培養(yǎng)皿(Thermo)、200目尼龍網(wǎng)、15 ml離心管、96孔板、10 ml移液管、MTT試劑盒(Promega)、Con A及受體破壞酶RDE(Sigma)、BSA(索萊寶)、H1N1流感病毒(武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司)、1%雞紅細(xì)胞(自制)、U型血凝板。

1.2 試驗(yàn)動物

雄性SPF級BALB/c小鼠,由中國科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。試驗(yàn)期間,所用飼料為普通小鼠生長繁殖飼料,墊料為輻照木屑,飼料及墊料均購自蘇州雙獅生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 適應(yīng)階段 4周齡、體重15~20 g的BALB/c小鼠(n=24)。試驗(yàn)開始前,所有小鼠被飼養(yǎng)在溫度24.9±1.2 ℃、相對濕度50.9±7.1%、12 h的光/暗循環(huán)、無特定病原體的環(huán)境中,為期1周。適應(yīng)期間小鼠可以隨意獲取食物和飲水,為保持環(huán)境干燥、清潔,每4 d更換1次飲水與墊料。

1.3.2 試驗(yàn)階段 適應(yīng)結(jié)束后,將小鼠分為2個大組,即自由進(jìn)食組(N)和8 h限時喂養(yǎng)組(F),其中每大組又分為2個亞組,各組均經(jīng)肌肉分別注射25 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HA及同體積生理鹽水進(jìn)行免疫,即pcDNA3.1(+)-HA實(shí)驗(yàn)組(N/F-pcDNA3.1(+)-HA),對照組(N/F-Con),每籠6只。N組小鼠全天均可自由獲取食物和水。F組小鼠于初次免疫后立即進(jìn)入限時喂養(yǎng),即上午8:30喂養(yǎng)、下午4:30撤去食物,第二天上午8:30再次喂養(yǎng),如此重復(fù)30 d。2周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫,檢測小鼠指標(biāo)。以初次免疫開始記為0 w。試驗(yàn)分組如圖1所示。

圖1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3 樣本采集 以每籠為單位,F(xiàn)組每日8:30給食、下午4:30撤食,N組為前一天8:30給食,次日8:30撤去飼料,給飼料與撤飼料時均進(jìn)行稱量,二者之間的差值為小鼠每日進(jìn)食量。從初次免疫開始,每周在撤去食物之前稱量小鼠體重。

1.3.4 血清抗體檢測

1.3.4.1 分離血清。加強(qiáng)免疫2周后,采集小鼠血液,室溫放置2 h,2 000 rpm離心10 min,分離血清,-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 制備1%雞紅細(xì)胞。對成年未經(jīng)免疫的公雞翅下采血,離心洗滌數(shù)次,取紅細(xì)胞沉淀,用PBS稀釋為1%,置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.3 四個紅細(xì)胞凝集單位抗原。1個紅細(xì)胞凝集單位是指能引起等量標(biāo)準(zhǔn)化紅細(xì)胞凝集時的病毒量,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)一般采用4個紅細(xì)胞凝集單位(25 μl體積中含有4個紅細(xì)胞凝集單位的病毒量)。取一次性血凝板,每孔加入50 μl PBS,第一孔加入50 μl稀釋后的抗原,按照1:2n倍比稀釋抗原,隨后每孔加入50μl 1%雞紅細(xì)胞,室溫靜置30 min觀察結(jié)果。當(dāng)結(jié)果為第一孔++++,第二孔++,第三孔+/-,第四孔-時,則該抗原稀釋度為四個紅細(xì)胞凝集單位抗原。

1.3.4.4 去除非特異性血凝抑制素。將小鼠血清與受體破壞酶(RDE)按照1:4混合,于37 ℃恒溫過夜后,56 ℃水浴1 h,加入雞濃縮紅細(xì)胞,4 ℃放置1 h,離心,取上清備用。

1.3.4.5 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HI)。在一次性血凝板每孔加入25 μl PBS,在第1孔加入經(jīng)RDE處理過的小鼠血清或標(biāo)準(zhǔn)血清,按照1:2n倍比稀釋血清,第11孔吸出25 μl棄掉,第12孔不含血清。每孔加入25 μl四個紅細(xì)胞凝集單位抗原,輕輕混勻,室溫孵育1 h后,每孔加入1%雞紅細(xì)胞,室溫放置30 min后觀察結(jié)果。

1.3.5 脾細(xì)胞刺激 加強(qiáng)免疫2周后,BALB/c 小鼠脫頸處死,立刻泡于75%的酒精10~20 min,按照說明書分離脾臟淋巴細(xì)胞。用移液器小心吸出淋巴細(xì)胞層,轉(zhuǎn)移到新的無菌離心管中,加入10 ml 1640培養(yǎng)基洗滌,室溫下,轉(zhuǎn)速250 g離心10 min,棄上清。用含有10%胎牛血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,最后調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/ml,向96孔板中每孔加入100 μl。培養(yǎng)24 h后,分別用5 μg/ml Con A、H1N1流感病毒、2μg/ml BSA和1640培養(yǎng)基作為刺激物,各組重復(fù)5孔,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h,加入20 μl MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定每孔的OD值。數(shù)據(jù)表示為刺激指數(shù)(SI),即其余刺激孔的平均OD值除以培養(yǎng)基處理孔的平均OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲食與體重變化

通過對各組小鼠飲食與體重進(jìn)行稱量,結(jié)果顯示,限時喂養(yǎng)1周后,與N組相比,F(xiàn)組小鼠體重較低(圖2),但這種差距隨著時間的推移逐漸減小,可能是在限時喂養(yǎng)后期,小鼠逐漸適應(yīng)這種飲食模式。同時,經(jīng)過對小鼠進(jìn)食量進(jìn)行記錄統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),F(xiàn)組小鼠累計(jì)進(jìn)食量減少(圖3),可能是限時喂養(yǎng)前期F組體重較輕。

圖2 限時喂養(yǎng)對小鼠體重的影響

圖3 限時喂養(yǎng)對小鼠進(jìn)食量的影響

2.2 血清抗體檢測

使用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)對小鼠血清抗體進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,陽性對照的完全凝集孔為第9孔,F(xiàn)-pcDNA3.1(+)-HA組小鼠血清完全凝集孔為第5~6孔(圖4A),N-pcDNA3.1(+)-HA組小鼠血清完全凝集孔為第4~5孔(圖4B),表明F-pcDNA3.1(+)-HA組小鼠血清抗體效價較N-pcDNA3.1(+)-HA組高,也意味著限時喂養(yǎng)在一定程度上增強(qiáng)了小鼠的體液免疫。

圖4 小鼠血清抗體檢測

2.3 脾細(xì)胞刺激

采用MTT法檢測脾臟T細(xì)胞增殖情況,進(jìn)一步確定限時喂養(yǎng)如何影響細(xì)胞免疫。如圖5所示,F(xiàn)-pcDNA3.1(+)-HA和N-pcDNA3.1(+)-HA組對ConA以及H1N1的增殖反應(yīng)明顯強(qiáng)于F-Con組及N-Con組。F-pcDNA3.1(+)-HA對ConA以及H1N1的增殖反應(yīng)明顯強(qiáng)于N-pcDNA3.1(+)-HA,也表明限時喂養(yǎng)在一定程度上可以增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。

圖5 小鼠脾細(xì)胞增殖情況

3 討論

與N組相比,限時喂養(yǎng)4周后,無論是F-pcDNA3.1(+)-HA組還是F-Con組,累計(jì)進(jìn)食量均有所下降,但對小鼠最終的體重沒有明顯影響。注射DNA疫苗的小鼠細(xì)胞免疫均有所增強(qiáng),但F-pcDNA3.1(+)-HA組增強(qiáng)更加明顯,該結(jié)果與體液免疫結(jié)果一致。這些結(jié)果表明,TRF在一定程度上可以增強(qiáng)小鼠免疫功能。

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