李方琳，梁 鵬，粟雨芯，馬忠仁，蘇君鴻

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染性疾病。流感病毒是一種高度傳染性呼吸道病原體，對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅[1]。目前預(yù)防和控制流感最為有效的措施就是接種疫苗。近年來，DNA疫苗因其免疫效果好、危險性低、操作方法簡便、價格低廉、易于貯藏和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)引起廣泛關(guān)注[2-5]。

營養(yǎng)、免疫功能和病理狀態(tài)間的作用是相互的[6-7]，營養(yǎng)攝入和營養(yǎng)狀況影響宿主的免疫能力和身體對疾病或感染的反應(yīng)；免疫缺陷影響營養(yǎng)利用，一些致病微生物或疾病可能引起營養(yǎng)不良和免疫缺陷，人體的生化指標(biāo)測定與飲食攝入和臨床檢查相關(guān)聯(lián)，也與免疫學(xué)測量相關(guān)聯(lián)[8-9]。此外，飲食攝入量的定性和定量也參與免疫調(diào)節(jié)[10-11]。限時喂養(yǎng)（Time-restricted feeding,TRF）是將進(jìn)食限制在特定時間。最受歡迎的TRF進(jìn)食時間是8:16，意味著8 h的進(jìn)食窗口之后是16 h的空腹窗口[12-15]。有研究表明，在禁食期間腸道微生物群中與抗生素活性相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著增加，同時與宿主免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)[16]。本試驗(yàn)探討8 h進(jìn)食窗口對小鼠免疫效果的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

pcDNA3.1(+)-HA重組質(zhì)粒、小鼠淋巴細(xì)胞分離液（達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）、RPMI-1640培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清（蘭州民海生物工程有限公司）、35 mm培養(yǎng)皿（Thermo）、200目尼龍網(wǎng)、15 ml離心管、96孔板、10 ml移液管、MTT試劑盒（Promega）、Con A及受體破壞酶RDE（Sigma）、BSA（索萊寶）、H1N1流感病毒（武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司）、1%雞紅細(xì)胞（自制）、U型血凝板。

1.2 試驗(yàn)動物

雄性SPF級BALB/c小鼠，由中國科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。試驗(yàn)期間，所用飼料為普通小鼠生長繁殖飼料，墊料為輻照木屑，飼料及墊料均購自蘇州雙獅生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 適應(yīng)階段 4周齡、體重15～20 g的BALB/c小鼠（n=24）。試驗(yàn)開始前，所有小鼠被飼養(yǎng)在溫度24.9±1.2 ℃、相對濕度50.9±7.1%、12 h的光/暗循環(huán)、無特定病原體的環(huán)境中，為期1周。適應(yīng)期間小鼠可以隨意獲取食物和飲水，為保持環(huán)境干燥、清潔，每4 d更換1次飲水與墊料。

1.3.2 試驗(yàn)階段 適應(yīng)結(jié)束后，將小鼠分為2個大組，即自由進(jìn)食組（N）和8 h限時喂養(yǎng)組（F），其中每大組又分為2個亞組，各組均經(jīng)肌肉分別注射25 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HA及同體積生理鹽水進(jìn)行免疫，即pcDNA3.1(+)-HA實(shí)驗(yàn)組（N/F-pcDNA3.1(+)-HA），對照組（N/F-Con），每籠6只。N組小鼠全天均可自由獲取食物和水。F組小鼠于初次免疫后立即進(jìn)入限時喂養(yǎng)，即上午8:30喂養(yǎng)、下午4:30撤去食物，第二天上午8:30再次喂養(yǎng)，如此重復(fù)30 d。2周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，檢測小鼠指標(biāo)。以初次免疫開始記為0 w。試驗(yàn)分組如圖1所示。

圖1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3 樣本采集 以每籠為單位，F(xiàn)組每日8:30給食、下午4:30撤食，N組為前一天8:30給食，次日8:30撤去飼料，給飼料與撤飼料時均進(jìn)行稱量，二者之間的差值為小鼠每日進(jìn)食量。從初次免疫開始，每周在撤去食物之前稱量小鼠體重。

1.3.4 血清抗體檢測

1.3.4.1 分離血清。加強(qiáng)免疫2周后，采集小鼠血液，室溫放置2 h，2 000 rpm離心10 min，分離血清，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 制備1%雞紅細(xì)胞。對成年未經(jīng)免疫的公雞翅下采血，離心洗滌數(shù)次，取紅細(xì)胞沉淀，用PBS稀釋為1%，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.3 四個紅細(xì)胞凝集單位抗原。1個紅細(xì)胞凝集單位是指能引起等量標(biāo)準(zhǔn)化紅細(xì)胞凝集時的病毒量，紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)一般采用4個紅細(xì)胞凝集單位（25 μl體積中含有4個紅細(xì)胞凝集單位的病毒量）。取一次性血凝板，每孔加入50 μl PBS，第一孔加入50 μl稀釋后的抗原，按照1:2n倍比稀釋抗原，隨后每孔加入50μl 1%雞紅細(xì)胞，室溫靜置30 min觀察結(jié)果。當(dāng)結(jié)果為第一孔++++，第二孔++，第三孔+/-，第四孔-時，則該抗原稀釋度為四個紅細(xì)胞凝集單位抗原。

1.3.4.4 去除非特異性血凝抑制素。將小鼠血清與受體破壞酶（RDE）按照1:4混合，于37 ℃恒溫過夜后，56 ℃水浴1 h，加入雞濃縮紅細(xì)胞，4 ℃放置1 h，離心，取上清備用。

1.3.4.5 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）。在一次性血凝板每孔加入25 μl PBS，在第1孔加入經(jīng)RDE處理過的小鼠血清或標(biāo)準(zhǔn)血清，按照1:2n倍比稀釋血清，第11孔吸出25 μl棄掉，第12孔不含血清。每孔加入25 μl四個紅細(xì)胞凝集單位抗原，輕輕混勻，室溫孵育1 h后，每孔加入1%雞紅細(xì)胞，室溫放置30 min后觀察結(jié)果。

1.3.5 脾細(xì)胞刺激 加強(qiáng)免疫2周后，BALB/c 小鼠脫頸處死，立刻泡于75%的酒精10～20 min，按照說明書分離脾臟淋巴細(xì)胞。用移液器小心吸出淋巴細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移到新的無菌離心管中，加入10 ml 1640培養(yǎng)基洗滌，室溫下，轉(zhuǎn)速250 g離心10 min，棄上清。用含有10%胎牛血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，最后調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/ml，向96孔板中每孔加入100 μl。培養(yǎng)24 h后，分別用5 μg/ml Con A、H1N1流感病毒、2μg/ml BSA和1640培養(yǎng)基作為刺激物，各組重復(fù)5孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，加入20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定每孔的OD值。數(shù)據(jù)表示為刺激指數(shù)（SI），即其余刺激孔的平均OD值除以培養(yǎng)基處理孔的平均OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲食與體重變化

通過對各組小鼠飲食與體重進(jìn)行稱量，結(jié)果顯示，限時喂養(yǎng)1周后，與N組相比，F(xiàn)組小鼠體重較低（圖2），但這種差距隨著時間的推移逐漸減小，可能是在限時喂養(yǎng)后期，小鼠逐漸適應(yīng)這種飲食模式。同時，經(jīng)過對小鼠進(jìn)食量進(jìn)行記錄統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)組小鼠累計(jì)進(jìn)食量減少（圖3），可能是限時喂養(yǎng)前期F組體重較輕。

圖2 限時喂養(yǎng)對小鼠體重的影響

圖3 限時喂養(yǎng)對小鼠進(jìn)食量的影響

2.2 血清抗體檢測

使用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)對小鼠血清抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，陽性對照的完全凝集孔為第9孔，F(xiàn)-pcDNA3.1(+)-HA組小鼠血清完全凝集孔為第5～6孔（圖4A），N-pcDNA3.1(+)-HA組小鼠血清完全凝集孔為第4～5孔（圖4B），表明F-pcDNA3.1(+)-HA組小鼠血清抗體效價較N-pcDNA3.1(+)-HA組高，也意味著限時喂養(yǎng)在一定程度上增強(qiáng)了小鼠的體液免疫。

圖4 小鼠血清抗體檢測

2.3 脾細(xì)胞刺激

采用MTT法檢測脾臟T細(xì)胞增殖情況，進(jìn)一步確定限時喂養(yǎng)如何影響細(xì)胞免疫。如圖5所示，F(xiàn)-pcDNA3.1(+)-HA和N-pcDNA3.1(+)-HA組對ConA以及H1N1的增殖反應(yīng)明顯強(qiáng)于F-Con組及N-Con組。F-pcDNA3.1(+)-HA對ConA以及H1N1的增殖反應(yīng)明顯強(qiáng)于N-pcDNA3.1(+)-HA，也表明限時喂養(yǎng)在一定程度上可以增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。

圖5 小鼠脾細(xì)胞增殖情況

3 討論

與N組相比，限時喂養(yǎng)4周后，無論是F-pcDNA3.1(+)-HA組還是F-Con組，累計(jì)進(jìn)食量均有所下降，但對小鼠最終的體重沒有明顯影響。注射DNA疫苗的小鼠細(xì)胞免疫均有所增強(qiáng)，但F-pcDNA3.1(+)-HA組增強(qiáng)更加明顯，該結(jié)果與體液免疫結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，TRF在一定程度上可以增強(qiáng)小鼠免疫功能。