張 榮，武永淑，李 菁，安芳蘭，劉學(xué)榮

（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一種急性傳染病，主要感染偶蹄類動(dòng)物，傳播途徑多，速度快，發(fā)病率高，目前已有67%的OIE成員國流行FMD，嚴(yán)重威脅著周邊國家和地區(qū)的家畜安全及畜產(chǎn)品貿(mào)易?？谔阋邆魅胫袊螅o我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。疫苗免疫接種仍然是目前防控口蹄疫病毒感染的最有效手段和措施[2]，為有效防控傳染病和推動(dòng)畜牧業(yè)的發(fā)展提供了有力保障。目前市場(chǎng)上占主導(dǎo)地位的仍是口蹄疫滅活疫苗[3]，一些新型的疫苗也在不斷被開發(fā)和應(yīng)用[4]。佐劑是指與抗原同時(shí)使用，能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原適應(yīng)性免疫應(yīng)答能力的一類物質(zhì)[5]，是疫苗制備中至關(guān)重要的因素，能夠提高疫苗對(duì)機(jī)體的保護(hù)力，減少疫苗用量，從而降低生產(chǎn)成本[6]。目前國內(nèi)口蹄疫疫苗市場(chǎng)上應(yīng)用最廣泛的是法國SEPPIC公司的Montanide ISA 206佐劑[7-8]。國產(chǎn)佐劑規(guī)?；瘧?yīng)用的還比較少，嚴(yán)重依賴國外進(jìn)口，成本較高。中國是世界上公認(rèn)的養(yǎng)豬大國，養(yǎng)殖量約占世界總量的50%，為了降低成本，選擇一種可以代替進(jìn)口佐劑、適用于口蹄疫滅活疫苗商業(yè)化應(yīng)用的新型國產(chǎn)佐劑是口蹄疫疫苗生產(chǎn)廠家急需解決的問題。本研究通過利用3種不同佐劑與口蹄疫O型抗原（毒株）配制3組不同口蹄疫O型滅活疫苗，以ISA 206佐劑配制的疫苗作為對(duì)照組，Well佐劑和ISA 201佐劑作為試驗(yàn)組，比較評(píng)價(jià)這3組口蹄疫滅活疫苗的物理性狀、146S含量變化及對(duì)豬的免疫應(yīng)答水平，以期為口蹄疫疫苗廠家選擇佐劑提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 抗原與佐劑

抗原：口蹄疫O型滅活抗原（MYA98/OM）（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司）。

佐劑：ISA 206佐劑和ISA 201佐劑（法國SEPPIC公司），Well佐劑（南京威爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）。

1.2 儀器與試劑

粒度分析儀（布魯克海文），高速離心機(jī)（賽默飛世爾），酶標(biāo)儀（Bio-Rad），頂置式攪拌器EUROSTAR 40（IKA），口蹄疫血清抗體檢測(cè)ELISA試劑盒（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所）。

2 方法

2.1 乳化

將ISA 206佐劑、ISA 201佐劑以及Well佐劑分別于121 ℃高壓滅菌30 min，同一批次的抗原在無菌條件下分成3份各50 g，146S含量為10 μg/ml，將以上3種佐劑和抗原分別置于31 ℃水浴中恒溫30 min后，分別等質(zhì)量混合，利用EUROSTAR 40攪拌器350 r/min乳化5 min，分裝于疫苗瓶中編號(hào)待測(cè)。

2.2 物理性狀檢測(cè)

按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行性狀檢驗(yàn)[9]。

粘度檢測(cè)：在25 ℃條件下，用1 ml吸管分別吸取上述3種不同的疫苗，垂直自然流出，計(jì)算0.4 ml流出所需要的時(shí)間。

離心檢測(cè)：取10 ml疫苗于15 ml離心管中，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min。

劑型檢測(cè)：室溫下，用移液器分別吸取上述3組疫苗各1 ml，快速滴于100 ml純水表面，如果分散呈云霧狀則為水包油包水。

粒徑檢測(cè)：以PBS作為稀釋液，吸取2 μl疫苗于4 ml PBS中，吹打均勻，置于樣品槽中利用粒度分析儀檢測(cè)粒徑大小。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：將3種疫苗分別存放在4 ℃和37 ℃環(huán)境下，在15 d、30 d、45 d和60 d觀察其分層情況，并檢測(cè)疫苗中146S含量變化。

2.3 免疫動(dòng)物試驗(yàn)

將上述3種不同佐劑制備的口蹄疫滅活疫苗免疫35～45 kg的架子豬各10只，免疫劑量為0.2 ml，在免疫14 d、21 d、28 d、60 d、90 d、120 d和150 d分別進(jìn)行靜脈采血，用口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒檢測(cè)血清中抗體含量，判斷3組不同佐劑乳化的口蹄疫滅活疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的整體免疫抗體水平。

3 結(jié)果及分析

3.1 物理性狀檢測(cè)

將Well、ISA 201和ISA 206 3種不同的佐劑分別與口蹄疫滅活抗原乳化成疫苗，物理性狀檢測(cè)均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。吸取疫苗快速滴入水中，三者分散均呈云霧狀，劑型為W/O/W型，見圖1。3種疫苗的粒徑分別為247 nm、234 nm、220 nm，見圖2。離心未出現(xiàn)分層情況，粘度均在2～8 s范圍內(nèi)。

圖1 3種疫苗的劑型檢測(cè)

圖2 3種疫苗的粒徑大小

3.2 放置試驗(yàn)

將所制備的3種疫苗分別放置在4 ℃和37 ℃環(huán)境下，觀察疫苗的分層情況并檢測(cè)其146S含量變化，見表1。在4 ℃條件下，與ISA 201和Well佐劑相比，ISA 206佐劑制備的FMD滅活疫苗穩(wěn)定性較好，保存60 d 146S的降解率為31%，而ISA 201為49%，Well為65%；在37 ℃條件下，Well佐劑在45 d就降解為0，而ISA 206和ISA 201都是60 d降解為0，見圖3。

圖3 3種疫苗在不同條件下的146S含量變化

表1 不同溫度條件下3種疫苗的146S含量變化

3.3 動(dòng)物免疫效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)

將所制備的3種不同口蹄疫滅活疫苗免疫架子豬，用液相阻斷ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物血清中的抗體含量，并計(jì)算Log10（效價(jià)）對(duì)照值求平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。抗體結(jié)果如表2所示。利用GraphPad Prism軟件進(jìn)行組間多重比較，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果見圖4。試驗(yàn)結(jié)果表明，ISA 206佐劑配制的FMD滅活疫苗的平均抗體水平高于其他兩組，能顯著提高動(dòng)物血清中特異性抗體的水平。與篩選的新型佐劑相比，大規(guī)模用于獸用疫苗的ISA 206佐劑的穩(wěn)定性和免疫效價(jià)較好。

圖4 3種佐劑配制的疫苗150 d內(nèi)血清平均抗體效價(jià)消長圖

表2 3種佐劑配制的疫苗150 d內(nèi)血清平均抗體效價(jià)消長情況

4 討論及結(jié)論

新型雙相乳劑呈多相分散體系，含有內(nèi)部水滴的油滴分散成連續(xù)的水相，制備的疫苗可以同時(shí)提供抗原從外部水相的快速釋放和從內(nèi)部水相的延長釋放，能快速、持續(xù)地刺激體液免疫應(yīng)答[5]。本試驗(yàn)選擇2種雙相佐劑（Well佐劑和ISA 201佐劑）與現(xiàn)在使用的ISA 206佐劑，跟中農(nóng)威特生物科技股份有限公司同批次的FMD O型抗原進(jìn)行乳化制備疫苗，在對(duì)3種口蹄疫滅活疫苗的物理性狀如劑型、粘度、粒徑大小、離心效果及穩(wěn)定性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)后，證明3種佐劑疫苗均達(dá)到了評(píng)判的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。將制備的3種疫苗免疫動(dòng)物，分別在14 d、21 d、28 d、60 d、90 d、120 d和150 d靜脈采血，利用O型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)，結(jié)果顯示這3組疫苗都隨著免疫天數(shù)的增加，抗體水平也相應(yīng)增加，在90 d時(shí)達(dá)到最大、120 d時(shí)呈下降趨勢(shì)，其中ISA 206佐劑組抗體水平明顯高于其他兩組。以上結(jié)果表明，與ISA 201佐劑和Well佐劑相比，ISA 206佐劑在疫苗穩(wěn)定性和免疫效果方面表現(xiàn)得更好，這為進(jìn)一步篩選新型國產(chǎn)疫苗佐劑提供了數(shù)據(jù)支持。乳劑在獸用疫苗的制備中具有廣闊的市場(chǎng)前景，乳劑類佐劑的基本組成成分在自然界中是比較容易獲得的，并且價(jià)格較為低廉，作為遞送類佐劑的代表，研究適合于口蹄疫滅活疫苗商業(yè)化生產(chǎn)的國產(chǎn)佐劑，是目前口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)廠家亟待解決的問題。