龍 慧，李 明，龍家寰，黃文源，毛佳怡，段婷婷

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006)

百合(Liliumbrowniivar.viridulumBaker)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)的多年生草本植物，不僅觀賞價(jià)值較高，還兼具食用和藥用價(jià)值[1]。百合肉質(zhì)鱗片含有豐富的生物堿、淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和多種維生素及鈣、鐵等元素，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神和免疫調(diào)節(jié)的功效，主要用于治療虛煩驚悸、鎮(zhèn)咳祛痰及降膽固醇等，在食品、藥品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2-5]。對百合產(chǎn)量有影響的害蟲主要有地老虎、蠐螬、蚜蟲等，化學(xué)防治因防控成本低且防控效果佳等特點(diǎn)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治病蟲草害的主要措施，在百合上登記的殺蟲劑僅有烯啶·吡蚜酮和氯氟·噻蟲胺，但部分農(nóng)戶可能會使用其他農(nóng)藥來防治害蟲。氯蟲苯甲酰胺是具有新型鄰酰胺基苯甲酰胺類化學(xué)結(jié)構(gòu)的廣譜殺蟲劑[6]，可高效作用于靶標(biāo)害蟲的魚尼丁受體，使害蟲停止取食、肌肉收縮僵直、昏迷直至死亡，從而達(dá)到防治害蟲的效果[7]。因其殺蟲活性高、速效性好，生產(chǎn)上被廣泛用于防治鱗翅目、雙翅目和鞘翅目等害蟲[8]，在蔬菜、水果、糧食作物上具有良好的防治效果[9]。氯蟲苯甲酰胺對地老虎和蠐螬等地下害蟲具有較好防效，但長期不科學(xué)的用藥可能會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)，為保證百合的質(zhì)量安全，有必要建立快速高效的檢測方法來評價(jià)氯蟲苯甲酰胺在百合中的殘留量。

氯蟲苯甲酰胺的檢測分析方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、高效液相色譜法[11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[12-13]。QuEChERS前處理方法快速、高效、安全，被廣泛用于多種基質(zhì)中農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理[14]，目前未見采用QuEChERS-UHPLC-MS/MS測定百合上的氯蟲苯甲酰胺殘留的分析方法。本研究通過QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合UHPLC-MS/MS法，對百合中的氯蟲苯甲酰胺進(jìn)行快速有效地檢測，以期為百合質(zhì)量安全檢測及安全科學(xué)用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TSQ-Vantage超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS，美國Thermo Fisher公司)；C18色譜柱[100 mm×2.1 mm，2.1 μm，賽默飛科技(中國)有限公司]；CK2000型高通量組織研磨器(北京托摩根生物有限公司)；BSA224S-CW型電子天平(德國Sartorius公司)；ID5002C電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)；TG16-Ⅱ型臺式高速離心機(jī)(湖南平凡科技有限公司)；MS200多管渦旋混勻儀(杭州瑞誠儀器有限公司)；0.22 μm有機(jī)濾膜(美國Agela Technologies公司)。

氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(98%，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心)；分析純乙腈、無水硫酸鎂、氯化鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；分析純乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(Merck-Millipore公司)；分析純冰乙酸(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；色譜純乙腈(德國默克公司)；色譜純甲酸[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用電子天平準(zhǔn)確稱取氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.0102g(精確到0.0001g)，用色譜純乙腈分別配制成1000μg/mL的儲備液10mL，于4℃冰箱中保存。取氯蟲苯甲酰胺農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液1mL，定容至10mL得到100μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用色譜純乙腈稀釋制得相應(yīng)0.005、0.01、0.05、0.1、1、5和10μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取干百合和鮮百合樣品5.0g(精確至0.01g)于50mL離心管中，加入15mL水，渦旋1min，加入10mL 0.1%冰乙酸乙腈溶液，以1000r/min振蕩20min，加入1g氯化鈉、4g無水硫酸鎂，以1000r/min振蕩10min后，5000r/min離心5min。移取1.5mL上清液，注入含50mg PSA和150mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋2min，以5000r/min離心5min，過0.22μm有機(jī)濾膜，濾液用純凈蒸餾水1∶4(V/V)混勻至進(jìn)樣瓶中，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱(100×2.1 mm，2.1 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣盤溫度：10℃；進(jìn)樣量：25 μL；流動(dòng)相采用二元梯度洗脫，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1 %甲酸水(V/V)；流動(dòng)相及梯度洗脫條件如表1所示。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離源模式為電噴霧離子化(electrospray ionization，ESI)；離子源極性為ESI+；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(SRM)，霧化氣為氮?dú)?；鞘氣流?0 arb，輔助氣流速10 arb；噴霧電壓：3 200 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜質(zhì)量條件參數(shù)

1.5 回收率實(shí)驗(yàn)

根據(jù)美國規(guī)定氯蟲苯甲酰胺在百合上的最大殘留限量為0.3mg/kg，因此分別在干百合和鮮百合中設(shè)置3個(gè)添加水平(0.05mg/kg、0.50mg/kg、1.00mg/kg)的氯蟲苯甲酰胺，每個(gè)添加水平5次重復(fù)，采用1.3節(jié)前處理方法進(jìn)行樣品前處理，以1.4節(jié)儀器及儀器條件進(jìn)行檢測分析，計(jì)算各添加水平下的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件分析

本文使用電噴霧離子源(ESI)多反應(yīng)監(jiān)測模式分析氯蟲苯甲酰胺，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式質(zhì)譜掃描，發(fā)現(xiàn)氯蟲苯甲酰胺在正離子模式下有更高的響應(yīng)，確定待測農(nóng)藥母離子后優(yōu)化S-leans射頻電壓。碰撞能量選擇響應(yīng)最高的離子作為定性離子并優(yōu)化碰撞能量，其中響應(yīng)最高的為定量離子。得到如表2的氯蟲苯甲酰胺質(zhì)譜參數(shù)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)效應(yīng)

按照1.2節(jié)方法得到氯蟲苯甲酰胺的溶劑標(biāo)，再分別取1.0mL氮吹近干后用鮮百合和干百合空白基質(zhì)以稀釋至1.0mL；制備0.005、0.05、0.01、0.10和0.50mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；在上述儀器條件下進(jìn)行測定，以定量離子峰面積(A)與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣濃度(mg/L)為Y/X作圖，得到氯蟲苯甲酰胺在百合基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明氯蟲苯甲酰胺的進(jìn)樣濃度與峰面積在上述區(qū)間呈線性相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：氯蟲苯甲酰胺溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5275561.23x+89219.06(R2=0.9958)；鮮百合中氯蟲苯甲酰胺基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2888795.9x+14970.3(R2=0.9995)；干百合中氯蟲苯甲酰胺基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3136403.8x+24491.6(R2=0.9991)；相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，表明在0.005～0.5mg/L濃度范圍內(nèi)，氯蟲苯甲酰胺的峰面積與溶液濃度的線性關(guān)系良好，符合農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留分析要求[15]。

2.3 方法的準(zhǔn)確度、精密度與靈敏度

添加回收試驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示：氯蟲苯甲酰胺在鮮百合中的平均添加回收率在82%～100%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.01%～7.09%之間；在干百合基質(zhì)中的平均添加回收率在96%～107%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.12%～2.37%之間，添加回收準(zhǔn)確度及精密度均符合農(nóng)藥殘留分析試驗(yàn)的要求[15]。根據(jù)歐盟相關(guān)規(guī)定，以農(nóng)藥的最低添加標(biāo)濃度為定量限(LOQ)和檢出限(LOD)[16]，添加回收試驗(yàn)顯示氯蟲苯甲酰胺的LOQ和LOD均為0.05mg/kg。

表4 氯蟲苯甲酰胺在不同樣品中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實(shí)際樣品檢測

基于本研究建立的方法檢測采集自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地內(nèi)百合的氯蟲苯甲酰胺殘留，氯蟲苯甲酰胺在鮮百合、干百合中的最終殘留量均

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(QuEChERS-UHPLC-MS/MS)快速檢測百合中氯蟲苯甲酰胺殘留量的分析方法，該方法以0.1%冰乙酸乙腈為提取劑，PSA(N-丙基乙二胺)為凈化劑，試劑使用量少、成本低、高效快捷，而且準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度均能滿足殘留分析要求，可用于百合中氯蟲苯甲酰胺的殘留檢測。