梁向陽(yáng) 李春年

前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)雷尼酸鍶作為骨質(zhì)疏松治療藥物，其輔助牙周局部治療可減少破骨細(xì)胞的形成，起到抑制牙槽骨吸收的作用，同時(shí)可促進(jìn)成骨細(xì)胞的再生，起到促進(jìn)牙槽骨再形成的作用[1]。已有研究證明，骨保護(hù)蛋白OPG/ 核因子-kB 受體活化因子配體RANKL/ 核因子-kB 受體活化因子RANK 信號(hào)通路在骨的改建過(guò)程中至關(guān)重要[2,3]，在本課題前期研究的基礎(chǔ)上，擬通過(guò)比較觀察雷尼酸鍶對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎治療后牙周組織中骨代謝因子OPG、RANKL 的影響，更加深入地評(píng)估雷尼酸鍶對(duì)牙周炎大鼠的治療作用，為雷尼酸鍶輔助牙周治療提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠50 只(3 月齡，180～200g)，在標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境下喂養(yǎng)(12h 白天/ 夜晚，22±0.1℃)，飲食均為鼠糧和自來(lái)水。(以上均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003，合格證編號(hào)：1607118)。

1.2 藥物及試劑 雷尼酸鍶(Sigma 公司，美國(guó))；兔抗大鼠OPG 多克隆抗體、兔抗大鼠RANKL多克隆抗體、超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑PV9000(武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將50 只3 月齡雄性SD 大鼠隨機(jī)分為5 組(10 只/ 組)，1)正常組，2)牙周炎組，3)牙周炎局部治療組，4)牙周炎雷尼酸鍶治療組，5)牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組。采用正畸鋼絲結(jié)扎大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙頸部建立大鼠牙周炎模型。結(jié)扎4 周后，除正常組外，其余4 組各隨機(jī)抽取2 只大鼠鑒定牙周炎模型，上頜第一磨牙牙齦紅腫，牙周袋形成，牙槽骨吸收，說(shuō)明牙周炎模型建立成功。結(jié)扎8 周后，牙周炎局部治療組通過(guò)去除鋼絲、牙周袋局部上碘甘油建立牙周炎局部治療模型，牙周炎雷尼酸鍶治療組采取雷尼酸鍶400mg/ (kg·d)灌胃建立藥物治療模型，牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組去除鋼絲、牙周袋局部上藥，同時(shí)雷尼酸鍶灌胃。牙周炎局部治療和藥物治療8 周后處死所有大鼠，制作牙周組織連續(xù)切片，觀察牙周組織的改變情況；計(jì)量牙周附著喪失情況的變化；進(jìn)行免疫組化染色，觀察牙周組織中OPG、RANKL 的變化情況，評(píng)價(jià)雷尼酸鍶對(duì)牙周炎的治療效果。

1.4 組織化學(xué)切片制作與染色 將大鼠上頜骨標(biāo)本浸泡于10%福爾馬林中固定48h，流動(dòng)水沖洗，置于PH 為7 的10%乙二胺四乙酸鈉脫鈣液中，4℃脫鈣2 個(gè)月，脫鈣成功后，修剪標(biāo)本，包埋，與第一磨牙的牙體長(zhǎng)軸平行，從近遠(yuǎn)中方向連續(xù)切片，厚約5μm。HE 染色觀察牙周組織的變化。免疫組織化學(xué)染色，觀察牙周組織中OPG、RANKL 指標(biāo)的變化。

1.5 顯微鏡下組織學(xué)觀察 光鏡下觀察所有大鼠牙周組織的形態(tài)學(xué)改變及OPG、RANKL 免疫組織化學(xué)染色情況。

1.6 顯微圖象分析 在光鏡下，選取大鼠上頜第一磨牙遠(yuǎn)中根根中1/ 3 區(qū)牙齦及牙槽骨進(jìn)行測(cè)量(×400)，在該區(qū)域隨機(jī)選擇3 個(gè)部位，測(cè)量其光密度值，取平均值作為該指標(biāo)的平均光密度值(Average Optical Density，AOD)，用來(lái)評(píng)價(jià)牙槽骨的改變情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的方法進(jìn)行檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。

2.結(jié)果

2.1 牙周組織觀察 正常組：牙齦顏色基本正常，未探及牙周袋；光鏡下觀察：牙槽嵴頂形態(tài)規(guī)則。

牙周炎組：牙齦重度紅腫，探診出血，可探及深牙周袋；光鏡下觀察：結(jié)合上皮向根方增殖，牙周結(jié)締組織內(nèi)可見大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨中出現(xiàn)較多破骨細(xì)胞性骨吸收陷窩，固有牙槽骨吸收破壞(圖1)。

圖1 牙周炎組牙周形態(tài)(HE×100，黑色箭頭指示破骨細(xì)胞)

牙周炎局部治療組：牙齦輕度紅腫，探診出血，可探及牙周袋；光鏡下觀察：結(jié)締組織內(nèi)少量炎性細(xì)胞，牙槽骨破壞處可見大量的成骨細(xì)胞。

牙周炎雷尼酸鍶治療組：牙齦中度紅腫，探診出血，可探及深牙周袋；光鏡下觀察：牙周結(jié)締組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨中可見少量的破骨細(xì)胞，牙槽骨吸收處可見較多的成骨細(xì)胞。

牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組：牙齦略紅腫，探診出血，牙周袋變淺；光鏡下觀察：牙周結(jié)締組織內(nèi)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨破壞處可見較多的成骨細(xì)胞(圖2)。

圖2 牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組牙周形態(tài)(HE×100，黑色箭頭指示成骨細(xì)胞)

2.2 大鼠牙周組織中OPG 的表達(dá) OPG 的表達(dá)主要位于成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其陽(yáng)性部位為棕色或棕黃色顆粒。正常組，OPG 的表達(dá)較輕微，牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組OPG 表達(dá)均比牙周炎組表達(dá)升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組中OPG 表達(dá)明顯升高，比牙周炎組、牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組表達(dá)均明顯升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3，表1)。

圖3 大鼠牙周組織OPG 免疫組織化學(xué)染色(×400)

2.3 大鼠牙周組織RANKL 免疫組織化學(xué)染色 RANKL 的表達(dá)主要位于成纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其陽(yáng)性部位為棕色或棕黃色顆粒。正常組，RANKL 的表達(dá)較輕微，牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組RANKL 的表達(dá)均比牙周炎組表達(dá)降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，牙周炎局部治療聯(lián)合雷尼酸鍶治療組可見RANKL 的表達(dá)較少，比牙周炎組、牙周炎局部治療組和牙周炎雷尼酸鍶治療組表達(dá)均明顯降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4，表1)。

表1 各組大鼠牙周組織中OPG和RANKL表達(dá)的平均光密度值(n=10，)

表1 各組大鼠牙周組織中OPG和RANKL表達(dá)的平均光密度值(n=10，)

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，△P＜0.05；與C 組比較；#P＜0.05；與D 組比較，※P＜0.05。

圖4 大鼠牙周組織RANKL 免疫組織化學(xué)染色(×400)

3.討論

牙周炎是發(fā)生于牙周組織的慢性炎癥性疾病，是成人牙齒缺失的主要原因之一。牙槽骨吸收是牙周炎患者牙齒丟失的主要病理機(jī)制[4]。雷尼酸鍶是臨床常用的抗骨質(zhì)疏松藥物，能夠促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，有利于骨質(zhì)的形成[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型組牙槽嵴頂處骨吸收，牙槽骨中出現(xiàn)活躍的破骨細(xì)胞性骨吸收陷窩，固有牙槽骨破壞，提示牙槽骨破壞是牙周炎重要表現(xiàn)之一。HE 染色顯示牙周炎局部治療、雷尼酸鍶治療牙槽骨吸收處可見較多的成骨細(xì)胞，并且聯(lián)合治療情況明顯好于單純治療。這與陳河林等[7]研究結(jié)果相似，提示雷尼酸鍶聯(lián)合治療更有利于促進(jìn)牙周炎牙槽骨骨重建，改善預(yù)后。

牙槽骨重建是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的結(jié)果，并且破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨吸收的時(shí)間明顯短于成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨形成的時(shí)間[8]。因此，抑制牙槽骨丟失的關(guān)鍵是抑制破骨細(xì)胞的作用。RANKL 是破骨細(xì)胞活化增殖過(guò)程的關(guān)鍵分子[9]，多種刺激因素，如炎癥[10]、活性氧[11]、應(yīng)力改變[12]等可刺激細(xì)胞表達(dá)RANKL，與破骨細(xì)胞表面RANK 受體結(jié)合，激活破骨細(xì)胞活性。在本研究中，我們通過(guò)免疫組化的方法證實(shí)了，牙周炎大鼠RANKL 表達(dá)范圍增加，并且雷尼酸鍶聯(lián)合治療組RANKL 表達(dá)量明顯低于單純牙周治療及雷尼酸鍶治療組。這一點(diǎn)與Pinto 等人的研究是相似的[13]。

OPG 是一種由成骨細(xì)胞分泌的糖蛋白，其發(fā)揮作用機(jī)制一方面與膜受體RANK 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL[14]；另一方面是影響RANKL 轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜，使RANKL 留在胞內(nèi)[15]，減少RANKL/ RANK 信號(hào)，從而抑制骨破骨細(xì)胞激活。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織OPG 表達(dá)范圍明顯減少，牙周單純治療、雷尼酸鍶治療以及雷尼酸鍶聯(lián)合治療均增加了OPG 表達(dá)，并且雷尼酸鍶治療聯(lián)合治療明顯優(yōu)于單純治療，這一結(jié)果支持HE 染色發(fā)現(xiàn)牙槽骨吸收處可見較多的成骨細(xì)胞，Marins[16]等人的發(fā)現(xiàn)也支持我們的結(jié)果。

綜上所述，雷尼酸鍶能抑制牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨吸收，促進(jìn)骨重建，為今后臨床上采用牙周基礎(chǔ)治療聯(lián)合雷尼酸鍶改善牙周炎患者的預(yù)后提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。