張慧芳龔雪媛陳宗良周婷婷陳依琳

(1.金華職業(yè)技術學院醫(yī)學院，浙江 金華 321007；2.金華食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 金華 321000)

西紅花來源為鳶尾科植物番紅花(Crocus sativus L.)的干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神之功效[1]。現(xiàn)代藥理學研究表明，西紅花具有強身健體的功效。2020版《中國藥典》規(guī)定西紅花的藥用部位為柱頭。由于西紅花柱頭僅占整朵花重量的7.4%，故其產(chǎn)量極低。為獲得1kg的柱頭，需采摘約17萬朵花[2]，同時生成的去柱頭西紅花約13kg[3]。實地調查發(fā)現(xiàn)，采摘了柱頭的西紅花花瓣除一部分作為餐桌時令菜及畜禽飼料外，其余大部分都是作為廢棄物丟棄，這是對資源的極大浪費。已有學者從西紅花花瓣中分離得到類黃酮、皂苷、總黃酮、多糖等物質[4,5]，黃酮類成分是西紅花非藥用部位尤其是花瓣的主要成分，主要有山柰素及其糖苷類、槲皮素及其糖苷、花色苷類、類異鼠李素及其糖苷等[6,7]。黃酮類化合物在植物界中分布廣泛，除了抗心腦血管疾病、抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒作用外，還有抗腫瘤、保肝、降脂、抗肺纖維化等多種生理活性，受到國內外的高度重視[8-10]。查閱文獻，發(fā)現(xiàn)較少見到對西紅花花瓣中黃酮類化合物含量測定的相關報道，本試驗采用RP-HPLC法同時測定西紅花花瓣中槲皮素、山奈素2種黃酮類成分含量，為西紅花花瓣質量控制方法制訂提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

試驗材料為西紅花干燥花瓣，采自壽仙谷藥業(yè)，由金華職業(yè)技術學院技術學院醫(yī)學院陳堅波副主任中藥師鑒定，為鳶尾科植物番紅花(Crocussativus L.)的花瓣。取材時間為2021年11月23日。

1.2 儀器與試劑

Aglient1260-Ⅱ型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；XS105Du電子天平，十萬分之一，瑞士Mettler公司。

槲皮素對照品(批號：100081-201610，純度99.1%)，山奈素對照品(批號：110861-202013，純度93.2%)，均自中國食品藥品檢定研究院購置；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Eclipse XDB-C18柱(250×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液(49∶51)；檢測波長為370nm。流速為1mL·min-1；進樣量為10μL。

2.2 對照品溶液制備

取槲皮素、山奈素對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1mL含槲皮素25.901μg，含山奈素218.72μg的混合溶液，即得對照品溶液。放入冰箱中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液制備

精密稱取西紅花花瓣細粉(過40目篩)0.5g，置具塞錐形瓶中精密稱定，加甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)的混合溶液25mL，搖勻，置水浴中加熱回流30min，待冷卻至室溫后，轉移至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 保留時間的確定

將山奈素、槲皮素混合對照品溶液按2.1項色譜條件進樣分析，得到對照品及樣品色譜圖，見圖1。

圖1 西紅花花瓣樣品高效液相色譜圖

由圖1可知，西紅花花瓣供試品出現(xiàn)與混合對照品中山奈素(21.313min)、槲皮素(11.486min)保留時間一致的2個峰。

2.5 標準曲線線性范圍考察

精密吸取山奈素和槲皮素混合對照品溶液1μL、2μL、5μL、10μL、15μL和20μL進樣，按2.1色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度為橫坐標(X)，計算線性回歸方程。

槲皮素標準曲線的回歸方程：

Y=4245.9X+2.2102(r=0.9999)

山奈素標準曲線的回歸方程：

Y=3719.8X+14.476(r=0.9999)

結果表明，槲皮素在0.025～0.50μg、山奈素在0.218～4.36μg與所測得的峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗

精密吸取2.3項下制備的西紅花花瓣供試品溶液，每次10μL，連續(xù)進樣6次，測定槲皮素和山奈素色譜的平均峰面積，槲皮素含量RSD=0.70%，山奈素含量RSD=0.63%。

2.7 重復性試驗

取西紅花花瓣粉約1g，精密稱定，按2.3步驟平行制備供試品溶液6份，按2.1色譜條件分別進樣10μL，記錄槲皮素和山奈素色譜圖。計算得到槲皮素和山奈素的平均含量分別為2.06μg·g-1，21.34μg·g-1，槲皮素含量RSD=1.26%，山奈素含量RSD=0.87%。說明該方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，按2.1色譜條件進樣，記錄色譜圖，得到峰面積值。計算槲皮素含量RSD=1.71%，山奈素含量RSD=1.78%。表明室溫放置的供試品溶液在12h內穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗

稱取含量已知的西紅花花瓣粉約0.25g(槲皮素含量0.212%，山奈素含量2.134%)，精密稱定，共6份，精密加入槲皮素和山奈素對照品適量，按2.3步驟制備供試品溶液，在2.1色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，得到峰面積值，計算回收率，結果如表1所示。

表1 回收率測定

槲皮素的回收率平均為92.5%，RSD=1.28%(n=6)；山奈素的回收率平均為101.53%，RSD=1.14%(n=6)。表明上述方法的回收率符合要求，準確度良好。

2.10 樣品含量測定

按照2.3制備供試品溶液，在2.1色譜條件下，測定5份西紅花花瓣樣品中槲皮素、山奈素含量，計算槲皮素、山奈素的平均含量。結果見表2。

表2 西紅花花瓣樣品中槲皮素、山奈素含量

3 結果與分析

西紅花花瓣以黃酮類、酚酸類為主，此外，還有皂苷、生物堿和蒽醌等成分。西紅花花瓣中所含的黃酮類成分和類胡蘿卜素成分，尤其是山奈素糖苷和西紅花苷，具有良好的抗氧化能力，可開發(fā)為抗氧化產(chǎn)品。此外，西紅花花瓣中槲皮素等黃酮類成分具有較強的抗絡氨酸酶活性[6]。西紅花瓣具有良好的抗氧化活性，具有較好的開發(fā)前景，但與此相關的含量測定指標較少見諸報道。雖然在西紅花的非藥用部位中也檢測到了用來評價西紅花藥用部位(柱頭)質量的指標成分，如藏紅花苦素、西紅花苷和藏紅花醛等，但含量較低，不利于質量控制。為保證其臨床治療效果，需尋求有效檢測方法以控制其質量。

試驗發(fā)現(xiàn)，西紅花花瓣樣品不經(jīng)水解，測得的槲皮素和山奈素的含量普遍較低，這是因為槲皮素和山奈素在西紅花花瓣中多以苷的形式存在[6]。且山奈素、槲皮素都含有酚羥基，顯弱酸性，所以需用鹽酸水解的方法來提取。在對提取溶劑優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，供試品提取溶液與濃鹽酸比例達到4∶1時，提取液中的槲皮素和山奈素即可完全水解，因此，本試驗采用向20mL供試品提取液中加入5mL濃鹽酸，即甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)，作為提取溶劑提取西紅花花瓣樣品。流動相則選擇了甲醇-0.4%磷酸系統(tǒng)，因為這一系統(tǒng)對槲皮素與山奈素有較好的分離效果且峰形較好，而乙腈-0.4%磷酸和甲醇-0.2%磷酸作為流動相系統(tǒng)時，不能同時滿足峰形好且2種成分與雜質峰能很好分離的要求，故沒有選用。檢測波長則選擇了370nm，因為在此波長下，槲皮素、山奈素均具有很好的吸收圖譜，且干擾小，分離效果好。

綜上所述，西紅花花瓣所含的黃酮類成分具有顯著的藥理作用，但目前較少見到對其黃酮類成分，尤其是同時測定多種黃酮類成分含量的報道。故本試驗建立的RP-HPLC法同時測定西紅花花瓣中槲皮素、山奈素的含量，對評價西紅花花瓣的質量具有參考意義，為西紅花花瓣的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。