王 錢 ,譚貝西,馮 憶,王恬恬,趙 樂,王永輝,周 然
1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065
2.山西中醫(yī)藥大學(xué),山西 晉中 030600
腦震蕩是在應(yīng)力刺激下產(chǎn)生的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能異常表達(dá)和血管通透性增加,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元軸突損傷和胞體破裂等病理變化的一種輕度顱腦損傷。接觸性體育運動是普通人群遭受腦震蕩的主要原因之一[1-2]。隨著腦震蕩發(fā)病人數(shù)的增加及其后遺癥和對血管性癡呆[3]、帕金森[4]等疾病潛在作用的暴露,近年來對腦震蕩發(fā)病機(jī)制及治療的研究受到眾多學(xué)者的關(guān)注。
腦震寧由當(dāng)歸、丹參、川芎、地龍、地黃、牡丹皮、炒酸棗仁、柏子仁、陳皮、茯苓、竹茹組成,具有涼血活血、化瘀通絡(luò)、益血安神、寧心定智、除煩止嘔的功效,是經(jīng)多年臨床實踐研制出的山西首批名藥。臨床研究證實,腦震寧對腦外傷和顱內(nèi)血腫以及腦震蕩后出現(xiàn)的頭痛、頭暈及健忘、失眠等癥狀有良好的緩解作用[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提示腦震寧可作用于活性氧的生物合成以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions,JAK/STAT)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6]。MAPK通路在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。因此本研究以MAPK信號通路為出發(fā)點,研究腦震寧對三重腦震蕩(multiple cerebral concussion,MCC)模型大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響及機(jī)制,為腦震寧治療腦震蕩的臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。
SPF級Wistar大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(250±10)g,由北京維通利華有限公司提供,合格證號NO.110011210106224553。動物房于溫度(25±2)℃,濕度50%~60%環(huán)境下飼養(yǎng),自然晝夜節(jié)律,自由進(jìn)食飲水,保持室內(nèi)安靜。動物實驗獲得山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),嚴(yán)格執(zhí)行倫理委員會要求,審查編號為2021DW031。
腦震寧主要由地黃、牡丹皮、當(dāng)歸、丹參、川芎、炒酸棗仁、柏子仁、陳皮、竹茹、茯苓、地龍等組成,藥物比例為8∶6∶8∶15∶6∶10∶10∶10∶10∶10∶6,以上藥材均購自山西省晉中市同仁堂有限公司,經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)王永輝教授鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根(批號201202)、川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖(批號201001)、玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.干燥塊根(批號200801)、毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.的干燥根皮(批號201101)、鉅蚓科環(huán)毛屬參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)的干燥蟲體(批號201001)、唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖(批號210501)、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf的干燥菌核(批號210301)、蕓香科柑橘屬植物橘Citrus reticulataBlanco的干燥成熟果皮(批號201201)、鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子(批號200401)、禾本科植物淡竹Phyllostachys nigra(Lodd.) Munro var.henonis(Mitf.) Stapf ex Rendle的莖稈的干燥中間層(批號201001)、柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis(L.) Franco的干燥成熟種仁(批號201201),均符合《中國藥典》2020年版要求。
吡拉西坦片(批號6190608)購自東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司;白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6試劑盒購自Bioswamp公司,批號為20210810;丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(批號20211030)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(批號20211110)購自南京建成生物工程研究所;p38抗體(批號T55600F)、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)抗體(批號GB112329)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)抗體(批號T40071S)購自武漢賽維爾生物科技有限公司;磷酸化p38(phosphorylated p38,p-p38)抗體(批號BJ2147044)購自Bioss公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(批號GR3358778-6)、p-JNK抗體(批號GR3323833-2)、p-ERK抗體(批號GR3368531-3)購自英國Abcam公司;β-actin抗體(批號F813AA0021)購自上海生工生物工程有限公司公司;異氟烷(批號21061901)購自RWD公司。
EPOCH2NS型酶標(biāo)儀(美國BioTek公司);KDC-160HR型臺式高速冷凍離心機(jī)(安徽中佳公司);ImageQuant LAS型灰度分析軟件(Alpha Innotech公司);ImageQuant LAS 500型化學(xué)發(fā)光儀(Alpha Innotech公司);HT7800型透射電子顯微鏡(TEM,日立公司);R50型呼吸麻醉機(jī)(RWD公司);自制擊打儀。
腦震寧成人臨床用量為2劑/d,約合生藥148.5 g/d,大鼠給藥劑量參考《藥理實驗方法學(xué)》[7],按人和動物體表面積折算,低、中、高劑量分別設(shè)定為6.68、13.36、26.73 g/kg,分別相當(dāng)于臨床劑量的1.24、2.47、4.95倍。稱取腦震寧組方中的藥材,加入10倍體積水浸泡1 h,煎煮1 h,紗布濾過,隨后加入8倍體積水繼續(xù)煎煮1 h,合并2次濾液,分別濃縮成含生藥量0.668、1.336、2.673 g/mL的溶液,經(jīng)Q-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用測定水煎劑中主要含丹酚酸B 7.32 mg/mL、柚皮苷3.29 mg/mL、沒食子酸2.48 mg/mL、阿魏酸1.67 mg/mL、芍藥苷0.82 mg/mL、地黃苷0.15 mg/mL、綠原酸17.11 μg/mL、酸棗仁皂苷A 11.23 μg/mL、咖啡酸5.01 μg/mL、斯皮諾素0.97 μg/mL。
實驗動物按數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組和造模組,造模組大鼠每24小時使用砝碼自由落體撞擊大鼠額顳葉部[8],致單純性腦震蕩(cerebral concussion,CC)[9],連續(xù)撞擊3 d復(fù)制MCC大鼠模型。期間如果任何1次撞擊造成非單純性腦震蕩,將其剔除出模型組。對照組不進(jìn)行砝碼撞擊,其他步驟與造模組相同。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、吡拉西坦(0.16 g/kg)組和腦震寧低、中、高劑量(6.68、13.36、26.73 g/kg)組,每組8只。各給藥組ig相應(yīng)藥物(10 mL/kg),對照組和模型組ig等體積生理鹽水,2次/d,連續(xù)14 d。
分別在造模前后對大鼠進(jìn)行水迷宮水下平臺隱匿和無平臺探測實驗,根據(jù)大鼠逃避潛伏期和平臺固定象限停留時間百分比,判斷其空間學(xué)習(xí)記憶能力。
給藥結(jié)束后,取樣前大鼠禁食不禁水12 h,ip 10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg),腹主動脈取血,3500 r/min離心20 min,取上清,按試劑盒說明書檢測血清IL-1β、IL-6、MDA水平及SOD活性。
待腹主動脈取血后,開顱取腦,冰上迅速分取海馬組織,將同組海馬組織混勻,取適量組織勻漿,按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR分析。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成,引物序列見表1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
取各組大鼠海馬組織,加入裂解液提取蛋白,蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉后孵育相應(yīng)一抗和二抗,快速洗滌3次,加入ECL發(fā)光液顯影,X片曝光定影,采用Alpha軟件分析條帶灰度值。
給藥結(jié)束后,大鼠禁食不禁水12 h,ip 10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg),打開胸腔,50 mL注射器針頭自心尖搏動處直接插入主動脈弓,先后給予4 ℃生理鹽水、4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注,待灌注完畢后開顱取全腦,于4%多聚甲醛中固定48 h,進(jìn)行石蠟包埋,65 ℃烘烤60 min,二甲苯浸泡15 min,梯度乙醇浸泡2 min,于蘇木素染色液中浸染5 min,自來水浸洗,鹽酸乙醇分色,水洗,蒸餾水返藍(lán),于梯度乙醇浸泡5 s,無水乙醇浸泡1 min,二甲苯浸泡2 min透明,中性樹膠封片,于顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元病理變化。
取“2.7”項下石蠟切片,沖洗后,滴加1%甲苯胺藍(lán)水溶液,37 ℃浸染25 min,蒸餾水沖洗,95%乙醇分化30 s,于梯度乙醇中脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,于顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元尼氏體的顏色變化,并用Image J軟件統(tǒng)計海馬CA1區(qū)3張不同位置的神經(jīng)元數(shù)量變化。
取“2.5”項下大鼠海馬組織,切成0.5 mm×3 mm的組織切塊,2.5%戊二醛固定,0.1 mol/L PBS溶液浸洗;1%鋨酸繼續(xù)固定30 min,PBS溶液再次浸洗;梯度乙醇脫水,于環(huán)氧丙烷中浸泡5 min,于環(huán)氧丙烷與Epon812包埋混合液浸泡30 min;37 ℃下于純Epon812包埋液浸透30 min,加入包埋劑,100 ℃包埋聚合1 h;醋酸鈾染液避光浸染20 min,水洗30 min;枸櫞酸鉛染液浸染5 min,水洗30 min;采用TEM觀察海馬組織神經(jīng)元及線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。
如圖1和表2所示,在隱匿平臺實驗中,與對照組相比,模型組大鼠運動速度減慢(P<0.05),潛伏期時間明顯增加(P<0.01);與模型組相比,各給藥組大鼠運動速度明顯加快(P<0.05),潛伏期時間明顯降低(P<0.05、0.01);與吡拉西坦組相比,腦震寧低劑量組大鼠運動速度加快(P<0.05),潛伏期時間降低(P<0.05),腦震寧中劑量組大鼠運動速度加快(P<0.05),潛伏期時間無明顯差異。在無平臺實驗中,與對照組相比,模型組大鼠所在平臺時間百分比明顯下降(P<0.01);與模型組相比,各給藥組大鼠所在平臺時間百分比均明顯上升(P<0.05、0.01);與吡拉西坦組組相比,腦震寧低、中劑量組大鼠所在平臺時間百分比均上升(P<0.05)。
表2 腦震寧對MCC模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 ( , n = 6)Table 2 Effect of Naozhenning on learning and memory of MCC rats model ( , n = 6)
表2 腦震寧對MCC模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 ( , n = 6)Table 2 Effect of Naozhenning on learning and memory of MCC rats model ( , n = 6)
與對照組比較:#P<0.05 ##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05 **P<0.01;與吡拉西坦組比較:△P<0.05 △△P<0.01,下表同#P < 0.05 ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group; △P < 0.05 △△P < 0.01 vs piracetam group, same as below tables
組別 劑量/(g·kg?1) 運動速度/(m·s?1) 潛伏期/s 所在平臺百分比/%對照 — 67.25±7.83 19.94±1.83 58.66±7.77模型 — 17.49±2.00# 53.33±6.59## 8.94±3.42##吡拉西坦 0.16 23.62±2.74* 38.72±3.12* 23.13±5.84**腦震寧 6.68 46.55±4.20*△ 24.60±4.93**△ 33.89±4.01**△13.36 33.62±2.82*△ 33.31±7.31* 31.03±4.91**△26.73 23.51±2.67* 38.68±7.00* 20.43±3.61*
圖1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶的軌跡圖Fig.1 Trajectories of learning and memory of rats in each group
如表3所示,與對照組相比,模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、MDA水平顯著升高(P<0.05、0.01),SOD活性顯著降低(P<0.01);與模型組相比,各給藥組大鼠血清中IL-6、MDA水平均顯著降低(P<0.05、0.01),吡拉西坦組和腦震寧低、中劑量組大鼠血清中IL-1β水平顯著降低(P<0.05、0.01),SOD活性升高(P<0.01、0.001);與吡拉西坦組相比,腦震寧中劑量組大鼠血清中IL-1β水平升高(P<0.05),SOD活性升高(P<0.05),MDA水平降低(P<0.05);腦震寧高劑量組大鼠血清中MDA水平升高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.01)。
表3 腦震寧對MCC模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、MDA水平和SOD活性的影響 ( , n = 6)Table 3 Effect of Naozhenning on IL-1β, IL-6, MDA levels and SOD activity in serum of MCC rats model (, n = 6)
表3 腦震寧對MCC模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、MDA水平和SOD活性的影響 ( , n = 6)Table 3 Effect of Naozhenning on IL-1β, IL-6, MDA levels and SOD activity in serum of MCC rats model (, n = 6)
組別 劑量/(g·kg?1) IL-1β/(pg·mL?1) IL-6/(pg·mL?1) SOD/(U·mL?1) MDA/(nmol·mL?1)對照 — 77.20±1.68 125.38±8.46 165.94±1.84 4.56±0.29模型 — 117.55±4.09## 144.78±2.41# 107.96±3.42## 12.05±0.72##吡拉西坦 0.16 82.73±8.02** 128.23±4.29* 135.09±0.85** 5.79±0.43**腦震寧 6.68 88.54±4.96** 120.85±7.79** 130.98±4.86*** 5.43±0.14**13.36 91.12±7.16*△ 124.29±8.83* 145.11±5.28**△ 4.91±0.29**△26.73 95.51±8.82 125.31±12.26* 113.08±3.51△△ 7.54±0.14**△
如表4所示,與對照組相比,模型組大鼠海馬組織p38、JNK和ERKmRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01);與模型組相比,各給藥組大鼠海馬組織p38、JNK和ERKmRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05、0.01);與吡拉西坦組相比,腦震寧中、高劑量組大鼠海馬組織p38mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05、0.01),JNKmRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);腦震寧低、中劑量組大鼠海馬組織ERKmRNA表達(dá)水平升高(P<0.01)。
表4 腦震寧對MCC模型大鼠海馬組織p38、JNK和ERK mRNA表達(dá)的影響 ( , n = 6)Table 4 Effect of Naozhenning on p38, JNK and ERK mRNA expressions in hippocampus of MCC rats model (, n = 6)
表4 腦震寧對MCC模型大鼠海馬組織p38、JNK和ERK mRNA表達(dá)的影響 ( , n = 6)Table 4 Effect of Naozhenning on p38, JNK and ERK mRNA expressions in hippocampus of MCC rats model (, n = 6)
組別 劑量/(g·kg?1) mRNA相對表達(dá)量p38 JNK ERK對照 — 0.61±0.03 0.53±0.01 0.49±0.03模型 — 0.89±0.01## 0.99±0.06## 0.74±0.03##吡拉西坦 0.16 0.68±0.02* 0.67±0.01** 0.56±0.01**腦震寧 6.68 0.72±0.03* 0.70±0.01** 0.67±0.01*△△13.36 0.57±0.05*△△ 0.75±0.02**△ 0.65±0.01**△△26.73 0.61±0.02*△ 0.79±0.01**△ 0.54±0.01**
如圖2和表5所示,與對照組相比,模型組大鼠海馬組織p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05、0.01),p-p38/p38降低(P<0.05),p-JNK/JNK和p-ERK/ERK升高(P<0.01);與模型組相比,各給藥組海馬組織p38、p-p38和p-ERK蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05、0.01),p-JNK/JNK升高(P<0.01);吡拉西坦組和腦震寧低、中劑量組海馬組織JNK和ERK蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05、0.01);腦震寧低、高劑量組p-p38/p38升高(P<0.01);吡拉西坦組和腦震寧中、高劑量組海馬組織p-JNK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),p-ERK/ERK降低(P<0.05、0.01)。
表5 腦震寧對MCC模型大鼠海馬組織p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響 ( , n = 6)Table 5 Effect of Naozhenning on p38, p-p38, JNK, p-JNK, ERK and p-ERK protein expressions in hippocampus of MCC rats model ( , n = 6)
表5 腦震寧對MCC模型大鼠海馬組織p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響 ( , n = 6)Table 5 Effect of Naozhenning on p38, p-p38, JNK, p-JNK, ERK and p-ERK protein expressions in hippocampus of MCC rats model ( , n = 6)
組別 劑量/(g·kg?1) 蛋白相對表達(dá)量p-p38 p38 p-p38/p38 p-JNK JNK對照 — 0.61±0.02 1.18±0.01 0.52±0.01 0.46±0.01 1.30±0.01模型 — 0.64±0.01## 1.41±0.02# 0.46±0.00# 0.58±0.01## 1.55±0.01#吡拉西坦 0.16 0.53±0.01** 1.17±0.02* 0.45±0.01 0.69±0.01** 1.43±0.01#*腦震寧 6.68 0.76±0.01**△△ 0.79±0.06**△△ 0.96±0.06**△△ 0.62±0.01 1.31±0.01*△13.36 0.49±0.01**△△ 1.06±0.10**△ 0.46±0.03 0.85±0.02**△△ 1.39±0.07*26.73 0.58±0.01**△△ 0.74±0.02**△ 0.79±0.01**△△ 0.73±0.01**△ 1.57±0.01△組別 劑量/(g·kg?1) 蛋白相對表達(dá)量p-JNK/JNK p-ERK ERK p-ERK/ERK對照 — 0.35±0.01 0.56±0.01 1.27±0.01 0.46±0.01模型 — 0.39±0.01# 0.91±0.01## 1.36±0.01# 0.67±0.00##吡拉西坦 0.16 0.49±0.01** 0.70±0.02** 1.25±0.01** 0.53±0.01**腦震寧 6.68 0.47±0.01** 0.78±0.01**△△ 1.07±0.05**△ 0.68±0.04△△13.36 0.59±0.04**△△ 0.79±0.01**△△ 1.29±0.02* 0.60±0.00*△26.73 0.46±0.01** 0.53±0.01**△△ 1.37±0.02△△ 0.39±0.00**△△
圖2 腦震寧對MCC模型大鼠海馬組織p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Naozhenning on p38, p-p38, JNK, p-JNK, ERK and p-ERK protein expressions in hippocampus of MCC rats model
如圖3所示,對照組大鼠海馬神經(jīng)元排列整齊緊密,染色清晰,形態(tài)完整,核大而圓,著色淺,胞核與胞質(zhì)界限清晰可見;模型組神經(jīng)元排列明顯稀疏,數(shù)量減少,部分細(xì)胞核消失或核仁破裂,胞質(zhì)內(nèi)混濁;吡拉西坦組神經(jīng)元排列較稀疏,核大而圓,著色淺,少部分細(xì)胞出現(xiàn)核仁消失、胞質(zhì)混濁;腦震寧低劑量組神經(jīng)元排列較稀疏,大部分細(xì)胞形態(tài)較完整,核大而圓,著色淺,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核仁消失;腦震寧中劑量組神經(jīng)元排列稀疏分散,大部分細(xì)胞核不明顯,胞質(zhì)混濁不清晰,部分混濁;腦震寧高劑量組細(xì)胞排列明顯稀疏分散,數(shù)量減少,大部分細(xì)胞核偏移,胞質(zhì)邊界不清晰,部分細(xì)胞出現(xiàn)溶解。
圖3 腦震寧對MCC模型大鼠海馬神經(jīng)元變化的影響 (×400)Fig.3 Effect of Naozhenning on hippocampal neurons changes in MCC rats model (× 400)
如圖4所示,對照組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體清晰可見,呈深藍(lán)色顆粒狀或斑塊狀;模型組神經(jīng)元尼氏體顏色變淺且尼氏體數(shù)量明顯減少;吡拉西坦組神經(jīng)元尼氏體顏色深藍(lán),少數(shù)細(xì)胞尼氏體顏色變淺;腦震寧組隨劑量增加,尼氏體顏色逐漸變淺,數(shù)量減少,尤其是腦震寧高劑量組,大多數(shù)神經(jīng)元尼氏體變淺明顯。如表6所示,與對照組相比,模型組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P<0.01);與模型組相比,各給藥組神經(jīng)元數(shù)量均明顯增加(P<0.01);與吡拉西坦組相比,腦震寧中、高劑量組神經(jīng)元數(shù)量減少(P<0.05、0.01)。
圖4 腦震寧對MCC模型大鼠海馬神經(jīng)元尼氏體的影響 (×400)Fig.4 Effect of Naozhenning on Nissl body of hippocampal neurons in MCC rats model (× 400)
表6 腦震寧對三重腦震蕩模型大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量的影響( , n = 3)Table 6 Effect of Naozhenning on number of hippocampal neurons in MCC rats model ( , n = 3)
表6 腦震寧對三重腦震蕩模型大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量的影響( , n = 3)Table 6 Effect of Naozhenning on number of hippocampal neurons in MCC rats model ( , n = 3)
組別 劑量/(g·kg?1) 神經(jīng)元數(shù)目對照 — 126.67±4.19模型 — 79.67±4.64##吡拉西坦 0.16 104.67±2.05**腦震寧 6.68 101.00±2.16**13.36 99.00±2.94**△26.73 94.33±4.26**△△
如圖5所示,對照組神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓,細(xì)胞核膜完整,核仁可見,線粒體呈圓形或橢圓形,內(nèi)嵴清晰可見,軸索形態(tài)規(guī)則,髓鞘板層呈同心圓致密排列,軸膜清晰,緊貼內(nèi)層髓鞘,軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲及微管排列緊密,線粒體結(jié)構(gòu)清晰(圖5-A1、A2、A3);模型組神經(jīng)元細(xì)胞體積縮小,核膜皺縮,核仁破裂分散(圖5-B1),線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)基本清晰可見(圖5-B2),髓鞘板層嚴(yán)重分離,局部崩解、斷裂,軸漿內(nèi)線粒體模糊不清(圖5-B3);吡拉西坦組神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓,核膜完整,核仁破裂(圖5-C1),線粒體偏圓形,內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)模糊,個別腫脹有空泡(圖5-C2),軸索髓鞘板層排列模糊,板層局部崩解,軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲及微管排列疏松,線粒體結(jié)構(gòu)模糊,部分空泡化(圖5-C3);腦震寧低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞核大而偏橢圓,核膜完整,核仁偏移(圖5-D1),線粒體呈細(xì)長,內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)清晰可見(圖5-D2),軸索髓鞘板層排列模糊,板層部分崩解、斷裂,軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲及微管排列疏松,線粒體結(jié)構(gòu)模糊且空泡化(圖5-D3);腦震寧中劑量組神經(jīng)元體積縮小,細(xì)胞核膜稍完整,核仁破裂分散(圖5-E1),線粒體腫脹變形有空泡,內(nèi)嵴清晰可見(圖5-E2),軸索髓鞘板層模糊,大部分出現(xiàn)分離崩解及斷裂,軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲及微管排列緊密,線粒體結(jié)構(gòu)紊亂,空泡化(圖5-E3);腦震寧高劑量組神經(jīng)元體積縮小,核仁固縮偏移(圖5-F1),線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)模糊(圖5-F2),軸索髓鞘板層排列廣泛分離,大部分板層崩解、斷裂明顯,軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲無明顯排列,線粒體模糊且結(jié)構(gòu)溶解(圖5-F3)。
圖5 腦震寧對MCC模型大鼠海馬神經(jīng)元及軸突超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of Naozhenning on ultrastructure of hippocampal neurons and axons in MCC rats model
腦震蕩中醫(yī)分型主要有氣虛痰瘀、心腎不交、瘀血內(nèi)阻、肝郁痰瘀、腎虛痰瘀,其中痰瘀阻竅是腦震蕩的核心病機(jī)。腦震蕩因外力刺激導(dǎo)致瘀血阻滯頭部,氣機(jī)運行受阻,進(jìn)而導(dǎo)致痰瘀阻竅,從而引起一過性的眩暈、昏迷、記憶缺失、惡心、嘔吐等癥狀。因此腦震寧以當(dāng)歸、丹參、川芎、地龍活血止痛、化瘀通絡(luò)為主,配伍地黃、牡丹皮清熱涼血,炒酸棗仁、柏子仁養(yǎng)血安神、寧心定志,并佐以陳皮、茯苓、竹茹和胃降逆、化痰止嘔。臨床研究證實腦震寧可以緩解顱內(nèi)血腫及頭暈、頭痛、失眠等臨床癥狀[5]。動物實驗證實腦震寧能緩解小鼠疼痛并延長睡眠時間[10]。在水迷宮實驗中,潛伏時間反映學(xué)習(xí)能力,所在象限停留時間百分比反映記憶能力,學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)潛伏時間值越低,記憶能力越好,所在象限停留時間百分比值越高。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠平均運動速度降低,平臺潛伏期時間延長,所在象限停留時間百分比下降,提示模型組可能出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶能力的受損。此外,模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6炎性因子水平較對照組明顯升高,氧化產(chǎn)物MDA水平增加,SOD活性降低,p38、JNK、ERK蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平較對照組均有不同程度地增加,且尼氏染色顯示海馬神經(jīng)元尼氏體顏色變淺,神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,TEM結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞體積縮小,核仁破裂分散,微管及微絲崩解、斷裂。以上結(jié)果提示模型組大鼠海馬神經(jīng)元及線粒體也出現(xiàn)明顯受損情況。
MAPK信號通路主要由p38、ERK和JNK 3條通路組成,參與調(diào)控細(xì)胞生長、分裂、分化、死亡等各個階段的生理、病理活動。MAPK通路由各種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)刺激激活,包括肽生長因子、細(xì)胞因子、激素和氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等各種細(xì)胞應(yīng)激。當(dāng)腦組織出現(xiàn)損傷時,MAPK信號通路激活,MAPK激酶通過磷酸化活化下游調(diào)節(jié)蛋白p38、ERK和JNK。激活的p38通過調(diào)控炎性因子的表達(dá),影響腦組織炎癥的同時,使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),當(dāng)予以p38特異性抑制劑干預(yù)后,IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6等表達(dá)下降以及氧化應(yīng)激反應(yīng)也隨之減輕[11]。本研究結(jié)果顯示,腦震寧組IL-1β、IL-6等炎性因子水平明顯較模型組降低,p38總蛋白、p-p38蛋白及mRNA表達(dá)也出現(xiàn)不同程度的降低,且腦震寧低、高劑量組比值也降低,說明腦震寧通過抑制p38通路的激活影響MCC模型大鼠神經(jīng)元損傷,其中通過抑制p38通路的激活從而發(fā)揮抑炎作用以腦震寧中劑量組效果最佳。p38通路還可以活化JNK信號通路,加劇炎性反應(yīng),抑制線粒體呼吸鏈,增加MDA水平,降低SOD活性,促進(jìn)氧化損傷或細(xì)胞凋亡,本研究中模型組JNK及p-JNK蛋白表達(dá)較對照組增加,給予腦震寧后不同劑量組JNKmRNA表達(dá)逐漸降低,JNK總蛋白表達(dá)較模型組減少,p-JNK蛋白隨劑量增加逐漸增多,吡拉西坦、腦震寧低、中、高劑量組比值均降低,這些提示腦震寧可能通過作用JNK信號通路影響MCC模型大鼠海馬神經(jīng)元的損傷,其中p-JNK蛋白含量雖隨劑量明顯增加,但腦震寧低、中劑量組JNK總蛋白較模型組明顯降低,說明腦震寧可能在加劇JNK蛋白磷酸化的同時也控制了JNK總蛋白的含量,從而減輕海馬神經(jīng)元的損傷,也進(jìn)一步提示腦震寧的治療作用可能受劑量的反向調(diào)節(jié)。此外,ERK信號通路的激活可以通過炎性因子介導(dǎo)細(xì)胞損傷,從而加劇軸索損傷[12]。本研究中腦震寧低、中劑量組ERK總蛋白和各劑量組p-ERK蛋白及mRNA表達(dá)均比模型組降低,高劑量組ERK總蛋白表達(dá)與模型組無明顯差異,腦震寧中、高劑量組比值均升高,腦震寧低劑量組比值降低,同時病理、電鏡結(jié)果顯示神經(jīng)元、線粒體、軸索的損傷隨給藥劑量的增加逐漸加重。以上結(jié)果提示腦震寧可能通過抑制ERK信號通路的激活改善神經(jīng)元損傷,尤其以低劑量組效果佳。但是,也有研究發(fā)現(xiàn)ERK通路激活在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起保護(hù)作用[13],而激活ERK信號通路可以保護(hù)海馬神經(jīng)元的凋亡[14]。因此,ERK信號通路激活以及腦震寧在MCC模型大鼠發(fā)展過程中對機(jī)體是損傷亦或保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究。p38以及JNK、ERK參與下的MAPK信號通路,可能在腦震蕩發(fā)生過程中介導(dǎo)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致腦內(nèi)慢性神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元功能的喪失,而給予腦震寧治療后,炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)得到抑制,神經(jīng)元及其微管的損傷亦隨之得到改善。
綜上所述,腦震寧通過減輕炎癥、降低氧化應(yīng)激反應(yīng),改善MCC模型大鼠海馬神經(jīng)元損傷,其機(jī)制與抑制MAPK信號通路的激活相關(guān)。
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