何炳恩 龔湘君

從光學(xué)顯微鏡到電子顯微鏡，人類觀察微觀世界的努力從未停下過腳步。光學(xué)顯微技術(shù)作為一種快速無損的表征方法，可獲得微米尺度觀察對象的圖像信息，應(yīng)用范圍極為廣泛；電子顯微鏡則以高速運動的電子為介質(zhì)，通過電子束“看清”更小的觀測樣品。但無論是光學(xué)顯微鏡還是電子顯微鏡，獲得的都只是平面圖像。數(shù)字全息顯微鏡是一種新型的光學(xué)三維成像途徑。

從火把到電燈，人類利用光的身影始終出現(xiàn)在文明的發(fā)展歷程中。但對光本質(zhì)的認(rèn)識，卻不那么一帆風(fēng)順。早在17世紀(jì)，牛頓便在其所著的《光學(xué)》中提出光是一種高速運動的微粒流，但這個說法并不能解釋日常生活中所見的某些現(xiàn)象。在同一時期，荷蘭物理學(xué)家惠更斯提出了光的波動說，但由于理論尚不完善及牛頓的影響力，該學(xué)說并未得到大眾認(rèn)可。

1801年，托馬斯·楊做了著名的雙縫干涉實驗。他將一束單色光照射在兩條平行且足夠狹窄的細(xì)縫上，細(xì)縫后方的屏幕上顯示出若干條明暗相間的條紋，這種現(xiàn)象即為干涉。光的波動說能較好地解釋干涉現(xiàn)象。把光想象成水面上的波紋，它在向遠(yuǎn)處擴(kuò)散的同時進(jìn)行著上下往返的波動。從原理上分析得知，光照射在狹縫上，實際上形成了兩束相干光，它們到屏幕上任意一點的距離并不相同，當(dāng)這兩束光在該點相遇時，它們的波峰和波谷位置并不一致。二者進(jìn)行疊加，其波動的抵消與加強(qiáng)便形成了明暗條紋。日常生活中，干涉現(xiàn)象隨處可見，如肥皂泡上五彩斑斕的條紋，正是光發(fā)生薄膜干涉的緣故。

光是一種電磁波，它的傳播有著一個往返振動的相位。但與能輕易觀測的水面波紋不同，光的相位變化實在太快，達(dá)到1014赫量級，而常規(guī)的相機(jī)記錄頻率不過是數(shù)十到數(shù)百赫茲，根本來不及記錄相位變化的過程。因此，通常只能獲得光場振幅的平均值即光強(qiáng)，而無法獲得其相位信息。

干涉條紋可以反映光的相位信息，根據(jù)干涉現(xiàn)象反向推算出光場相位信息的方法就是全息術(shù)。全息術(shù)譯自英語holography，顧名思義，表示同時獲得光的全部信息，包括光強(qiáng)及相位信息。它最早由英國倫敦帝國科技學(xué)院的匈牙利裔物理學(xué)家伽博（D. Gabor）在1947年提出[1]。他發(fā)現(xiàn)在使用單色光照射物體時，可以利用干涉現(xiàn)象將光的相位信息保留在記錄介質(zhì)上，用相同的光照射記錄介質(zhì)時可以重新獲得物體的光場信息。伽博使用化學(xué)膠片記錄下了首張全息圖并發(fā)展了全息攝影技術(shù)，由此獲得1971年諾貝爾物理獎。

全息術(shù)在出現(xiàn)之初并不惹人注目，因為它在實際使用中效果并不理想。當(dāng)時作為光源的汞燈相干性較差，超細(xì)微粒銀鹽全息干版需要長時間曝光才能記錄全息信息，而后還需要在暗室進(jìn)行顯影、定影、漂白等一系列處理，才能獲得一幅全息圖像。進(jìn)行全息記錄需要極其穩(wěn)定的條件，且時間和材料成本較高，這些缺陷限制了全息術(shù)的發(fā)展。

早期的全息術(shù)中，物光與參考光方向一致，這就是同軸全息。同軸全息獲得的全息圖在還原光場信息時會產(chǎn)生一個與物像重疊的共軛虛像，故在相位的還原上存在較大問題。為解決該問題，1962年，美國密歇根大學(xué)的利思（E. Leith）和烏帕特尼克斯（J. Upatnieks）提出離軸全息[1]。他們將通信理論中的載頻概念推廣到空域中，實現(xiàn)了實像與共軛虛像之間的分離。離軸全息引入一個微小的傾角，令物光與參考光的傳播方向不完全一致，形成的全息圖在頻譜中可以區(qū)分物像和共軛虛像，進(jìn)而能以濾波的方式規(guī)避共軛虛像的疊加，解決了同軸全息方法中難以進(jìn)行的相位計算問題，使得利用單張全息圖像計算相位成為可能。

1960年代，激光發(fā)生器的出現(xiàn)為全息術(shù)提供了一種穩(wěn)定且高度相干的光源，極大提高了全息精度的上限。另一方面，電子成像設(shè)備及計算機(jī)的發(fā)展為全息術(shù)的數(shù)字化創(chuàng)造了條件。1967年，古德曼（J. W. Goodman）和勞倫斯（R. W. Lawrence）使用由計算機(jī)控制的相機(jī)進(jìn)行了全息圖像的記錄。他們以氦氖激光器為光源，用相機(jī)記錄了一張256×256像素的八級灰度圖，并使用計算機(jī)算法對獲得的圖像進(jìn)行二維傅里葉變換操作。通過對比數(shù)字計算結(jié)果與純光學(xué)方法圖像，他們證實了使用相機(jī)和計算機(jī)進(jìn)行數(shù)字記錄及計算重建被記錄對象的可行性，為之后數(shù)字全息計算的蓬勃發(fā)展打下堅實基礎(chǔ)。

1994年，施納斯（U. Schnars）和于普特納（W. Jüptner）實現(xiàn)了全息術(shù)的全面數(shù)字化，全息術(shù)的研究由此進(jìn)入新階段。他們使用電荷耦合器件（chargecoupled device， CCD）相機(jī)對一顆骰子全息記錄，并使用計算機(jī)算法進(jìn)行數(shù)字重建，成功還原出骰子的光強(qiáng)圖像。相比需要在暗室沖洗膠片的傳統(tǒng)光學(xué)全息術(shù)，數(shù)字全息術(shù)在使用便捷性上擁有壓倒性優(yōu)勢。

數(shù)字全息顯微鏡（digital holographic microscope）是利用光的干涉現(xiàn)象提取樣品三維信息的光學(xué)測量裝置。它結(jié)合了光學(xué)顯微成像及數(shù)字全息技術(shù)，把平面成像時失去的反映高度的相位信息保留在干涉條紋中，由相機(jī)對其進(jìn)行記錄，并通過后續(xù)計算模擬光在空間中的傳播，重建包含目標(biāo)在內(nèi)的特定三維空間內(nèi)的光場，從而實現(xiàn)對樣品表面的準(zhǔn)三維成像。數(shù)字全息顯微鏡在多年發(fā)展中逐漸拓展出多種應(yīng)用，應(yīng)用成熟度最高的有微粒三維運動的追蹤和三維形貌的表征成像。

微粒追蹤

同軸數(shù)字全息顯微鏡具有快速成像的優(yōu)點，可追蹤空間中微粒三維運動，這是傳統(tǒng)全息技術(shù)難以實現(xiàn)的。它先通過樣品微粒的散射光和周邊空白區(qū)域發(fā)生干涉所形成環(huán)狀的干涉條紋，得到全息圖像；再根據(jù)光場的衍射理論，對全息圖像進(jìn)行數(shù)值重建計算，從而獲得物光在三維空間分布。通過對聚焦位置的判定，同軸數(shù)字全息顯微鏡能極其準(zhǔn)確地獲得微粒樣品在空間中的位置信息，其精度甚至能突破衍射極限的限制[2]。

由于同軸數(shù)字全息顯微鏡在觀測中，不需要進(jìn)行染色等影響生物活性的制樣過程，因而特別適用于研究微生物和顆粒在溶液及界面附近的運動行為。筆者課題組使用同軸數(shù)字全息顯微鏡對大腸桿菌的運動軌跡進(jìn)行了追蹤（細(xì)菌培養(yǎng)在一個逐漸降解的表面上），觀測并獲得大腸桿菌在該表面附近的運動方向、速度、趨勢等參數(shù)，進(jìn)而分析該類表面針對微生物的動態(tài)防污效果[3]。此外，課題組還對電場中大腸桿菌的三維運動進(jìn)行了監(jiān)測。通過分析大腸桿菌在不同周期的電場中運動狀態(tài)的差異，揭示大腸桿菌黏附行為與電場周期之間的聯(lián)系，為利用電場進(jìn)行廢水處理和海洋防污提供了新思路[4]。

除了能確定微粒位置，同軸數(shù)字全息顯微鏡還能還原微粒大小和形態(tài)，為進(jìn)一步分析其表面的微觀變化做好前期工作。2020年，斯奈德（K. Snyder）等人應(yīng)用全息顯微技術(shù)研究抗體與抗原的結(jié)合[5]。他們在聚苯乙烯微球表面修飾上抗原蛋白，并將微球分別加入兩種不同抗體的溶液中，基于洛侖茲—米氏（Lorenz-Mie）光散射理論對全息圖像進(jìn)行擬合計算，獲得微球直徑的變化情況，進(jìn)而推斷抗體在小球表面的覆蓋情況，為抗體濃度、微觀結(jié)合機(jī)理等方面的分析提供參考依據(jù)[5]。

形貌表征

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡僅僅能平面成像，無法獲得高度信息，而數(shù)字全息顯微鏡卻能通過對光場信息的還原計算出光程差，進(jìn)而獲得樣品的三維形貌。最早，全息術(shù)僅能對光強(qiáng)進(jìn)行一定的還原而無法獲得三維形貌，原因是存在共軛虛像的干擾。為解決此干擾問題，不同的光學(xué)設(shè)計方式被提出并各自發(fā)展壯大。

最容易實現(xiàn)的是上文提到的利思等人提出的離軸全息方法。隨著頻域濾波等算法及硬件條件的提升，離軸數(shù)字全息顯微鏡的空間精度有大幅提升，已達(dá)到納米級。2008年，瑞士一課題組使用離軸數(shù)字全息顯微鏡對在石英基片上用鉻蒸鍍的微臺階表面形貌（高約8.9 納米）進(jìn)行了三維測量，實現(xiàn)了高精度的三維形貌觀測[6]。他們分別使用波長分別為657納米和680納米的兩種光源進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)二者在還原結(jié)果上差距較小，且計算獲得的橫截面高度與其他儀器標(biāo)準(zhǔn)獲得標(biāo)準(zhǔn)值的差距在誤差范圍內(nèi)。

由于離軸數(shù)字全息顯微鏡能夠?qū)悠返膭討B(tài)過程進(jìn)行三維無損觀測，故適合用于細(xì)胞相關(guān)的生物樣品研究，如拉帕茲（B. Rappaz）等人使用離軸數(shù)字全息顯微鏡對野生型及突變型酵母細(xì)胞的分裂周期進(jìn)行了成功觀測[7]。此外，還有研究者利用它對阿米巴變形蟲、海拉細(xì)胞、人體紅細(xì)胞等多種樣品進(jìn)行了三維成像及研究。綜上，離軸數(shù)字全息顯微鏡由于能復(fù)原物體或表面精細(xì)的相位形貌，可廣泛應(yīng)用于生物細(xì)胞的檢測領(lǐng)域。

除離軸全息外，研究人員還提出了相移全息。1969年，克蘭（R. Crane）首次明確提出相移干涉測量的概念。相移數(shù)字全息顯微鏡是一種結(jié)合全息顯微及相移干涉技術(shù)的裝置，通過多幅攜帶一定相移量的干涉圖像獲取待測物光波前的相位分布。使用時，先通過對參考光調(diào)制，改變相干光之間的相位差，獲得一系列全息圖像。之后，通過對這些全息圖像進(jìn)行計算，獲得物光的相位信息，進(jìn)而獲得樣品表面的三維形貌。

由于相移數(shù)字全息顯微鏡獲得三維形貌得基于多張全息圖像，因此需要對靜止樣品多次成像或使用多臺相機(jī)對同一樣品成像。前者是較常見的做法，使用的是時間相移數(shù)字全息顯微鏡，先在相位差隨時間進(jìn)行移動的情況下用一臺相機(jī)進(jìn)行成像，不同時間的圖像組成一組相移全息圖像，進(jìn)而計算出樣品三維圖像。這一類裝置光路相對簡單，相移控制也較靈活，因此在研究使用上相對廣泛。但由于時間相移數(shù)字全息顯微鏡要求相移前后樣品不變，故只適用于靜止或準(zhǔn)靜止樣品，如電子元器件等。對于動態(tài)變化過程，有人研制出空間相移數(shù)字全息顯微鏡，使用多臺相機(jī)或同一相機(jī)的不同位置進(jìn)行記錄，以獲得同一時間下樣品在不同相移量下的全息圖像。這種裝置能實現(xiàn)動態(tài)觀測，但對光路設(shè)計和硬件配置的要求很高。2004年，日本科學(xué)家粟辻安浩（Y. Awatsuji）等人通過掩膜板技術(shù)在相機(jī)前加入了相移陣列，使得同一相機(jī)上各部位的相移量不同，實現(xiàn)了多幅相移全息圖像的同時記錄[8]。

通過光源的調(diào)制，也能實現(xiàn)相位的獲取。2019年，張賀等人發(fā)表的關(guān)于近場傅里葉疊層成像研究的論文[9]，講述他們用散斑照明代替原本均勻的光照，通過散斑與樣品之間的相對運動實現(xiàn)干涉狀態(tài)的變化，進(jìn)而利用多幅低分辨圖像計算出樣品的光強(qiáng)及相位信息，并較大幅度提升了所獲圖像的分辨率。

除去成像光路上的修改，開發(fā)算法推算同軸全息中光場的相位信息也是研究重點。早在1970年代，英國劍橋大學(xué)的格奇伯格（R. W. Gerchberg）和薩克斯頓（W. O. Saxton）就提出格奇伯格—薩克斯頓（Gerchberg-Saxton）算法（簡稱GS算法）來恢復(fù)成像過程中丟失的相位信息。其他研究人員在此基礎(chǔ)上，發(fā)展出Fienup法等改良方法。這類方法與之前提及的直接計算的全息術(shù)不同，是通過代入估計值進(jìn)行迭代逼近真實值來獲取相位信息，對計算機(jī)算力、圖片質(zhì)量等要求較高。

近年來，隨著相機(jī)成像精度和計算機(jī)算法及運行速度等多方面的提升，結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定性高的同軸全息再次受到重視。如美國加利福尼亞大學(xué)研究組在同軸全息顯微鏡的基礎(chǔ)上引入發(fā)光二極管（lightemitting diode， LED）陣列，在不加入透鏡的情況下，通過計算機(jī)算法實現(xiàn)了超分辨率成像[10]。他們使用該裝置對感染了瘧疾寄生蟲（惡性瘧原蟲）的紅細(xì)胞進(jìn)行成像，寄生蟲在無透鏡顯微鏡的振幅和相位圖像中均清晰可見。

數(shù)字全息顯微鏡作為一種快速定量三維成像方法，使我們在不需要對樣品進(jìn)行過多處理的情況下，實現(xiàn)對微粒的實時三維觀測，獲取其空間三維信息隨時間的變化過程。目前，它已廣泛應(yīng)用在微粒表征、生物樣品檢測等科研領(lǐng)域。

盡管全息術(shù)仍受到相機(jī)分辨率、激光散斑等因素影響，但隨著光路的創(chuàng)新與優(yōu)化、算力的提升、圖像處理和深度學(xué)習(xí)算法等蓬勃發(fā)展、激光調(diào)制技術(shù)的改良，以及相機(jī)在精度及采集速度上的突破，相信在不久的將來，這項技術(shù)將會更加完善。它與其他技術(shù)相結(jié)合，會在微觀領(lǐng)域的研究與檢測中綻放獨特光彩，成為促進(jìn)科學(xué)研究的利器。

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關(guān)鍵詞：數(shù)字全息 三維追蹤及成像 計算成像 ■