鄒家森 朱仕群 韋君雨 韋金雙 陳秀奇 覃遠(yuǎn)漢

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南寧市 530021，電子郵箱：jianyeyu@outlook.com)

腎臟是對(duì)缺氧環(huán)境極度敏感的臟器，腎臟缺氧與急性腎損傷和慢性腎臟病都有著密切的聯(lián)系：急性缺氧可以導(dǎo)致急性腎損傷的發(fā)生[1]，急性腎損傷后腎臟的不完全性修復(fù)又會(huì)導(dǎo)致腎臟纖維化和慢性腎臟病[2-3]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是一種纖維化因子，能反映腎臟的纖維化程度，可作為評(píng)估慢性腎臟損傷的標(biāo)志物[4-5]。研究顯示，腎臟的缺氧損傷可能與細(xì)胞壞死性凋亡有關(guān)[6-7]。壞死性凋亡是一種兼具壞死的形態(tài)學(xué)特征與可受多種基因調(diào)控雙重特點(diǎn)的細(xì)胞死亡形式，而混合譜系蛋白激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)是其關(guān)鍵執(zhí)行因子[8]。由此可見，MLKL也與缺氧性腎損傷密切相關(guān)。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族，有α、β/δ、γ三種亞型，其中PPARγ與腎臟發(fā)育、代謝以及多種病理改變相關(guān)[9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮干預(yù)后，可通過減少細(xì)胞的壞死性凋亡來減輕缺氧造成的損傷[10]。但在體內(nèi)過表達(dá)PPARγ基因?qū)θ毖跣阅I損傷的影響如何，尚無相關(guān)研究報(bào)告。為此，我們通過建立低壓低氧小鼠腎損傷模型，利用腺相關(guān)病毒載體過表達(dá)PPARγ基因，探討過表達(dá)PPARγ基因?qū)π∈笕毖跣阅I損傷的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 15只4周齡雄性C57BL/6小鼠，體重15～20 g，購買于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014]，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的無特定病原體動(dòng)物飼養(yǎng)間，室溫20℃～25℃，濕度50%，明暗交替周期12 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 按抽簽法將15只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、缺氧組和過表達(dá)組，每組5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以尾靜脈注射的方式給予過表達(dá)組小鼠單次注射過表達(dá)PPARγ基因的腺相關(guān)病毒200 μL，缺氧組和對(duì)照組注射等體積生理鹽水，實(shí)驗(yàn)所用過表達(dá)PPARγ基因的腺相關(guān)病毒由和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)和構(gòu)建。注射3周后將缺氧組和過表達(dá)組小鼠置于低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(上海塔望智能科技有限公司，型號(hào)：ProOx-810L)。參照Chhabra等[11]的研究設(shè)置條件，即模擬海拔高度為7 500 m(氧分壓約8 kPa)的環(huán)境，艙內(nèi)設(shè)置充足飲水和食物，持續(xù)缺氧環(huán)境喂養(yǎng)7 d；對(duì)照組無特殊處理，常壓環(huán)境喂養(yǎng)7 d。7 d后即刻以5%水合氯醛按0.1 mL/10 g麻醉小鼠并取雙側(cè)腎臟，一部分置于4%多聚甲醛，用于制作病理切片、HE染色、過碘酸希夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色、Masson染色以觀察病理學(xué)變化；另一部分置于-80℃冰箱中保存，用于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。取材完畢后頸椎脫臼處死小鼠。

1.3 腎組織病理學(xué)觀察 將多聚甲醛固定至少1 h的腎組織依次經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，制成石蠟切片。將石蠟切片分別按HE染色試劑盒(北京索萊寶公司、批號(hào)：G1120)、PAS染色液試劑盒(北京索萊寶公司、批號(hào)：G1281)、Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶公司、批號(hào)：G1340)染色并脫水封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腎組織病理改變。

1.4 mRNA表達(dá)檢測(cè) 取各組小鼠腎臟組織磨碎，按RNA提取試劑盒(南京諾唯贊公司，批號(hào)：RC112-01)以離心柱法提取總RNA，以此為模板分別用引物擴(kuò)增，引物序列物由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見表1。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(南京諾唯贊公司，批號(hào)：R333-01)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在ABI 7500型PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測(cè)熒光強(qiáng)度并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、cDNA 2.0 μL、無酶水7.2 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃、10 s，60℃、34 s循環(huán)40次；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s熔解曲線。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因引物序列

1.5 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取各組小鼠腎組織磨碎，按十二烷基硫酸鈉蛋白裂解液說明書(上海碧云天公司，批號(hào)：P0013G)提取總蛋白，二喹琳甲酸法(賽默飛世爾公司，批號(hào)：23235)檢測(cè)蛋白濃度。添加上樣緩沖液并煮沸變性后行12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，放入分別含兔抗小鼠的PPARγ(Signalway Antibody公司，批號(hào)：49371)、MLKL(Abcam 公司、批號(hào)：ab184718)、TGF-β(Signalway Antibody公司，批號(hào)：48569)、β-肌動(dòng)蛋白抗體(Signalway Antibody公司、批號(hào)：21800)4℃搖床過夜，一抗稀釋倍數(shù)均為1∶1 000，用TBST洗膜3次，10 min/次；再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Signalway Antibody公司，批號(hào)：L3012)常溫避光搖床孵育1 h，二抗稀釋倍數(shù)為1∶5 000，TBST洗膜3次，10 min/次。在FluorChem M成像系統(tǒng)上用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定條帶灰度值，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參并用AlphaView軟件分析計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠腎組織病理切片染色情況得比較 (1)HE染色顯示：與對(duì)照組比較，缺氧組小鼠腎組織中部分腎小管管腔變形、閉塞、堵塞，管腔內(nèi)出現(xiàn)透明均染物質(zhì)，腎小管細(xì)胞腫脹，部分顆粒變性；與缺氧組比較，過表達(dá)組小鼠腎組織病變程度較低，腎小管無明顯狹窄，部分腎小管細(xì)胞腫脹。(2)PAS染色顯示：與對(duì)照組比較，缺氧組小鼠腎組織中腎小管管腔內(nèi)有壞死細(xì)胞碎片，部分腎小管管腔內(nèi)基底膜消失；與缺氧組比較，過表達(dá)組腎小管管腔未見明顯碎片。(3)Masson染色顯示：與對(duì)照組比較，缺氧組小鼠腎間質(zhì)有明顯纖維組織增生；與缺氧組比較，過表達(dá)組小鼠腎間質(zhì)纖維增生不明顯。見圖1。

對(duì)照組HE染色 缺氧組HE染色 過表達(dá)組HE染色

2.2 3組小鼠腎組織PPARγ、MLKL、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 與對(duì)照組相比，缺氧組小鼠腎組織PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，MLKL、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(均P<0.05)；與缺氧組相比，過表達(dá)組小鼠腎組織PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，MLKL、TGFβ mRNA相對(duì)表達(dá)量均下降(均P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠腎組織PPARγ、MLKL、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

2.3 3組小鼠腎組織PPARγ、MLKL、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 與對(duì)照組相比，缺氧組小鼠腎組織中PPARγ蛋白相對(duì)表達(dá)量下降，MLKL、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(均P<0.05)；與缺氧組相比，過表達(dá)組小鼠腎組織PPARγ蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，MLKL、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降(均P<0.05)。見表3和圖2。

表3 3組小鼠腎組織中PPARγ、MLKL、TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

圖2 蛋白電泳圖

3 討 論

由于自身解剖特點(diǎn)，腎臟極易發(fā)生缺氧性損傷[2]。腎臟的急性缺氧損傷主要是由腎灌注不足導(dǎo)致的，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率驟然降低；急性腎損傷后毛細(xì)血管稀疏進(jìn)一步加重了腎組織缺氧程度，缺氧又會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致腎小管上皮損傷、成纖維細(xì)胞活化以及炎癥細(xì)胞的浸潤，從而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化[3,12]，這是急性腎損傷發(fā)展成為慢性腎臟病的標(biāo)志[13]。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙人為制造低氧環(huán)境，建立小鼠系統(tǒng)性缺氧模型，結(jié)果顯示缺氧組小鼠腎組織中腎小管狹窄閉塞、腎間質(zhì)纖維化增生，腎臟損傷標(biāo)志物TGF-β的表達(dá)明顯增高，這提示小鼠缺氧性腎損傷模型建立成功。

PPARγ的基本功能是調(diào)節(jié)脂肪和糖代謝[14-15]，但近年來越來越多的研究顯示PPARγ對(duì)缺氧缺血性腦損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、肺纖維化等疾病均有保護(hù)作用[16-18]。在腎臟疾病方面，PPARγ不僅可以通過上調(diào)解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)以抑制缺血再灌注或順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷[19]，還可以通過活化磷酸酶-張力蛋白同源物以抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化而減輕腎纖維化[20]。我們的前期研究顯示，缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型中PPARγ表達(dá)明顯降低[21]。本研究中，缺氧組小鼠腎組織中的PPARγ mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組明顯降低(均P<0.05)。上述研究表明，PPARγ表達(dá)水平與腎損傷密切相關(guān)。因此，我們推測(cè)過表達(dá)PPARγ或許對(duì)缺氧性腎損傷具有干預(yù)作用。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)組小鼠腎小管狹窄閉塞程度明顯減輕，未見明顯的腎間質(zhì)纖維化，且腎組織中的TGF-β表達(dá)明顯降低，這提示過表達(dá)PPARγ基因可減輕小鼠缺氧性腎損傷。

在腎臟缺氧損傷的過程中，細(xì)胞壞死性凋亡扮演了重要角色，Shen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡特異性抑制劑Necrostatin-1可以使人腎皮質(zhì)近曲小管上皮HK2細(xì)胞抵抗缺氧損傷，也可減輕大鼠缺血再灌注損傷。Liao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，抑制壞死性凋亡可以減輕缺血再灌注后的急性腎損傷。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞會(huì)高表達(dá)受體交互作用蛋白3等壞死性凋亡特異性標(biāo)志物[10]。本研究中，缺氧組小鼠腎臟組織MLKL的mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均明顯增高，這提示缺氧性腎損傷可能是通過腎臟細(xì)胞壞死性凋亡所導(dǎo)致。而關(guān)于PPARγ的表達(dá)變化對(duì)壞死性凋亡的影響，不少學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了探討，Peng等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可降低心肌細(xì)胞壞死性凋亡，從而減輕盲腸結(jié)扎穿刺引起的敗血癥性心肌功能障礙；Huang等[23]研究報(bào)告，在低糖誘導(dǎo)的腦損傷中，PPARγ抑制劑可以通過抵抗二十二碳六烯酸的神經(jīng)保護(hù)作用而增加神經(jīng)細(xì)胞壞死性凋亡。本研究結(jié)果顯示，相比于缺氧組，過表達(dá)組小鼠腎組織PPARγ的mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而MLKL的mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，這提示過表達(dá)PPARγ基因或可減少腎臟細(xì)胞壞死性凋亡，從而減輕小鼠的缺氧性腎損傷。

綜上所述，過表達(dá)PPARγ基因可減輕小鼠的缺氧性腎損傷，其機(jī)制可能與減少腎臟細(xì)胞壞死性凋亡有關(guān)。因此，PPARγ有望成為缺氧性腎損傷新的治療靶點(diǎn)。