周 巧， 劉 健， 郭錦晨， 黃 旦

(1.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)風(fēng)濕病防治研究所，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素包括衰老、機(jī)械壓力、遺傳和肥胖[1]。骨關(guān)節(jié)炎中主要穩(wěn)態(tài)細(xì)胞的損害，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞功能障礙和衰老[2]。骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“骨痹”范疇，中醫(yī)學(xué)病機(jī)呈現(xiàn)脾虛濕盛、濕熱蘊(yùn)結(jié)，痰瘀痹阻，可采用“健脾化濕、清熱通絡(luò)”進(jìn)行治療，黃芩清熱除痹膠囊為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有健脾化濕、清熱通絡(luò)之功。本課題組前期臨床研究和細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，黃芩清熱除痹膠囊可改善骨關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀，調(diào)節(jié)促-抑炎體系，發(fā)揮抗氧化作用，從而起到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的科學(xué)方法，分析網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)生物學(xué)是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)，與中醫(yī)的結(jié)合彌補(bǔ)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)之間的鴻溝[4]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出黃芩清熱除痹膠囊活性成分及作用靶點，挖掘黃芩清熱除痹膠囊調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點，并通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建藥物、靶點、基因、疾病網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行相應(yīng)富集分析和分子對接，探討黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎可能的分子機(jī)制，為黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎后續(xù)實驗研究開拓思路，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 黃芩清熱除痹膠囊化學(xué)成分篩選及活性成分靶點庫構(gòu)建 通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺即TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索黃芩清熱除痹膠囊主要中藥成分黃芩、梔子、威靈仙、薏苡仁和桃仁，根據(jù) ADME(吸收、分布、代謝、排泄)的參數(shù)，口服生物利用度(OB)的篩查閾值設(shè)置為≥30%，藥物相似度(DL)設(shè)置為≥0.18，以篩選有效活性成分。

1.2 Venn分析及藥物活性成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將黃芩清熱除痹膠囊中藥成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫，限定物種是“Homosapiens”，獲得中藥化合物相關(guān)的潛在靶點基因，應(yīng)用UniProt校正，建立藥物活性成分靶點基因數(shù)據(jù)庫。以“Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD數(shù)據(jù)庫，篩選條件為relevance score≥10，收集與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的已知靶點基因。使用Funrich篩選中藥復(fù)方靶點和骨關(guān)節(jié)炎靶點的交集靶點，進(jìn)行Venn分析。Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建黃芩清熱除痹膠囊活性成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c的篩選 將2組交集基因集輸入String在線數(shù)據(jù)庫，選擇“multiple proteins”分析模式，限定種屬為 “Homesapiens”，獲取蛋白與蛋白間互作信息，構(gòu)建PPI作用網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape 3.2.1軟件，使用CytoNCA插件[5]對核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選。

1.4 核心靶點基因的富集分析 使用R.Data軟件，對黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點進(jìn)行基因本體論(GO)生物過程和KEGG信號通路富集分析，物種選為“Homesapiens”，以P<0.05作為篩選條件，獲取相應(yīng)數(shù)據(jù)，繪制相應(yīng)圖形。

1.5 活性成分與靶點的分子對接驗證 選擇主要中藥成分化合物與核心靶點進(jìn)行分子對接?；衔锏亩S結(jié)構(gòu)圖通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載，導(dǎo)入到Chem3D軟件中以繪制三維結(jié)構(gòu)圖，優(yōu)化后保存為mol2格式，AutoDock Tools1.5.6軟件用于制備受體，包括添加氫和設(shè)置對接參數(shù)，所有配體和受體文件均保存為pdbqt格式，Autodock Vina來評估和驗證化合物-靶標(biāo)關(guān)系的結(jié)合親和力，以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，綁定模型通過PyMol2.3.0軟件和Discovery Studio3.5軟件可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃芩清熱除痹膠囊有效成分的收集和篩選 最終獲得黃芩清熱除痹膠囊活性成分90種，其中黃芩36種，梔子15種，桃仁23種，威靈仙7種，薏苡仁9種，有2種成分為2種以上中藥所共有。由于黃芩清熱除痹膠囊的活性成分較多，僅列出25項，見表1。

2.2 黃芩清熱除痹膠囊和疾病骨關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點Venn分析及“中藥-活性成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)展示圖的構(gòu)建 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索黃芩清熱除痹膠囊活性成分對應(yīng)的靶點，共得到1 767個靶標(biāo)基因，經(jīng)過Uniprot將所有靶標(biāo)進(jìn)行匯總、去除重復(fù)靶標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)化名稱，進(jìn)行校正后，共得到202個靶標(biāo)基因。通過檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD數(shù)據(jù)庫，分別收集到骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點基因1 836、33、353、8、28個，去除重復(fù)基因后共獲得1 944個。對黃芩清熱除痹膠囊活性成分對應(yīng)的202個共同作用靶點與1 944個骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點進(jìn)行Venn分析，獲得115個交集基因，即為黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點。Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)展示圖，其中，左邊圓圈代表復(fù)方黃芩清熱除痹膠囊中藥的活性成分，不同顏色代表不同中藥成分，右邊網(wǎng)格代表活性成分的靶基因，用藍(lán)色長方形表示，節(jié)點越大，代表靶基因相連的成分越多，見圖1。

圖1 黃芩清熱除痹膠囊活性成分-作用靶點相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c的篩選 將115個交集基因集輸入到Cytoscape 3.7.2軟件BisoGenet插件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。使用CytoNCA插件計算每個網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的DC值，篩選出DC>2倍DC中位數(shù)(28)的節(jié)點。篩選出EC、IC、LAC、BC、CC、NE大于各自中位數(shù)的節(jié)點，最終篩選出核心靶點11個。分別為絲裂原活化蛋白激酶1,8,14(mitogen-activated protein kinase 1,8,14)、Fos原癌基因(Fos proto-oncogene)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞基(AP-1 transcription factor subunit)、雌激素受體(estrogen receptor 1，ESR1)、NFKB抑制劑α(NFKB inhibitor alpha，NFKBIA)、RELA原癌基因(RELA proto-oncogene)、NF-KB亞基(NF-KB subunit)、JUN(junctional adhesion molecule 3)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)、腫瘤蛋白P53結(jié)合蛋白1(tumor protein P53 binding protein 1，TP53)、MYC原癌基因(MYC proto-oncogene)、BHLH轉(zhuǎn)錄因子(BHLH transcription factor)。

表1 黃芩清熱除痹膠囊部分活性成分信息

注：左圖為初始PPI 網(wǎng)絡(luò)，中圖為篩選出DC>2倍DC中位數(shù)(28)的節(jié)點，右圖為最終篩選出的核心靶點。圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點的篩選過程圖

2.4 核心靶點基因的富集分析 為了解交集基因在骨關(guān)節(jié)炎治療中所起的作用，對黃芩清熱除痹膠囊的11個核心靶點基因進(jìn)行GO、KEGG富集分析，設(shè)定閾值P<0.05。GO注釋條目116個，按照P值升序排列的前20條GO富集結(jié)果見圖3，生物過程(biological processes，BP)主要參與對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)、外在凋亡信號通路、對抗生素的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)；細(xì)胞組分(cellular component，CC)主要參與膜區(qū)、囊泡腔、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、分泌顆粒腔、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；分子功能(molecular function，MF)主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性、氧化還原酶活性等。按照P值升序排列的前20條KEGG富集通路見圖4，黃芩清熱除痹膠囊可以作用于IL-17信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、Th17細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等161條信號通路。此外，結(jié)果還顯示黃芩清熱除痹膠囊活性成分的靶基因還涉及其他疾病，如感染疾病、腫瘤、耐藥、內(nèi)分泌與代謝病和神經(jīng)退行性變等，這提示了黃芩清熱除痹膠囊活性成分治療這些疾病的潛在優(yōu)勢。

圖3 GO富集分析(前20條通路)

圖4 KEGG富集分析(前20條通路)

2.5 分子對接結(jié)果分析 通過篩選的11個核心靶點，以及富集分析得到的骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因和信號通路，選取有文獻(xiàn)報道與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)經(jīng)典靶點蛋白7個[6-11]，在PDB和Uniprot數(shù)據(jù)庫中檢索核心靶點對應(yīng)的與中藥成分相關(guān)的小分子配體，以及配體對應(yīng)的蛋白信息，物種選為“Homesapiens”，見表2。利用Autodock tools軟件計算這7個靶點基因與黃芩清熱除痹膠囊中藥活性成分間的最低結(jié)合能，見表3，受體蛋白與活性成分的最低結(jié)合能結(jié)果小于-5 kcal/mol，表明結(jié)合較好，所需的能量越少，結(jié)合越穩(wěn)定。部分分子對接結(jié)合模式見圖5，黃色圓圈表示小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)之間的對接狀態(tài)，綠色線條代表氫鍵。結(jié)果顯示，活性成分與靶點受體蛋白周圍分子通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。

表2 靶點受體蛋白信息

表3 活性成分與靶點受體蛋白間的最低結(jié)合能

注：A～D分別為梔子與ESR1、TP53、AKT1、MAPK14對接，E～F分別為黃芩與JUN、FOS對接，G為薏苡仁與MAPK1對接。圖5 活性成分與靶點受體蛋白的分子對接模式

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的特征是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的逐漸破壞[12]，本病中醫(yī)屬于“骨痹”范疇，其中醫(yī)學(xué)病機(jī)呈現(xiàn)脾虛濕盛、濕熱蘊(yùn)結(jié)，痰瘀痹阻[13]，因此采用健脾化濕、清熱通絡(luò)法治療[14]。黃芩清熱除痹膠囊具有健脾化濕、清熱通絡(luò)之功，由黃芩、梔子、威靈仙、薏苡仁、桃仁組成。本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索出黃芩清熱除痹膠囊的主要化學(xué)成分有90種，構(gòu)建黃芩清熱除痹膠囊-活性成分-潛在靶點以及骨關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)靶點，通過Venn分析取兩者交集基因115個；PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點11個，包括MAPK1,8,14、AKT1、ESR1、TP53、JUN、FOS等；構(gòu)建“中藥-活性成分-潛在靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎具有多成分、多靶點的特點；富集結(jié)果顯示，黃芩清熱除痹膠囊參與氧化應(yīng)激的反應(yīng)、活性氧的反應(yīng)、凋亡信號通路、轉(zhuǎn)錄因子活性等生物過程；可以作用于IL-17信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、Th17細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號通路等161條信號通路，由此可見，黃芩清熱除痹膠囊可以調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的外在凋亡信號通路、轉(zhuǎn)錄因子活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)。本課題組前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，黃芩清熱除痹膠囊可通過調(diào)節(jié)促-抑炎體系，調(diào)節(jié)CD36啟動子或者PPARγ表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)MPK磷酸化，提高細(xì)胞內(nèi)Mn-SOD表達(dá)，使細(xì)胞免受氧化損傷，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗免疫作用，改善關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀[15-17]。這與本研究的富集結(jié)果相吻合。富集結(jié)果還顯示，黃芩清熱除痹膠囊活性成分的靶基因還涉及其他疾病，如感染疾病、腫瘤、耐藥、內(nèi)分泌與代謝病和神經(jīng)退行性變等，這提示了黃芩清熱除痹膠囊活性成分治療這些疾病的潛在優(yōu)勢。

對PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋泻Y選的核心基因進(jìn)行選擇，選取有文獻(xiàn)報道與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)經(jīng)典靶點蛋白7個進(jìn)行分子對接，分別為ESR1、TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK14、FOS，與這些靶點相關(guān)的黃芩清熱除痹膠囊成分是黃芩、梔子、薏苡仁和威靈仙，且AutoDock Tools計算出的最低結(jié)合能結(jié)果均小于-5 kcal/mol，表示結(jié)合穩(wěn)定。故黃芩清熱除痹膠囊可以通過ESR1、TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK14、FOS等靶點治療骨關(guān)節(jié)炎。雌激素受體1(estrogen receptor,ESR) 是一種小分子類固醇激素，該基因多態(tài)性與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病有一定聯(lián)系，ESR1基因突變可能會增加膝骨關(guān)節(jié)炎患病風(fēng)險。TP53基因編碼的p53蛋白的作用是調(diào)控細(xì)胞分裂和增殖。JUN和FOS是編碼激活蛋白-1(AP-1)的不同亞單位，含有FOS的AP-1雜二聚體被證明是軟骨細(xì)胞分化所必需的。另外，JUN表達(dá)的c-Jun蛋白對調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡有重要作用[10]。MAPK蛋白等通過調(diào)控自噬相關(guān)信號通路,一方面抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減少軟骨細(xì)胞產(chǎn)生；一方面改變細(xì)胞生長環(huán)境促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡，增加軟骨細(xì)胞的損失，而軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少又伴隨著軟骨細(xì)胞外基質(zhì)生成不足，從而促進(jìn)軟骨退變[11]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，展示了黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點、多通路的治病特點。研究還發(fā)現(xiàn)黃芩清熱除痹膠囊參與骨關(guān)節(jié)炎活性氧的反應(yīng)、凋亡信號通路、轉(zhuǎn)錄因子活性等生物過程，也可以作用于IL-17信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、Th17細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用來治療骨關(guān)節(jié)炎。