馬 云， 韓振明， 馬 健， 張 微， 關(guān)永霞， 張貴民

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006)

首薈通便膠囊為魯南厚普制藥有限公司研發(fā)的中藥6類新藥，現(xiàn)已成功上市[1]，由何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術(shù)、枳實(shí)8味中藥組成，以何首烏、蘆薈為君藥，決明子、枸杞子、阿膠為臣藥，人參、白術(shù)為佐藥，枳實(shí)為使藥，臨床上主要用于功能性便秘的治療[2-3]，尤其對(duì)毒邪內(nèi)蘊(yùn)、陰液虧虛所致便秘具有良好的潤(rùn)腸通便作用，并具有排毒養(yǎng)顏、減肥降脂功效，適合老年人、體質(zhì)虛弱者服用[4]。方中何首烏已分離出一百多種成分，其中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-葡萄糖苷顯示出多種生物活性，如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、降脂、抗衰老等[5-8]，可作為該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)志物[9-11]；蘆薈中蘆薈苷、蘆薈大黃素等成分具有通便、抗炎、抗病毒、抗菌、保護(hù)肝臟和神經(jīng)的多重活性[12-13]；決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術(shù)、枳實(shí)所含成分具有調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)[14]、保護(hù)胃腸道[15]、降脂[16]、保護(hù)心血管[17]、抗癌[18]、免疫調(diào)節(jié)[19-20]作用，在臨床上達(dá)到協(xié)同治療、共同起效的效果。

課題組前期對(duì)首薈通便膠囊相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研，根據(jù)其藥理活性及其物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)性分析結(jié)合指紋圖譜[21]，采用響應(yīng)面法優(yōu)化該制劑提取工藝，HPLC法同時(shí)測(cè)定2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚的含量，以期為全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑 2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(CAS號(hào)82373-94-2，純度≥98%)、柚皮苷(CAS號(hào)10236-47-2，純度≥98%)、新橙皮苷(CAS號(hào)13241-33-3，純度≥98%)、蘆薈苷A(CAS號(hào)1415-73-2，純度≥98%)、蘆薈苷B(CAS號(hào)28317-16-6，純度≥98%)、蘆薈大黃素(CAS號(hào)481-72-1，純度≥97%)、大黃酚(CAS號(hào)481-74-3，純度≥98%)對(duì)照品均由上海源葉生物科技有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；異丙醇、磷酸為色譜純，甲醇為分析純(南京化學(xué)試劑股份有限公司)。

1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀[配置Waters e2695四元泵、Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器，沃特世科技(上海)有限公司]；LE204E(十萬分之一)、01193-YP601N(萬分之一)電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)；純水/超純水系統(tǒng)；有機(jī)濾頭(0.22 μm，愛西默科技有限公司)。

1.3 藥物 首薈通便膠囊由魯南厚普制藥有限公司提供，批號(hào)200101，生產(chǎn)時(shí)間為2020年1月。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(250 W、100 Hz)處理60 min，放冷至室溫，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，吸取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，50%甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為0.767 0、1.865、1.139、0.801 0、2.936 5、0.176 0、0.088 0 mg/mL的貯備液，取適量，稀釋成每1 mL分別含七者0.076 7、0.186 5、0.113 9、0.080 1、0.587 3、0.017 6、0.008 8 mg的溶液，即得。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量5 μL；理論塔板數(shù)按2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷計(jì)，不得低于5 000。HPLC色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 2. 柚皮苷 3. 新橙皮苷 4. 蘆薈苷A 5. 蘆薈苷B 6. 蘆薈大黃素 7. 大黃酚圖1 各成分HPLC色譜圖

表2 各成分線性關(guān)系

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為1.41%、1.32%、1.32%、2.22%、0.74%、2.16%、1.35%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品(批號(hào)200101)內(nèi)容物粉末6份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚含量RSD分別為1.66%、0.67%、1.42%、1.94%、0.58%、1.86%、1.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取本品(批號(hào)200101)內(nèi)容物粉末適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24、48 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為1.54%、1.08%、1.44%、1.43%、0.96%、1.82%、1.57%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品內(nèi)容物粉末6份，精密加入對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚平均加樣回收率分別為100.35%、98.81%、97.22%、98.40%、97.95%、98.95%、101.39%，RSD分別為1.99%、2.08%、1.30%、1.61%、0.46%、1.64%、1.90%。

2.4 提取工藝優(yōu)化 采用Design-expert 8.0軟件，設(shè)計(jì)3因素5水平響應(yīng)面模型，選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取時(shí)間(X2)、料液比(X3)作為影響因素，各成分總峰面積(Y)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，中心組合設(shè)計(jì)運(yùn)行20次，設(shè)定顯著性測(cè)試置信水平為95.0%(即P<0.05)，重復(fù)3次，因素水平見表3，結(jié)果見表4。

表3 因素水平

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=3)

表5 方差分析

響應(yīng)面分析見圖2。由圖2A可知，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)增加，各成分總峰面積升高，但超過50%時(shí)開始降低；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)各成分總峰面積變化不明顯。由圖2B可知，當(dāng)料液比一定時(shí)，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)增加各成分總峰面積升高，在50%左右出現(xiàn)最高值，之后開始降低；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著料液比增加各成分總峰面積升高，在1∶100左右出現(xiàn)最高值，之后基本穩(wěn)定。由圖2C可知，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著料液比增加各成分總峰面積升高；當(dāng)料液比一定時(shí)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)各成分總峰面積升高程度緩慢。

注：左圖為三維曲面圖，右圖為等高線圖。圖2 各因素響應(yīng)面圖

采用Design-expert 11.0軟件進(jìn)行分析，并結(jié)合實(shí)際操作情況，確定最優(yōu)提取工藝為甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間60 min，料液比1∶100。再進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得各成分總峰面積為37 345 513，與預(yù)測(cè)值比較相對(duì)誤差僅為0.47%，表明該工藝切實(shí)可行。

3 討論

3.1 色譜條件篩選 蘆薈苷A、蘆薈苷B是同分異構(gòu)體，兩者可相互轉(zhuǎn)化，并在一定條件下氧化分解，生成蘆薈大黃素及其他成分[22]，前期報(bào)道中它們是統(tǒng)一按照蘆薈苷進(jìn)行含量計(jì)算[1]，但由于方法的不穩(wěn)定性，經(jīng)常存在肩峰或分叉峰情況，對(duì)色譜圖積分的準(zhǔn)確度造成影響。因此，本實(shí)驗(yàn)更改流動(dòng)相有機(jī)相比例、pH值、洗脫梯度，發(fā)現(xiàn)在“2.2”項(xiàng)色譜條件下蘆薈苷A、蘆薈苷B分離度最好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 本實(shí)驗(yàn)對(duì)各成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，最終確定為220 nm。

3.3 柱溫篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了柱溫25、30、35 ℃，發(fā)現(xiàn)在30 ℃下各成分色譜峰分離度理想，出峰時(shí)間適當(dāng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定首薈通便膠囊中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚的含量，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化該制劑提取工藝，對(duì)提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、推動(dòng)相關(guān)規(guī)范化生產(chǎn)具有重要意義。