雷琳琳，李金玲，曹國璠，王華磊，羅春麗，李丹丹，羅夫來，羅蓉，石敏

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點（工程）實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省凱里市榕江縣林業(yè)局，貴州 凱里 557200）

草珊瑚[Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai]別稱腫節(jié)風(fēng)、九節(jié)茶，為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物，具有清熱涼血、祛風(fēng)通絡(luò)、活血消斑等功效，用于治療血熱紫斑、紫癜、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷及腫瘤等癥[1-3]。其野生資源主要分布于我國安徽、浙江、江西、福建、臺灣、廣東、廣西、湖南、四川、貴州和云南等省[4]。草珊瑚主要用于治骨折和跌打損傷瘀腫等，其中，貴州黔東南州苗醫(yī)藥的九節(jié)茶藥制作工藝在2008 獲得第二批國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)代表性項目名錄[5]，目前，黔東南草珊瑚野生資源達到約5 400 hm2，野生撫育約1 300 hm2。而中藥材的有效成分含量與采收期有直接關(guān)系，通過對不同時期、不同部位草珊瑚有效成分的測定，選擇適宜的采收期對提高草珊瑚質(zhì)量以及充分利用資源有重大意義?，F(xiàn)階段，草珊瑚采收期對其有效成分含量影響的相關(guān)研究較少，只有徐翔英等[6]對產(chǎn)自福建省的草珊瑚中的7 個有效成分進行過分析研究，包俠萍[7]對廈門地區(qū)的草珊瑚的不同部位及不同采收期有效成分含量進行了考察研究，但對貴州產(chǎn)地的草珊瑚含量、采收期等方面的研究鮮少涉獵，僅停留在對草珊瑚的種植方式、發(fā)展?jié)摿Ψ矫娴难芯俊Ｑ芯勘砻?，草珊瑚主要含有香豆素、有機酸、黃酮及揮發(fā)油等類化學(xué)成分[8,9]。中國藥典中規(guī)定的草珊瑚有效活性成分異嗪皮啶有抗腫瘤功效，而酚酸類具有抗菌消炎的功效[10-14]。除此之外，基于貴州榕江地區(qū)藥農(nóng)在采收時為保留貴州草珊瑚野生資源，只采收野生草珊瑚的地上部分，因此，本實驗通過HPLC 法對草珊瑚地上部分新綠原酸、隱綠原酸、迷迭香酸和異嗪皮啶4 種有效成分的含量進行測定，篩選科學(xué)、最佳的采收期，為貴州黔東南州野生草珊瑚的適宜采收期提供一定的理論依據(jù)。

1 材料、儀器以及試藥

1.1 材料

草珊瑚藥材采于貴州省黔東南州榕江縣。采樣采用5 點取樣法，每個點取6 株草珊瑚，共取30 株。為方便記錄，將榕江縣野生草珊瑚基地記為A 區(qū)，A 區(qū)海拔713 m，草珊瑚生長坡向為東南135°，坡度為45°，伴生植被為闊葉林。A 區(qū)莖部7~12 月分別記為編號1~6，葉部7~12 月分別記為編號7~12。

1.2 儀器

Agilent1260 infinity 型高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]、RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、PX85ZH 型電子天平[奧豪斯儀器（常州）]有限公司。

1.3 試藥

異嗪皮啶（批號：DSTDY001001）、迷迭香酸（批號：DSTDM002701）、隱綠原酸（批號：DSTDY003501）、新綠原酸（批號：DSTDX001503）面積歸一化法計算純度均大于98.0% ，藥品均從樂美天醫(yī)藥（德思特生物）購買。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取新綠原酸、迷迭香酸、異嗪皮啶及隱綠原酸對照品適量，加入色譜甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.4 mg/mL 和0.4 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取草珊瑚莖、葉粉末（過3 號篩）2 g，精密稱定，置于250 mL的錐形瓶中，用體積分數(shù)50%的甲醇50 mL 浸泡30 min，加熱回流1.5 h，放冷，過濾，取濾液，減壓蒸干，殘渣加色譜甲醇10 mL 溶解，過濾，取濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱: Agilent C18 色譜柱（250 mm 4.6 mm，5m）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0~10 min，15% A；10~18 min，15% →25% A；18~30min，25%A），流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：330 nm，進樣量：10L。在該色譜條件下，對照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 草珊瑚樣品（A）與混合對照品（B）HPLC 圖Fig.1 HPLC Chromatograms of samples(A)and reference substances (B)

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密稱取新綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶和迷迭香酸，甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度分別為0.240 g/L、0.391 g/L、0.383 g/L 和1.800 g/L，新綠原酸進樣量分別為0.1L、2L、3L、4L 和5L，隱綠原酸進樣量分別為0.1L、0.5 L、1.5 L、2 L、2.5 L 和3.2 L，異嗪皮啶進樣量分別為0.1 L、1 L、2 L、3 L、4 L 和5 L，迷迭香酸進樣量分別為0.1 L、2 L、4 L、6 L 和8 L[15]。在“2.3”項下色譜條件進樣分析，以峰面積（y）為縱坐標，以進樣濃度（x，g/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，新綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶和迷迭香酸對照品的標準曲線、回歸方程及線性范圍見表1。

表1 草珊瑚4 個有效成分回歸方程及線性范圍Table 1 Regression equations and linear ranges of four active components of Sarcandra glabra

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。新綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶及迷迭香酸平均峰面積分別為411.66、809.233、605.03和857.116，RSD（n=6）分別為1.222%、1.295%、1.528%和1.671%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一干燥方式草珊瑚藥材（編號8）粉末2 g，共6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。新綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶和迷迭香酸的平均峰面積分別為167.06、307.7、142.78 和2 507.26，RSD分別為0.052%、1.124%、1.762%和0.025%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（編號4），在0 h、2 h、4 h、8 h、18 h 和24 h 分別按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。結(jié)果新綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶和迷迭香酸的峰面積分別為659.15、1 120.633、840.55和9 725.05，RSD 分別為1.482%、1.751%、1.023%和1.280%，表明供試品溶液中上述4 個成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的草珊瑚粉末（編號5）2 g，共6 份，分別稱取一定量的對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，除進樣量為5L 外，其余步驟均按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算加樣回收率，見表2。

表2 草珊瑚4 個化學(xué)成分的加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 2 Test results of sample recovery of four chemical components of Sarcandra glabra (n=6)

2.9 樣品含量測定

精密稱取不同采收期、不同部位的草珊瑚樣品粉末2g，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算新綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶和迷迭香酸的含量。

2.10 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 表格，利用SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性檢驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同采收期下A、B兩區(qū)草珊瑚莖部4個有效成分含量比較

由表3 可知，在A 區(qū)草珊瑚7~12 月的采收月份中，從草珊瑚莖中檢測的4 種成分含量存在差異，在9月份4 種有效成分含量都是最低的，其中隱綠原酸、迷迭香酸在11月份含量最高，最高含量分別為0.038%、0.383%。11 月份，隱綠原酸含量顯著高于其余月份，與7 月、8 月、9 月和12 月份含量達極顯著差異，與10月份差異不顯著。11 月份迷迭香酸含量與其余5 個月份含量都達極顯著差異。新綠原酸在10 月份含量達到最高，含量達到0.024%，與7 月、8 月、9 月和12 月含量差異達到極顯著水平，與11 月份含量差異不顯著。異嗪皮啶含量在8 月份達到最高，達到0.057%，與其余5 個月份含量差異達到極顯著。

表3 A 區(qū)草珊瑚莖部4 個有效成分含量表（%）Table 3 Contents of 4 active components in the stems of Sarcandra glabra in area A (%)

3.2 不同采收期下A區(qū)草珊瑚葉部4個有效成分含量比較

由表4 可知，A 區(qū)7~12 月的采收期中從草珊瑚葉中檢測的4 種有效成分含量在9 月份依舊是最低的，這與在莖部測定的結(jié)果相一致，新綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶以及迷迭香酸4 種有效成分在11 月份含量是最高的，分別為0.021%、0.029%、0.008%和0.645%且含量與其余采收月份含量差異達到極顯著水平。葉片中新綠原酸、迷迭香酸含量在11 月份達到最高與莖部中相一致，異嗪皮啶在葉片中的含量明顯低于莖部，且最高含量月份也不相同，莖部中含量在8月份達到最高，為0.057 %，葉片中含量在11 月份最高，為0.008%。

表4 A 區(qū)草珊瑚葉部4 個有效成分含量表（%）Table 4 Contents of 4 active components in leaves of Sarcandra glabra in area A (%)

3.3 不同采收期下整株草珊瑚中異嗪皮啶、迷迭香酸含量比較

通過對草珊瑚樣品干重莖葉比，得到整株草珊瑚中迷迭香酸、異嗪皮啶的平均含量（表5），A 區(qū)7~12月6 個采收月份迷迭香酸含量均能達到藥典標準（＞0.020%），在11 月份達到最高，最高達0.467%。A 區(qū)除了9 月份，異嗪皮啶含量達不到藥典含量標準（0.014%＜0.02%），其余月份均能滿足藥典標準（＞0.020%），在8 月份達到最高，最高為0.046%。因此，A區(qū)9 月份不建議進行草珊瑚采收。

表5 A 區(qū)草珊瑚地上部分異嗪皮啶和迷迭香酸的平均含量Table 5 Average content of isofraxidin and rosmarinic acid in whole Sarcandra glabra in area A and area B

4 討論與結(jié)論

4.1 討論

在貴州省榕江地區(qū)，不同采收期對草珊瑚有效成分含量有著明顯的影響，由于草珊瑚是全株入藥，《中國藥典》2015 年版一部中草珊瑚的采收季節(jié)定為夏秋兩季，采收期較長，并不明確[6]。本試驗考察不同采收期、不同部位、不同地區(qū)草珊瑚有效成分含量，通過HPLC 法同時測定草珊瑚中4 個有效成分，得出各成分最佳采收期以及不同部位的含量，為貴州榕江地區(qū)草珊瑚的采收以及質(zhì)量研究提供一定的理論依據(jù)，也為草珊瑚含量的測定方法提供一定的理論基礎(chǔ)，為進一步優(yōu)化測定方法提供依據(jù)。本試驗通過測定7~12 月各時期有效成分含量得出草珊瑚莖中新綠原酸、隱綠原酸和迷迭香酸3 種有效成分均在11 月份達到最佳，新綠原酸、隱綠原酸成分與徐翔英、衷林清等[6]的研究一致，而迷迭香酸11 月達到最佳，與前人研究的結(jié)論迷迭香酸在8~10 月份含量較高有些許差異，主要因為地區(qū)環(huán)境、海拔以及品種等差異的原因?qū)е拢驹囼炈杉貐^(qū)的草珊瑚迷迭香酸含量也要比其高得多。異嗪皮啶在8 月達到最佳，我們可根據(jù)所需草珊瑚的不同有效成分來選擇草珊瑚的采收時期。

本試驗通過測定7~12 月各時期有效成分含量得出草珊瑚莖中新綠原酸、隱綠原酸和異嗪皮啶3 種有效成分含量均高于葉片中含量，而迷迭香酸含量葉片中高于莖部中，這與包俠萍[7]的研究一致。因此，根據(jù)所需有效成分的差異，選擇不同部位進行采收提取。

本試驗中選取了7~12 月6 個不同采收期，通過對有效成分含量進行測定，結(jié)果表明不同的采收期會引起有效成分含量的顯著變化，藥典規(guī)定的兩種有效成分迷迭香酸和異嗪皮啶，其中迷迭香酸含量均能達到藥典標準（＞0.020%），其中11 月份含量達到最高。而異嗪皮啶含量除9月份外均達到藥典標準（＞0.020%），故而9 月份不建議進行草珊瑚采收。

4.2 結(jié)論

本試驗中選取了7~12 月6 個不同采收期下貴州野生草珊瑚莖、葉片兩個部位來進行有效成分含量測定，新綠原酸、隱綠原酸以及異嗪皮啶在同一個采收期同一個地區(qū)，其莖部位含量要比葉片部位含量高，特別是異嗪皮啶含量差異明顯，而迷迭香酸剛好與之相反，葉片含量要遠遠高于莖部含量。其中9 月份異嗪皮啶含量未達到藥典標準，因此9 月份不進行草珊瑚采收。除在莖中異嗪皮啶含量在8 月達最高外，其余3 種有效成分含量均在11 月達到最高，故需較高含量的新綠原酸、隱綠原酸和迷迭香酸選擇在11 月進行采收，異嗪皮啶選擇在8 月采收。