李銘楊，張軍，翟瑩，何佳琦，邱爽，于海偉，陳炯辛，馬婷婷

大豆的生物信息學(xué)及鹽脅迫表達(dá)分析

李銘楊1，張軍2，翟瑩1＊，何佳琦1，邱爽1，于海偉1，陳炯辛1，馬婷婷1

（1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和高鹽脅迫下表達(dá)量的檢測(cè)。位于大豆基因組9號(hào)染色體上，cDNA全長(zhǎng)1121bp，開放閱讀框615bp，編碼204個(gè)氨基酸。GmNF-YA8蛋白分子量22.7 kD，pI 6.16。GmNF-YA8蛋白氨基酸序列中含有1個(gè)CBF保守結(jié)構(gòu)域。GmNF-YA8蛋白無信號(hào)肽，定位在細(xì)胞核中，屬于親水性蛋白。蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，GmNF-YA8與擬南芥AtNF-YA4和AtNF-YA7的親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，高鹽脅迫處理后的表達(dá)量先上升后下降，在處理10h時(shí)表達(dá)量最高，約為對(duì)照組的4倍，表明在大豆幼苗中能夠響應(yīng)高鹽脅迫。

大豆；核因子Y；生物信息學(xué)；鹽脅迫；表達(dá)分析

大豆中的蛋白質(zhì)含量豐富，是谷類作物的兩倍左右。中國(guó)作為大豆的原產(chǎn)國(guó)，一直將大豆作為食用油的主要原料之一[1]。目前，極端溫度、土壤鹽漬化、干旱等非生物脅迫對(duì)大豆產(chǎn)量影響越來越嚴(yán)重。鹽脅迫會(huì)使細(xì)胞滲透壓發(fā)生改變，導(dǎo)致植物養(yǎng)分流失，不利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，培育出對(duì)土壤鹽漬化有抗性的大豆品種意義重大。

核因子Y（Nuclear factor Y, NF-Y）通常也被稱為CCAAT結(jié)合因子（CCAAT-binding factor, CBF）或亞鐵血紅素激活蛋白（Heme activator protein, HHAP），由NF-YA、NF-YB和NF-YC三個(gè)亞基構(gòu)成，是一種普遍存在于真核生物中的一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族[2]。研究發(fā)現(xiàn)NF-Y在植物應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫（如干旱、鹽害、極端溫度等）中起著重要作用。目前，已有大量植物NF-YA基因耐鹽功能鑒定的相關(guān)報(bào)道。例如，甘藍(lán)型油菜和基因受鹽脅迫的強(qiáng)誘導(dǎo)，且BnNF-YA中的其他成員也不同程度的在鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)[3]。在模式植物擬南芥中，過表達(dá)的擬南芥和小麥基因均可以使擬南芥的耐鹽性增強(qiáng)[4-5]。沉默棉花和會(huì)大幅度降低棉花幼苗的耐鹽性[6]。大豆中存在21個(gè)NF-YA基因[7]。但目前僅的功能被鑒定，其表達(dá)受高鹽、干旱、低溫和ABA誘導(dǎo)，過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性，但對(duì)高鹽脅迫和外源ABA的敏感性增強(qiáng)[8]。本課組前期發(fā)現(xiàn)大豆能被干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)（已另文發(fā)表），本研究對(duì)的基因及蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)其高鹽脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，為后續(xù)基因的功能鑒定及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

大豆“北豆9號(hào)”種子由齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 生物信息學(xué)分析

登陸PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）在線網(wǎng)站，獲得大豆轉(zhuǎn)錄因子的基因和蛋白序列。Expasy在線軟件（https://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)蛋白分子量及等電點(diǎn)。在線軟件PROSITE（https://prosite.expasy.org/）分析大豆GmNF-YA8蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。PSORT在線軟件（http://cello. life.nctu.edu.tw/）預(yù)測(cè)GmNF-YA8蛋白亞細(xì)胞定位情況。通過網(wǎng)站（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/）分析GmNF-YA8蛋白的親/疏水性。使用SignalP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)GmNF-YA8蛋白信號(hào)肽；在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲得GmNF-YA3和擬南芥NF-YA1-10的蛋白序列，由MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 大豆幼苗鹽脅迫處理

將大豆種子播種在沙土和草炭土1∶1均勻混合的花盆中，待大豆幼苗生長(zhǎng)至根長(zhǎng)約5cm，將其移至Hoagland培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至幼苗一片三出復(fù)葉徹底展開后開始脅迫處理。用含200 mmol/L NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液對(duì)大豆幼苗高鹽脅迫。在脅迫處理的0, 1, 2, 5, 10, 24h收集0.1g的第一片三出復(fù)葉（三次重復(fù)），-80℃冰箱保存用于后續(xù)提取RNA。

1.4 基因表達(dá)量的檢測(cè)

用RNAiso Plus（Takara公司）提取高鹽脅迫后各時(shí)間點(diǎn)樣品的RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA（反轉(zhuǎn)錄試劑盒來自Novoprotein公司）。根據(jù)基因序列，通過Premier 5設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）引物，上游引物5′-AGACAGTCCCGTGCTAAAGC-3′，下游引物3′-CGACCTCCACATCCTCTTGC-5′。用上述實(shí)驗(yàn)得到的cDNA為模板，大豆為內(nèi)參基因，-引物同文獻(xiàn)[9]。通過qPCR檢測(cè)基因在高鹽脅迫下的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系和程序設(shè)置同文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 GmNF-YA8生物信息學(xué)分析

2.1.1 GmNF-YA8基因及蛋白序列

基因（Genebank登錄號(hào)NM_001362821）位于大豆第9號(hào)染色體。序列分析結(jié)果如圖1所示，基因cDNA全長(zhǎng)1121bp，開放閱讀框615bp，編碼204個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量22.7kD，pI 6.16。對(duì)蛋白序列功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GmNF-YA8蛋白在107-140位含有一個(gè)CBF結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是基因作為NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族一員的標(biāo)志[11]。對(duì)GmNF-YA8蛋白進(jìn)行信號(hào)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白無信號(hào)肽。

圖1 GmNF-YA8核苷酸及氨基酸序列

下劃線為CBF結(jié)構(gòu)域；陰影為核定位信號(hào)；*為終止密碼子

2.1.2 GmNF-YA8蛋白亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，GmNF-YA8含有一個(gè)核定位信號(hào)（圖1）。如表1所示，GmNF-YA8蛋白定位在細(xì)胞核的分值最高（4.622），推測(cè)GmNF-YA8蛋白定位在細(xì)胞核，這與大部分NF-YA蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果相同[12]。也有NF-YA蛋白定位于細(xì)胞膜上的報(bào)道，例如SiNF-YA6蛋白定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，推測(cè)定位在細(xì)胞膜上該蛋白會(huì)被其他蛋白修飾后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用[13]。

表1 GmNF-YA8蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.1.3 GmNF-YA8蛋白親/疏水性分析

對(duì)GmNF-YA8蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果如圖2所示，GmNF-YA8蛋白疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第92位（1.444），親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第173位（-3.589），GmNF-YA8蛋白的多肽鏈大多分布在0刻線以下區(qū)域。由此表明GmNF-YA8蛋白具有很強(qiáng)的親水性，屬于親水蛋白。

2.2 NF-YA蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

將大豆GmNF-YA3、GmNF-YA8與10個(gè)擬南芥NF-YA蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖3所示，GmNF-YA8與AtNF-YA4和AtNF-YA7的親緣關(guān)系最近，由此推測(cè)它們的功能可能存在相似性。此外，GmNF-YA8與同為大豆的GmNF-YA3不在同一分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此推測(cè)NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族的分化或許先于擬南芥與大豆之間物種的分化[14]。

圖2 GmNF-YA8蛋白親/疏水性分布曲線

圖3 植物NF-YA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 GmNF-YA8在高鹽脅迫下的表達(dá)

以高鹽脅迫處理0h的大豆幼苗為對(duì)照，通過qPCR對(duì)在鹽脅迫各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖4），在鹽脅迫下的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在處理10 h表達(dá)量出現(xiàn)峰值，大約是對(duì)照組的4倍。這一結(jié)果與狗牙根在鹽脅迫下的表達(dá)情況相似[15]，但谷子在鹽脅迫處理1～24h的表達(dá)量是逐漸升高的，并無下降趨勢(shì)[13]。由此推測(cè)NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族成員在不同物種中對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制存在差異。

圖4 GmNFYA8在高鹽脅迫下的表達(dá)

不同字母表示差異顯著（小于0.05）

3 結(jié)論

位于大豆基因組9號(hào)染色體上，開放閱讀框615bp，編碼204個(gè)氨基酸。蛋白分子量22.7kD，pI 6.16。GmNF-YA8蛋白無信號(hào)肽，定位在細(xì)胞核中，屬于親水性蛋白。GmNF-YA8與AtNF-YA4和AtNF-YA7的親緣關(guān)系最近。高鹽脅迫處理后，的表達(dá)量先上升后下降，表明在大豆幼苗中能夠響應(yīng)高鹽脅迫。

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Bioinformatics and salt stress expression analysis of the soybean

LI Ming-yang1，ZHANG Jun2，ZHAI Ying1＊，HE Jia-qi1，QIU Shuang1，YU Hai-wei1，CHEN Jiong-xin1，MA Ting-ting1

(1.College of Life Science and Agroforestry, Qiqihar University, Heilongjiang Qiqihar 161006, China; 2.Branch of Animal Husbandry and Veterinary of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Heilongjiang Qiqihar 161005, China)

In this research, the bioinformatics analysis of soybeanand its expression levels under high salt stress were carried out.was located on chromosome 9 of the soybean genome. Its full-length cDNA was 1121bp with an open reading frame of 615bp and encoded 204 amino acids. The molecular weight of GmNF-YA8protein was 22.7 kD and pI was 6.16. The amino acid sequence of GmNF-YA8protein contained a CBF conserved domain. GmNF-YA8protein had no signal peptide and was located in the nucleus, which was a hydrophilic protein. Phylogenetic analysis showed that GmNF-YA8 is the most closely related toAtNF-YA4 and AtNF-YA7. Real-time fluorescence quantitative PCR results showed that the expression levels ofelevated firstly and then decreased after high salt stress treatment. The peak expression occurred 10 h after treatment, which was about 4 times that of the control group. These results indicated thatcould respond to high salt stress in soybean seedlings.

soybean；nuclear factor Y；bioinformatics；salt stress；expression analysis

2021-11-24

黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃（UNPYSCT-2017153）；齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2020041）

李銘楊（1998-），女，黑龍江綏化人，本科，主要從事植物分子遺傳育種研究，lmy879463529@163.com。

翟瑩（1982-），女，吉林吉林人，教授，博士，主要從事植物分子遺傳育種研究，fairy39809079@126.com。

S565.1

A

1007-984X(2022)03-0070-04