張靜嫻， 孫 健， 陳 軍， 吳清臣， 毛秀紅， 胡 青*， 季 申*

(1.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；2.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 200030)

痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹5味藥材組成，具有清熱解毒、止咳化痰的作用，臨床上廣泛用于治療發(fā)熱、急性支氣管炎、急性肺炎、慢性阻塞性肺炎等[1-7]，還具有抗病毒、抗菌作用[8-10]，其主要成分有黃酮、酚酸、氨基酸、膽酸等[11-14]。該制劑現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中有2項(xiàng)特征圖譜[15]，分別反映山羊角、金銀花中氨基酸、酚酸類成分，但尚無反映君藥黃芩所含成分的特征圖譜，僅測定了黃芩苷、野黃芩苷含量，另外只有文獻(xiàn)[7]報(bào)道了同時(shí)測定蘆丁、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷等6種成分的含量。因此，本實(shí)驗(yàn)建立痰熱清注射液特征圖譜，并以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，通過一測多評(píng)法測定野黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提升提供參考。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配置四元泵、光電二極管陣列檢測器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、ChemStation工作站)；BP211D電子天平(0.01 mg，德國Sartorius公司)。黃芩苷(批號(hào)110715-201619)、野黃芩苷(批號(hào)110842-200102)對照品購自中國食品藥品檢定研究院；千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批號(hào)100286)、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批號(hào)100271)對照品購自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司。痰熱清注射液樣品共33批，包括2016年13批(編號(hào)S1～S13，批號(hào)分別為1605205、1605206、1607115、1607116、1608216、1608217、1610210、1610211、1611315、1611316、1612219、1612220、1612311)、2017年10批(編號(hào)S14～S23，批號(hào)分別為1711218、1711219、1711220、1711221、1711222、1711223、1711224、1711225、1711216、1712201)、2018年10批(編號(hào)S24～S33，批號(hào)分別為1802210、1802211、1802212、1803209、1803207、1803208、1804314、1803210、1803220、1803221)，由上海凱寶藥業(yè)股份有限公司提供。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，購自德國Merck 公司；其余試劑均為分析純；水為超純水，由美國Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 特征圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×25 cm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～30 min，15%～30%A；30～60 min，30%A)；體積流量0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取野黃芩苷、黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為25、80、50、25 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取本品5 mL，置于20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 專屬性試驗(yàn) 通過與對照品保留時(shí)間比對，確定5、10～12號(hào)峰分別為野黃芩苷、黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷，陰性無干擾，見圖1。

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液(S1)適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，去除黃芩苷峰后導(dǎo)出AIA數(shù)據(jù)，采用“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件計(jì)算相似度，發(fā)現(xiàn)均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(S1)6支，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，去除黃芩苷峰后導(dǎo)出AIA數(shù)據(jù)，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件計(jì)算相似度，發(fā)現(xiàn)均大于0.99，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(S1)適量，室溫下于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，去除黃芩苷峰后導(dǎo)出AIA數(shù)據(jù)，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件計(jì)算相似度，發(fā)現(xiàn)均大于0.98，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 圖譜生成與相似度評(píng)價(jià) 取33批樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，獲得特征圖譜，以保留時(shí)間適中的黃芩苷(10號(hào)峰)為參照，共確定了12個(gè)特征峰。去除黃芩苷峰后導(dǎo)出AIA數(shù)據(jù)，導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件進(jìn)行色譜峰匹配，采用平均值法生成對照特征圖譜，見圖2。再計(jì)算相似度，結(jié)果見表1，可知均大于0.97。

表1 33批樣品相似度Tab.1 Similarities of thrity-three batches of samples

2.2 一測多評(píng)法測定各成分含量

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取野黃芩苷、黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的貯備液，分別精密量取2.5、8.0、5.0、2.5 mL至同一量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別為125、400、250、125 μg/mL的對照品溶液，分別吸取0.2、0.4、2、4、5 mL至5 mL量瓶中，即得[野黃芩苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷質(zhì)量濃度(L1～L5)分別為5、10、50、100、125 μg/mL，黃芩苷質(zhì)量濃度(L1～L5)分別為16、32、160、320、400 μg/mL，千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷質(zhì)量濃度(L1～L5)分別為10、20、100、200、250 μg/mL]。

5. 野黃芩苷 10. 黃芩苷 11. 千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷12.白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷5. scutellarin 10. baicalin 11. oroxylin A-7-O-glucoronide12.chrysin-7-O-glucoronide圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

5. 野黃芩苷 10. 黃芩苷 11. 千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷 12. 白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷5. scutellarin 10. baicalin 11. oroxylin A-7-O-glucoronide 12. chrysin-7-O-glucoronide圖2 對照特征圖譜Fig.2 Reference characteristic chromatogram

2.2.3 供試品溶液制備 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，用于野黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量測定。另精密量取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液1 mL至20 mL量瓶中，加水溶解置刻度，搖勻，用于黃芩苷含量測定。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear ranges of various constituents

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得野黃芩苷、黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD分別為0.48%、0.29%、0.37%、0.38%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(S1)適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得野黃芩苷、黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量RSD分別為1.27%、0.69%、1.02%、1.13%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(S1)適量，室溫下于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得野黃芩苷、黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD分別為1.32%、0.31%、0.39%、0.39%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 黃芩苷：由于本品中黃芩苷含量高，故在加樣回收率試驗(yàn)中適當(dāng)減量，即供試品制備方法更改為“精密量取本品0.5 mL，置于2 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1 mL至20 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得”。同時(shí)，取樣量減半，即精密量取本品0.25 mL(S1)9份，置于2 mL量瓶中，分別精密加入對照品溶液(約1.6 mg/mL)0.5、1.0、1.5 mL各3份，分別相當(dāng)于原有量的50%(低質(zhì)量濃度)、100%(中質(zhì)量濃度)、150%(高質(zhì)量濃度)，加水至刻度，搖勻，精密量取1 mL至20 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

野黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷：精密量取本品2.5 mL(S1)9份，置于20 mL量瓶中，精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0 mL各3份，分別相當(dāng)于原有量的50%(低質(zhì)量濃度)、100%(中質(zhì)量濃度)、150%(高質(zhì)量濃度)，加水稀釋至刻度，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.3 Results of recovery tests for various constituents(n=9)

2.2.5 內(nèi)標(biāo)選擇 黃芩苷、野黃芩苷對照品容易獲取，而千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷對照品目前僅江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司有售，價(jià)格昂貴。由于黃芩苷色譜峰保留時(shí)間適中，故選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

2.2.6 相對保留時(shí)間、相對校正因子測定 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)計(jì)算其他3種成分的相對保留時(shí)間ti/s和相對校正因子fi/s，公式分別為ti/s=ti/ts(ti為其他成分保留時(shí)間，ts為內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間)、fi/s=fi/fs=As×Ci/(Ai×Cs)(Ci為其他成分含量，Ai為其他成分峰面積，Ci為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積)，結(jié)果見表4，可知兩者RSD均小于1.5%，表明其穩(wěn)定性良好。

表4 各成分相對保留時(shí)間、相對校正因子測定結(jié)果(n=2)Tab.4 Results of relative retention time and relative correction factor determination of various constituents

2.2.7 耐用性試驗(yàn)

2.2.7.1 體積流量 本實(shí)驗(yàn)取對照品溶液(野黃芩苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷質(zhì)量濃度為25 μg/mL，黃芩苷質(zhì)量濃度為80 μg/mL，千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷質(zhì)量濃度為50 μg/mL)適量，考察了體積流量0.7、0.8、0.9 mL/min對相對保留時(shí)間和相對校正因子的影響，結(jié)果見表5。由此可知，野黃芩苷受體積流量影響較大，其他2種成分受其影響較小，但為了保證千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷色譜峰的分離度，故體積流量不高于0.9 mL/min。

表5 各成分耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of durability tests for various constituents

2.2.7.2 柱溫 本實(shí)驗(yàn)考察了柱溫20、25、30 ℃對相對校保留時(shí)間和相對校正因子的影響，結(jié)果見表5。由此可知，野黃芩苷受柱溫影響較大，其他2種成分受其影響較小，并且在20、25 ℃時(shí)相對校正因子接近，故柱溫不高于25 ℃。

2.2.7.3 色譜柱 本實(shí)驗(yàn)考察了Diamonsil Plus C18(5 μm，4.6 mm×25 cm)(A)、Agilent Eclipse Plus C18(5 μm，4.6 mm×25 cm)(B)、Agilent SB-C18(5 μm，4.6 mm×25 cm)(C)色譜柱對相對保留時(shí)間和相對校正因子的影響，結(jié)果見表5。由此可知，各成分相對保留時(shí)間相對穩(wěn)定；野黃芩苷相對校正因子受色譜柱影響較大，其他2種成分也有一定程度影響；當(dāng)采用色譜柱B、C時(shí)，千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷色譜峰的分離度略有降低，可能是其RSD偏大的原因，故在選擇色譜柱時(shí)兩者色譜峰必須達(dá)到基線分離。

2.2.7.4 儀器 本實(shí)驗(yàn)考察了Agilent 1260(A)、Agilent 1290(B)色譜儀(均配置二元泵)對相對保留時(shí)間和相對校正因子的影響，發(fā)現(xiàn)各成分兩者RSD均小于1.6%，可見色譜儀對其無明顯影響。

2.2.7.5 結(jié)論 當(dāng)檢測條件發(fā)生變化時(shí)，各成分相保留時(shí)間相對穩(wěn)定；千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷相對校正因子耐用性較好，而野黃芩苷相對校正因子受條件變化的影響較大，不適合采用一測多評(píng)法。由于野黃芩苷對照品易得，故采用外標(biāo)法測定其含量。

2.2.8 樣品含量測定 取9批樣品(S3～S4、S12、S14、S17、S20、S24～S25、S28)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、一測多評(píng)法測定含量，結(jié)果見表6。由此可知，2種方法所測野黃芩苷含量相對偏差較大，其中一測多評(píng)法偏低；其他2種成分含量基本一致，表明可以用一測多評(píng)法代替外標(biāo)法測定兩者含量。

表6 各成分含量測定結(jié)果(Ⅰ)Tab.6 Results of content determination of various constituents(Ⅰ)

同法測定33批樣品中各成分含量，結(jié)果見表7，可知同一年份不同批次樣品中各成分含量RSD均小于10%(2016年樣品中野黃芩苷含量除外)，表明其一致性較好。現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中，黃芩苷、野黃芩苷含量限度規(guī)定為“本品每1 mL含黃芩以黃芩苷(C21H18O11)計(jì)，應(yīng)為5.0～8.0 mg；以野黃芩苷(C21H18O12)計(jì)，應(yīng)為50～150 μg”，本實(shí)驗(yàn)33批樣品均滿足上述要求。以各成分含量平均值的±50%為上下限范圍，規(guī)定每1 mL本品含千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷100～300 μg、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷50～150 μg。

表7 各成分含量測定結(jié)果(Ⅱ)Tab.7 Results of content determination of various constituents(Ⅱ)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)痰熱清注射液制備工藝[15]，將黃芩水煎液經(jīng)調(diào)節(jié)pH值、醇沉后得提取物，再將其與其他藥材提取物合并，通過調(diào)節(jié)pH值、超濾、滅菌等步驟制得成品，主要保留了黃芩中大極性黃酮苷類成分。再對中間體黃芩提取物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃芩素含量較高，但在制備過程中該成分已基本不存在，而千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷被進(jìn)一步富集，故在痰熱清注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升中很有必要增加這2種成分的含量測定，但兩者對照品難以獲取，價(jià)格昂貴，故本實(shí)驗(yàn)建立一測多評(píng)法[16-18]，以容易獲取的黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，并對相對保留時(shí)間、相對校正因子的耐用性進(jìn)行考察。

痰熱清注射液中黃芩苷、野黃芩苷含量相差100倍，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要2種測定方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，本實(shí)驗(yàn)通過稀釋供試品溶液，在同一個(gè)色譜條件下進(jìn)行含量測定，可大大提高分析效率。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)針對痰熱清注射液中黃芩所含成分質(zhì)量控制不夠全面的問題，建立了特征圖譜和一測多評(píng)含量測定方法，進(jìn)行了全面的方法學(xué)考察，并根據(jù)33批樣品中野黃芩苷、黃芩苷、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量測定結(jié)果，給新增成分制訂了限度，對該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提升具有重要參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。