董雪靜，朱 華，王 穎

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實驗中心，南寧 530200）

原發(fā)性肝癌（Primary Liver Cancer，PLC）包括肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC）和其他罕見類型［1］，其中HCC 最為常見，約占90%［2］。HCC 起源于肝細(xì)胞，常見的引發(fā)原因是氧化應(yīng)激、炎癥和其他潛在的肝病［3］。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）2018年的數(shù)據(jù)顯示，目前肝癌的死亡率在所有癌癥死亡率中排名第四位，發(fā)生率排名第六位［4］。每年全球新發(fā)肝癌患者超過80 萬例，死亡患者超過78 萬例［5］，預(yù)計未來10 年新增病例會持續(xù)增加［6］。

大蒜素是從百合科蔥屬植物大蒜鱗莖中提取的含硫化合物，主要成分為二烯丙基二硫化物（Diallyl disulfide，DADS）和二烯丙基三硫化物（Diallyl trisulfide，DATS）［7］，具有抗腫瘤、降血壓、抗細(xì)菌、提高免疫等多種作用。雖然有關(guān)大蒜素的藥理機制及臨床應(yīng)用研究不斷出現(xiàn)，但其與肝癌的分子作用機制尚未明確。

近年來興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計算機技術(shù)等多學(xué)科的技術(shù)［8］，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，揭示多分子協(xié)同作用于人體的規(guī)律及機制。這種從多靶點角度出發(fā)探索疾病與藥物之間相關(guān)性的方法，與傳統(tǒng)中醫(yī)藥的整體觀念和辨證論治相符［9］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對大蒜素作用靶點和HCC 相關(guān)的疾病靶點進(jìn)行篩選，構(gòu)建大蒜素與HCC 相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，通過生物信息學(xué)分析結(jié)合生存分析和免疫浸潤力求深入揭示二者的相互作用機制。

1 材料與方法

1.1 大蒜素化學(xué)成分靶點的收集與篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/）檢索大蒜素的有效成分信息，下載并保存為mol2 格式文件。將TCMSP 中篩選出的大蒜素化學(xué)成分分子結(jié)構(gòu)以mol2 格式上傳至PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/），基于反向藥效團匹配法篩選藥物的藥效團模型，勾選Human Protein Targets Only，設(shè)置最大生成300 個蛋白構(gòu)象，得到與大蒜素相關(guān)的靶點名稱、Fit score 等信息。

1.2 大蒜素有效成分靶點蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為探索靶點蛋白之間的相互作用，將“1.1”得到的大蒜素潛在靶點信息導(dǎo)入蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫STRING11.0（https：//string-db.org/），研究物種設(shè)為人類，得到蛋白互作關(guān)系。將STRING11.0 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出的文件，利用Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行可視化分析，調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點、邊等屬性，最終得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。其中，節(jié)點代表有效成分或疾病靶點，邊代表有效成分與疾病靶點相關(guān)聯(lián)［10］。節(jié)點度表示與某一成分相連靶點的個數(shù)，數(shù)值越大，說明與該成分相關(guān)疾病靶點越多，其發(fā)揮治療作用越大。

1.3 HCC 相關(guān)靶點的收集

利 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫收集與HCC 相關(guān)的靶點。按相關(guān)度由大到小排列，取前300 個靶點。GeneCards［11］是一個綜合性的數(shù)據(jù)庫，包括人類基因（GeneCards）、人類疾?。∕alaCards）、人類通路（PathCards）等數(shù)據(jù)庫，能夠提供簡明的基因組、蛋白質(zhì)組、遺傳等人類基因數(shù)據(jù)，為基因疾病領(lǐng)域內(nèi)的生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)提供豐富資源。

1.4 大蒜素對HCC 潛在作用靶點的收集

將“1.2”中從STRING11.0 數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出文件中的node1 和node2 兩列靶點蛋白進(jìn)行整合，篩去重復(fù)靶點，并與“1.3”中收集的300 個HCC 相關(guān)靶點，利用

Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）工具進(jìn)行交集比對，最終獲得大蒜素治療HCC 的潛在作用靶點。

1.5 潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)和拓?fù)鋵W(xué)分析

將“1.4”中獲得的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING11.0 數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為人類，得到蛋白互作關(guān)系，導(dǎo)出為TSV 格式，再運用Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.6 潛在作用靶點的表達(dá)及生存預(yù)后分析

將“1.4”中獲得的潛在靶點導(dǎo)入GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/），癌癥名稱選擇LIHC，繪制基因表達(dá)圖和生存分析圖。GEPIA［12］是一個基于Web 的工具，可以基于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫提供交互式和可自定義功能，包括差異表達(dá)分析、輪廓圖繪制、患者存活率分析、相似基因檢測等。

1.7 腫瘤細(xì)胞免疫浸潤分析

將“1.6”中得到的具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的基因?qū)隩IMER 數(shù)據(jù)庫（http：//cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/），得到其與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系。TIMER［13］是一個交互式的數(shù)據(jù)庫，運用其獨特的反卷積方法，可以全面靈活地從基因表達(dá)譜中推斷TIIC 的豐富度。通過Spearman 的相關(guān)性和統(tǒng)計學(xué)顯著性評價基因表達(dá)的相關(guān)性，并通過以下絕對值指南確定相關(guān)性的強弱：0～0.19 表示非常弱，0.20～0.39 表示弱，0.40～0.59 表示中等，0.60～0.79 表示強，0.80～1.00 表示非常強［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其潛在靶點信息

根據(jù)PharmMapper 數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)查找大蒜素已報道的靶點，剔除非人源靶點，最終得到大蒜素的潛在靶點194 個，其中包括FABP3、GSTA1、MAPK8、MMP3、CASP1 等。大蒜素的靶點相互作用如圖1 所示。關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中靶點詳細(xì)信息見表1，表中僅列出度值最高的前30 個靶點。

表1 大蒜素蛋白互作拓?fù)鋵W(xué)分析（度值排序前30 位）

圖1 大蒜素蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.2 HCC 相關(guān)靶點的預(yù)測與潛在治療靶點的收集

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共篩選出4 781 個基因，根據(jù)相關(guān)度由大到小取前300 個靶點。將“2.1”得到的大蒜素的194 個靶點與HCC 發(fā)病機制的300 個靶點利用Venny2.1.0 進(jìn)行映射，得到共同靶點31 個，包 括CCNA2、BCL2L1、MAPK8、CASP3、PARP1、ESR1、MMP9 等。大蒜素成分靶點與HCC 相關(guān)發(fā)病機制靶點韋恩圖如圖2 所示。

圖2 大蒜素成分靶點與HCC 相關(guān)發(fā)病機制靶點韋恩圖

2.3 大蒜素對HCC 作用靶點的拓?fù)鋵W(xué)分析

為了更直觀地表示潛在治療靶點間的相互關(guān)系，將31 個潛在靶點導(dǎo)入STRING11.0 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，如圖3 所示，將得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。經(jīng)Network Analyzer 分析發(fā)現(xiàn)，平均最短路徑長度在1.100～2.000，平均度值為16.45，平均介數(shù)為0.016，平均聚類系數(shù)為0.75（表2）。網(wǎng)絡(luò)分析中介數(shù)值和度值是2 個重要參考指標(biāo)［15］，介數(shù)值越大，度值越高，說明該點越有可能是治療HCC 的關(guān)鍵靶點。

表2 大蒜素對HCC 潛在作用靶點的拓?fù)鋵W(xué)分析

圖3 大蒜素對HCC 潛在作用靶點的蛋白互作關(guān)系

2.4 潛在作用靶點表達(dá)量的差異及生存分析

將31 個潛在靶點依次輸入GEPIA 數(shù)據(jù)庫，選擇兩組間方差分析，得到靶點在正常組織與HCC組織中表達(dá)水平的箱圖（圖4）。結(jié)果顯示，31 個潛在靶點中有AURKA、CCNA2、MMP9、ESR14 個基因的P小于0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與正常組織（n=160）相比，CCNA2、AURKA、MMP93 個基因的表達(dá)量在HCC 組織中（n=369）顯著升高，ESR1的表達(dá)量較低。繼續(xù)將4 個基因?qū)隚EPIA 數(shù)據(jù)庫，繪制Kaplan-Meier 曲線，進(jìn)一步分析4 個基因的表達(dá)情況對HCC 患者干預(yù)后的影響（圖5）。各組的P均小于0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明CCNA2、AURKA、MMP9、ESR14 個基因的表達(dá)對HCC 患者的干預(yù)后有影響。

圖4 靶點在正常組織和HCC 組織中的相對表達(dá)量差異

圖5 4 個基因的表達(dá)量與HCC 患者的干預(yù)后關(guān)系

2.5 腫瘤細(xì)胞免疫浸潤分析

將CCNA2、AURKA、MMP9、ESR14 個基因?qū)隩IMER 數(shù)據(jù)庫，評估其表達(dá)與免疫浸潤水平的相關(guān) 性。AURKA的 表 達(dá) 與B 細(xì) 胞（r= 0.424，P=2.01e-16）、CD8+T 細(xì) 胞（r= 0.258，P=1.31e-06）、CD4+T 細(xì) 胞（r=0.135，P=1.24e-02）、巨 噬 細(xì) 胞（r= 0.301，P=1.42e-08）、中性粒細(xì)胞（r= 0.308，P= 4.99e-09）和樹突細(xì)胞（r= 0.340，P= 1.18e-10）的浸潤水平呈正相關(guān)，如圖6A 所示。

CCNA2的表達(dá)與HCC 中B 細(xì)胞（r= 0.476，P=7.31e-21）、CD8+T 細(xì)胞（r= 0.354，P= 1.63e-11）、CD4+T 細(xì)胞（r= 0.318，P= 1.60e-09）、巨噬細(xì)胞（r=0.402，P=1.21e-14）、中性粒細(xì)胞（r=0.366，P=2.41e-12）、樹突細(xì)胞（r= 0.489，P= 8.02e-22）的浸潤水平呈明顯的正相關(guān)，如圖6B 所示。

ESR1的表達(dá)與HCC 中B 細(xì)胞（r= -0.216，P=5.22e-05）、CD8+T 細(xì) 胞（r= -0.060，P=2.69e-01）、CD4+T 細(xì)胞（r= -0.044，P=4.16e-01）、巨噬細(xì)胞（r= -0.129，P=1.68e-02）、中性粒細(xì)胞（r=-0.039，P=4.71e-01）、樹突細(xì)胞（r=-0.080，P=1.39e-01）的浸潤水平呈負(fù)相關(guān)，如圖6C 所示。

MMP9的表達(dá)與HCC 中B 細(xì)胞（r= 0.529，P=3.05e-26）、CD8+T 細(xì) 胞（r=0.421，P= 4.13e-16）、CD4+T 細(xì)胞（r= 0.356，P=9.68e-12）、巨噬細(xì)胞（r=0.473，P=2.12e-20）、中性粒 細(xì)胞（r=0.340，P=8.96e-11）和樹突細(xì)胞（r= 0.584，P=1.72e-32）的浸潤水平呈正相關(guān)，如圖6D 所示。

圖6 4 個基因的表達(dá)與HCC 中免疫浸潤水平的相關(guān)性

3 討論

HCC 是一種獨特的癌癥，通常發(fā)生在慢性肝病的背景下，其發(fā)生率取決于宿主、疾病和環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用，其主要危險因素是慢性感染乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）、黃曲霉毒素B1污染的食品、大量飲酒、肥胖和Ⅱ型糖尿病等［16-19］。雖然普遍接種HBV 疫苗大大降低了HBV的感染率［20］，但其他因素導(dǎo)致的HCC 還未得到有效的治療方法。試驗研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素具有良好的抗癌、防癌作用，可以通過增強巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用，提高腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能［21］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，借助TCMSP、PharmMapper、GeneCards、STRING11.0、Venny2.1.0 等數(shù)據(jù)庫，富集得到大蒜素作用于HCC 的31 個潛在靶點。對31 個靶點進(jìn)行表達(dá)量分析和生存分析，得到4 個P小于0.05 的靶點，又進(jìn)行細(xì)胞免疫浸潤分析。

生存 分析 的KM 曲 線 顯示，CCNA2、AURKA、MMP9、ESR14 個基因的表達(dá)對HCC 患者的預(yù)后均有影響，各組P均小于0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可以認(rèn)為大蒜素可能通過這4 個靶點對HCC 發(fā)生作用。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞是癌前哨淋巴結(jié)狀態(tài)和生存率的獨立預(yù)測因子［22］。根據(jù)Spearman 的相關(guān)性和統(tǒng)計學(xué)顯著性評價指南，AURKA的表達(dá)水平與B 細(xì)胞的浸潤水平之間存在中度的正相關(guān)，CCNA2的表達(dá)水平與B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹突細(xì)胞的浸潤水平之間存在中度的正相關(guān)，MMP9的表達(dá)水平與B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹突細(xì)胞的浸潤水平之間存在中度的正相關(guān)。CCNA2屬于細(xì)胞周期蛋白A2 家族，參與細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，在人體多種組織中都有表達(dá)，且在癌癥組織中表達(dá)增多［23］。Kim 等［24］通過研究發(fā)現(xiàn)，CCNA2轉(zhuǎn)錄起始位點的遺傳變異與肺癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險顯著增加，但與乳腺癌或胃癌的風(fēng)險沒有明顯關(guān)系，表明CCNA2對人類癌癥發(fā)展的遺傳變異可能具有組織特異性。Sakamoto等［25］通過RT-PCR（半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）檢測發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的MMP9mRNA 表達(dá)水平高于非腫瘤組織，提示腫瘤組織中MMP9的表達(dá)可能與小肝細(xì)胞癌的發(fā)展有關(guān)，可能促進(jìn)HCC 的早期生長。雌激素受體1（ESR1）可以通過免疫應(yīng)答參與免疫調(diào)節(jié)［26］。Okasha 等［27］的研究表明，雌激素能夠影響CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的產(chǎn)生，并且在體內(nèi)誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡。HNF-4a 是控制肝細(xì)胞代謝和分化以及正常肝結(jié)構(gòu)發(fā)育的關(guān)鍵因素［28］。Wang 等［29］通過研究發(fā)現(xiàn)，ESR1可以通過阻斷HNF-4a 與HBV 增強劑的結(jié)合，削弱HBV 轉(zhuǎn)錄，從而減緩慢性肝病發(fā)展。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，結(jié)合細(xì)胞生存及免疫浸潤分析，初步探討了大蒜素多靶點、多通路治療HCC 的可能作用機制，篩選出大蒜素治療HCC 可能涉及的干預(yù)后相關(guān)基因，這些干預(yù)后相關(guān)基因可以作為潛在的生物標(biāo)志物，為后續(xù)的試驗研究提供指導(dǎo)，但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)的局限性以及其他因素影響，具體作用機制還需要后續(xù)更多針對性的試驗加以驗證。