程 易，馬粵婷，吳日紅，徐 瑜，楊舒凌，王永霞

海南醫(yī)學院教育部熱帶病重點實驗室，海南?？?571109

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種新型免疫檢測技術，其測定原理是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合反應及酶催化底物的高效放大作用，實現(xiàn)對目標分子的高靈敏檢測[1-2]。由于操作簡便、快速、特異性好、檢測成本低且不需要復雜設備等，ELISA是目前臨床和科研實驗室應用最為廣泛的免疫分析技術之一[3-4]。但傳統(tǒng)ELISA由于酶標抗體上標記的酶分子數(shù)量有限導致檢測靈敏度不高，傳統(tǒng)ELISA只能檢測水平大于10-12mol/L的目標物質(zhì)，但在惡性腫瘤、感染、自身免疫疾病及超敏反應性疾病的早期階段，大部分目標分子水平為10-16～<10-12mol/L，傳統(tǒng)ELISA難以檢測[5-7]。納米金(AuNPs)因顆粒小、比表面積大、生物相容性好逐漸成為生物醫(yī)學領域的研究熱點[8-9]。本研究擬將AuNPs作為信號放大載體，通過金-硫鍵結(jié)合生物素化DNA(DNA-B)，構(gòu)建納米金生物素化DNA(AuNPs@DNA-B)信號探針，將該探針借助生物素-親和素的高親和力結(jié)合于檢測抗體上，實現(xiàn)信號高效放大的目的，并選擇血清含量極低、易引起過敏性疾病的抗體免疫球蛋白(Ig)E作為目標分子，驗證該檢測平臺的信號放大效果。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 全功能微孔板檢測酶標儀(BioTek Synergy H1)購于美國伯騰儀器有限公司；P9紫外-可見分光光度計購于上海美譜達儀器有限公司；高分辨率透射電鏡(JEM 2100)購于日本電子株式會社；高速冷凍離心機(Microfuge?20R)購于貝克曼庫爾特(美國)股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(BPX-162)購于上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；搖床(SLK-O3000-S)購于上海珂淮儀器有限公司。氯金酸(分子式：HAμCl4·4H2O；分析純，批號：JG9031901)購于上海思域化工科技有限公司；二水合枸櫞酸三鈉(分子式：C6H5Na3O7·2H2O，分析純)購于西隴科學股份有限公司；人IgE ELISA反應板及試劑盒購于欣博盛生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記親和素(SA-HRP)和重組鏈霉親和素(SA，分析純)購于上海碧云天生物技術有限公司；DNA-B[5′-SH-(CH2)6-TTTTTTGTCAGCCAGTGTAC-biotin-3′]由上海生工生物工程有限公司合成。0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)購于賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1改良ELISA檢測IgE的原理 首先制備13 nm AuNPs，設計合成一段含20個堿基的DNA-B序列，其5′端經(jīng)巰基化修飾，3′端經(jīng)生物素化修飾，將AuNPs與DNA-B通過金-硫鍵結(jié)合形成AuNPs@DNA-B作為本實驗的信號探針。當IgE存在時，通過與微孔板上包被抗體的結(jié)合捕獲IgE，再與Ab-B結(jié)合形成夾心“三明治”結(jié)構(gòu)。信號探針AuNPs@DNA-B在鏈霉親和素的輔助下與生物素化抗體結(jié)合而被固定在微孔板表面，洗滌后加入SA-HRP，以TMB和H2O2作為顯色底物，待檢物在一定水平范圍內(nèi)，其水平與顯色深淺呈正相關。由于13 nm AuNPs比表面積大，DNA-B分子小、空間位阻小，每個AuNPs均可結(jié)合大量DNA-B分子，實現(xiàn)對檢測信號的高效放大作用，且DNA-B中的DNA分子5′端經(jīng)巰基化修飾后可與AuNPs通過金-硫鍵共價結(jié)合，DNA-B分子不易脫落，背景信號較低，信噪比較高，該方法與傳統(tǒng)ELISA相比，可大大提高檢測靈敏度。

1.2.2枸櫞酸三鈉還原氯金酸法[10]制備13 nm AuNPs 取100 mL 0.01%氯金酸溶液在控溫攪拌器中加熱至沸騰后，邊攪拌邊加入4.8 mL新鮮配制的1%枸櫞酸三鈉。溶液由淡黃色逐漸變?yōu)樯钭霞t色，最后變?yōu)榫萍t色，攪拌至溶液顏色不再變化，撤去熱源，繼續(xù)攪拌10 min。待溶液冷卻至室溫后恢復至原體積，4 ℃保存。采用紫外-可見分光光度計和透射電鏡對制備的AuNPs進行表征。

1.2.3制備AuNPs@DNA-B信號探針 室溫下，將一定量的100 μmol/L DNA-B加入5 mL制備好的AuNPs溶液中，置于搖床緩慢搖動(200 r/min)。期間每隔4小時依次加入2 mmol/L NaCl溶液20、45、55、65、90 μL，12 000 r/min，6 ℃離心30 min。吸出上清液后加入0.01 mmol/L(pH 7.4)的PBS重懸沉淀，洗滌2次，最后1次離心后加入5 mL 15%牛血清清蛋白(BSA)，室溫搖床搖動6 h后，12 000 r/min離心30 min，洗滌2次，沉淀儲存于4 ℃?zhèn)溆?。采用紫?可見分光光度計和透射電鏡對制備的探針進行表征。

1.2.4DNA-B結(jié)合AuNPs條件的優(yōu)化 (1)DNA-B用量的優(yōu)化。分別將2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4 μL 100 μmol/L DNA-B加入200 μL AuNPs溶液中。室溫下置于搖床搖動24 h(200 r/min)，加入2 mmol/L NaCl溶液老化探針，離心取沉淀洗滌2次后測A260。實驗重復3次。(2)DNA-B與AuNPs結(jié)合時間的優(yōu)化。選擇最佳結(jié)合量的AuNPs和DNA-B，200 r/min下分別結(jié)合12、16、20、24、28、32、36、40 h，加入2 mmol/L NaCl溶液使探針老化后離心，重懸后取沉淀測A260。實驗重復3次。

1.2.5最佳反應條件的選擇 選取強陽性(4 ng/mL)的IgE標準品作為優(yōu)化反應條件的待測物，生物素化抗IgE抗體(Ab-B)用量由傳統(tǒng)ELISA優(yōu)化獲得，采用棋盤滴定法對SA、AuNPs@DNA-B復合物用量進行優(yōu)化。同時將SA-HRP從1∶1 000～1∶3 000做一系列稀釋，在Ab-B、SA和AuNPs@DNA-B復合物最佳工作濃度下對SA-HRP的用量進行優(yōu)化。實驗重復3次。同時設置陰性對照和空白對照。

1.2.6標準曲線的繪制 將IgE標準品從0～30 ng/mL進行一系列稀釋，分別取100 μL加入反應板中，37 ℃孵育90 min。洗滌后加入100 μL Ab-B，37 ℃孵育60 min，洗滌，加入100 μL 5 μg/mL的SA 37 ℃孵育30 min，洗滌，加入100 μL AuNPs@DNA-B孵育30 min，洗滌后加入1∶2 000 SA-HRP孵育30 min，洗滌后分別加入100 μL的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和H2O2，37 ℃孵育15 min。加入終止液后測定各水平的吸光度變化值(A450-A630)，經(jīng)直線回歸分析，選擇最佳線性范圍作為IgE定量檢測的反應曲線。

1.2.7方法實用性研究 將IgE標準品從0.1～2.0 ng/mL用標準血清進行一系列稀釋，采用本實驗建立的改良ELISA和傳統(tǒng)ELISA分別檢測IgE水平，計算回收率。比較兩種方法檢測IgE時回收率的差異?；厥章?%)=檢測值/實際值×100%。

2 結(jié) 果

2.1AuNPs 和AuNPs@DNA-B表征 采用紫外-可見分光光度計對制備的AuNPs、AuNPs@DNA-B進行掃描，在波長200～650 nm，扣除本底后得到如圖1A所示的光譜圖。由圖1A可見AuNPs和AuNPs@DNA-B掃描曲線波峰寬度較小，波形平滑，初步證明制備的AuNPs顆粒大小一致，分布均勻。AuNPs在標記DNA-B前，紫外吸收光譜的最大吸收峰波長在519 nm處，但標記后其最大吸收峰波長變?yōu)?22 nm，出現(xiàn)了輕微的紅移，且在260 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰。透射電鏡發(fā)現(xiàn)AuNPs的粒徑為(13±2)nm，多為球形，大小基本一致，分散均勻(圖1B)。

注：A為AuNPs及AuNPs@DNA-B紫外吸收光譜；B為AuNPs透射電鏡結(jié)果。

2.2DNA-B結(jié)合AuNPs條件的優(yōu)化

2.2.1DNA-B用量的優(yōu)化 當AuNPs的用量一定時，扣除背景信號后，由圖2可知，隨著DNA-B用量的增加，A260逐漸增加，尤其DNA-B用量在2.4～2.8 μL時A260急劇增加，而用量在>2.8～3.4 μL時A260增速明顯變緩，說明隨著DNA-B用量的增加，其與AuNPs的結(jié)合量亦隨之增加，直到達到其最大結(jié)合量。鑒于DNA-B在3.0～3.4 μL時A260接近最大值，且差別不大，因此本研究選用3.0 μL 100 μmol/L DNA-B 結(jié)合200 μL AuNPs作為二者后續(xù)實驗的用量。

圖2 結(jié)合AuNPs的DNA-B用量優(yōu)化

2.2.2DNA-B與AuNPs結(jié)合時間的優(yōu)化 在AuNPs和DNA-B最佳結(jié)合條件下，去除背景信號后，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，A260先迅速增加后增速變緩，說明DNA-B與AuNPs的結(jié)合達到一定時間后再增加結(jié)合時間并不能增加結(jié)合效率。由圖3可知，32～40 h時A260增速緩慢，說明此時間段基本達到二者的最大結(jié)合量，因此選用36 h作為最佳結(jié)合時間。

圖3 AuNPs與DNA-B結(jié)合時間優(yōu)化

2.3改良ELISA最佳反應條件的選擇

2.3.1SA和AuNPs@DNA-B用量優(yōu)化 當IgE用量固定時，發(fā)現(xiàn)隨著SA水平和AuNPs@DNA-B用量的增加，A450逐漸增加，但當SA水平為5 μg/mL、AuNPs@DNA-B用量為100 μL時，A450接近最大值，見圖4。綜合實驗結(jié)果，SA選擇5 μg/mL作為最佳工作水平，AuNPs@DNA-B用量選擇100 μL。

圖4 SA和AuNPs@DNA-B用量優(yōu)化

2.3.2SA-HRP用量優(yōu)化 在最優(yōu)條件下，SA-HRP稀釋度為1∶500～1∶3 000時A450下降緩慢，但超過1∶3 000則出現(xiàn)了明顯下降，說明稀釋度過高導致SA-HRP的用量不足，因此本研究選用1∶2 000作為SA-HRP的最終稀釋度。

2.4精密度驗證 取健康人血清及IgE陽性患者血清各10份在相同條件下重復檢測10次，批間變異系數(shù)均<6.1%，取其中1份IgE陽性血清重復測定10次，批內(nèi)變異系數(shù)<2.0%。

2.5標準曲線的繪制 將IgE標準品進行一系列稀釋后，用改良ELISA檢測各水平的A值，經(jīng)直線回歸分析(圖5)，得回歸方程：Y=0.139 84X+0.530 22，R2=0.983 32，發(fā)現(xiàn)IgE水平在0～30 ng/mL內(nèi)線性關系良好，其檢測限為0.012 ng/mL。

圖5 改良ELISA檢測IgE標準曲線

2.6方法實用性研究 取IgE標準品用標準血清稀釋后，采用改良ELISA和傳統(tǒng)ELISA分別檢測不同水平IgE標準品，計算回收率，發(fā)現(xiàn)改良ELISA回收率為(99.956±0.168)%～(104.733±3.376)%，傳統(tǒng)ELISA為(99.100±0.529)～(100.044±0.276)%，略低于改良ELISA，但二者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 改良和傳統(tǒng)ELISA測定IgE的回收率

3 討 論

隨著納米技術的發(fā)展，納米材料在生物醫(yī)學領域的應用備受關注[11]。納米顆粒因具有較大的比表面積、量子尺寸效應以及與生物材料的高度相容性逐漸成為生物醫(yī)學領域的研究熱點[12-13]。AuNPs(1～100 nm)是微小的金顆粒，又稱膠體金[14-15]。其具有高電子密度、介電特性和一定的催化作用，低毒且能與多種生物大分子結(jié)合，在醫(yī)學治療和檢測領域應用廣泛[16-17]。本研究將生物素化的DNA探針通過金-硫鍵結(jié)合于制備好的(13±2)nm的AuNPs上用于解決傳統(tǒng)ELISA放大效果不佳的問題，構(gòu)建了基于AuNPs的IgE檢測改良ELISA。即在ELISA檢測IgE的基礎上將生物素化抗體與鏈霉親和素結(jié)合，洗滌后鏈霉親和素后再與AuNPs@DNA-B探針結(jié)合。由于每個AuNPs@DNA-B可與多個SA-HRP分子結(jié)合，加入TMB后使檢測信號進一步放大。DNA探針長度的選擇參考文獻[18-19]，20 nm以下的AuNPs負載DNA探針的長度多在15～70 nt，由于本研究所用的AuNPs粒徑較小，DNA探針的長度選擇了20 nt(另含6個CH2基團)。

紫外-可見分光光度計對制備的AuNPs進行掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收峰波長在519 nm處，峰寬度較小，波形平滑，說明制備的AuNPs大小一致，分散性好；透射電鏡發(fā)現(xiàn)AuNPs粒徑為(13±2)nm，呈球形。標記DNA-B后最大吸收峰波長出現(xiàn)了約3 nm的紅移，且在260 nm處出現(xiàn)了吸收峰，說明DNA-B成功連接在了AuNPs上。未標記核酸的AuNPs與標記核酸的AuNPs光譜曲線形態(tài)基本一致，峰形變化不大，表明DNA-B標記后的AuNPs仍保持良好的穩(wěn)定性。對DNA-B的用量及與AuNPs的結(jié)合時間優(yōu)化發(fā)現(xiàn)：200 μL的AuNPs結(jié)合3.0～3.4 μL 100 μmol/L的 DNA-B時A260接近最大值，因此本研究選用3.0 μL 100 μmol/L DNA-B 作為200 μL AuNPs的最佳結(jié)合量；二者結(jié)合時間在32～40 h時A260接近峰值，本實驗選擇36 h作為二者的結(jié)合時間。通過對改良ELISA的最佳反應條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當SA水平達5 μg/mL、AuNPs@DNA-B用量達100 μL以上時，A450接近最大值，因此選擇5 μg/mL的SA作為最佳工作水平，AuNPs@DNA-B用量選擇100 μL；同時在SA和AuNPs@DNA-B最佳用量條件下對SA-HRP用量進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)SA-HRP稀釋度超過1∶3 000時A450迅速下降，說明稀釋度過高導致SA-HRP的結(jié)合容量不足，因此本研究選用1∶2 000作為SA-HRP的最終稀釋度。將IgE標準品進行一系列稀釋，用本實驗構(gòu)建的改良ELISA檢測各水平的A450，發(fā)現(xiàn)IgE水平在0～30 ng/mL時，A450與IgE呈現(xiàn)良好的線性關系，回歸方程：Y=0.139 84X+0.530 22，R2=0.983 32，其檢測限為0.012 ng/mL，較傳統(tǒng)ELISA的檢測限(0.24 ng/mL)高約19倍。該平臺檢測的批內(nèi)變異系數(shù)<2.0%，批間變異系數(shù)<6.1%，通過比較兩種方法對不同水平IgE標準品的回收率，發(fā)現(xiàn)改良ELISA回收率稍高于傳統(tǒng)ELISA，但二者差別不大。另外，本方法與其他常用方法相比，其靈敏度遠高于傳統(tǒng)的免疫印跡法，與化學發(fā)光法相近，但低于放射免疫法和熒光免疫法[20]。而放射免疫法除易造成放射性污染外，其與熒光免疫法均需要昂貴的儀器和試劑，難以在基層開展。

綜上所述，筆者通過AuNPs@DNA-B探針借助生物素-親和素間的高親和作用，構(gòu)建了改良的ELISA檢測平臺，大大提高了檢測靈敏度，有較好的應用前景，為抗原/抗體的高靈敏檢測提供了參考。