胡國君，張尊平，范旭東，任 芳，翟秀麗，時(shí)曉燕，董雅鳳

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，國家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城125100）（2 赤峰市森林草原保護(hù)發(fā)展中心）

我國蘋果的栽植面積和產(chǎn)量穩(wěn)居世界前列，然而，研究表明，我國蘋果普遍感染病毒[1]，而且隨著接穗和苗木流通的日益頻繁，蘋果病毒病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)。蘋果褪綠葉斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）、蘋果莖溝病毒（apple stem grooving virus，ASGV）和蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus，ASPV）是常見的蘋果病毒[2]，且均為潛隱性病毒，一般在寄主上不表現(xiàn)癥狀，只有在感病寄主或是指示植物上才產(chǎn)生癥狀[3-4]。3 種病毒通?；旌细腥荆梢饦潴w生長(zhǎng)量減少，產(chǎn)量降低，果實(shí)品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)病樹生長(zhǎng)急劇衰退，以致枯死，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失[5]。

上述3 種蘋果病毒主要通過嫁接傳染，隨接穗、苗木等遠(yuǎn)距離擴(kuò)散，目前還未發(fā)現(xiàn)傳毒介體。果樹病毒病不能通過藥劑進(jìn)行防治，培育和栽培無病毒苗木是防控蘋果病毒的根本途徑[6]。目前，莖尖培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)處理和超低溫處理等均可用于蘋果病毒的脫除，而且具有良好的脫除效果[7-8]。自然條件下，不同蘋果樣品中所攜帶的病毒種類和數(shù)量是不同的，其與脫毒效果的關(guān)系目前還不是很清楚。為了明確病毒數(shù)量對(duì)脫毒效果的影響，本研究以感染不同數(shù)量和種類病毒的蘋果試管苗為研究材料，比較熱處理和熱處理結(jié)合化學(xué)處理2 種脫毒方法對(duì)蘋果病毒的脫除效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)室保存的富嘎、維納斯黃金和新2001 富士3 個(gè)蘋果品種的試管苗。

1.2 試劑及儀器耗材

rTapDNA 聚合酶、10 mmol/L dNTPs，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 購自普洛麥格公司（Promega）；DNA Mark II 購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 熱處理脫毒

對(duì)保存的試管苗進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)30～35 d 后繼代，每次繼代切取1 cm 左右的莖尖轉(zhuǎn)到新鮮的MS基本培養(yǎng)基中，期間對(duì)樣品的帶毒情況進(jìn)行復(fù)檢，確保帶毒。

試管苗擴(kuò)繁到所需數(shù)量后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯植株，切取0.7 cm 莖尖移入新鮮的MS 培養(yǎng)基中，每瓶2～3 株，24 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室內(nèi)光培養(yǎng)∶暗培養(yǎng)＝16 h ∶8 h，光照強(qiáng)度為40 μmol·s-1·m-2。1 周左右移入光照培養(yǎng)箱中，箱內(nèi)溫度為24 ℃，每天升溫2～3 ℃，最終升溫至36 ℃，處理20 d。富嘎12 株為1 次重復(fù)，維納斯黃金6 株為1 次重復(fù)，新2001 富士10 株為1 次重復(fù)，均3 次重復(fù)，以未進(jìn)行熱處理的為對(duì)照。

期間，觀察記錄植株的株高和增殖情況，處理20 d 時(shí)切取1.0 mm 的莖尖（包括主芽和新生的側(cè)芽）移入新鮮的MS 培養(yǎng)基中，50～60 d 后進(jìn)行第1 次繼代，記錄再生植株的成活率，當(dāng)植株繼代2次后進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.4 熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫毒

含抗病毒劑培養(yǎng)基的配制：先將抗病毒劑病毒醚配制成一定濃度的母液，過濾除菌后加入高溫滅菌的MS 培養(yǎng)基中，使病毒醚的終濃度為25 μg/mL，混勻后置于室溫備用。

脫毒處理：切取0.7 cm 莖尖移入含病毒醚的培養(yǎng)基中，每瓶2～3 株。其余處理方式同1.3。

1.5 病毒檢測(cè)

總RNA 的提?。簠⒄辗缎駯|等[9]的方法。

反轉(zhuǎn)錄：取總RNA 3 μL、隨機(jī)引物1 μL、DEPC處理去離子水6 μL 放入1 個(gè)離心管中，72 ℃10 min，冰上3 min。加入5×RT buffer 2 μL、dNTPs（2.5 mmol/L each）1 μL、M-MLV（200 U/μL）0.5 μL混合液，用水補(bǔ)足至20 μL?；靹蚝?2 ℃10 min，37 ℃1 h，72 ℃5 min，冰浴3 min，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR：參照胡國君等[10]的方法。檢測(cè)引物參照表1。

表1 3 種蘋果病毒檢測(cè)用引物

1.6 數(shù)據(jù)分析

各品種2種脫毒處理的再生植株平均成活率（%）＝［（熱處理的成活莖尖＋熱處理結(jié)合化學(xué)處理的成活莖尖）/（熱處理后切取的莖尖＋熱處理結(jié)合化學(xué)處理后切取的莖尖）］×100

熱處理脫毒的再生植株成活率（%）＝（成活的莖尖/切取的莖尖）×100

熱處理結(jié)合化學(xué)處理的再生植株成活率（%）＝（成活的莖尖/切取的莖尖）×100

3 個(gè)品種中ACLSV（或ASGV、ASPV）的平均脫除率（%）＝［3 個(gè)品種的2 個(gè)脫毒處理組中所有不含ACLSV（或ASGV、ASPV）的再生植株總和/3 個(gè)品種的2 個(gè)脫毒處理組中所有檢測(cè)的再生植株總和］×100

各品種中某種病毒的平均脫除率（%）＝（2 個(gè)脫毒處理組中所有不含該病毒的再生植株總和/2 個(gè)脫毒處理組中所有檢測(cè)的再生植株總和）×100

各品種的某個(gè)脫毒處理中某種病毒的平均脫除率（%）＝（該脫毒處理組中所有不含該病毒的再生植株總和/該脫毒處理組中所有檢測(cè)的再生植株總和）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 3 個(gè)蘋果品種試管苗的帶毒情況

采用RT-PCR 技術(shù)對(duì)3 個(gè)蘋果品種的試管苗進(jìn)行病毒檢測(cè)。從表2 可以看出，富嘎攜帶ACLSV、ASGV、ASPV 3 種病毒，維納斯黃金攜帶ASGV、ASPV 2 種病毒，新2001 富士?jī)H攜帶ASGV 1 種病毒。繼代培養(yǎng)后，每個(gè)品種隨機(jī)抽取10 株試管苗進(jìn)行病毒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)品種攜帶的病毒種類不變。

表2 3 個(gè)蘋果品種試管苗對(duì)3 種蘋果病毒的攜帶情況

2.2 脫毒處理對(duì)3 個(gè)蘋果品種試管苗的影響

2.2.1 生長(zhǎng)狀況

與對(duì)照相比，處理10 d 時(shí)，富嘎脫毒處理的試管苗受高溫影響均表現(xiàn)整體變黃的現(xiàn)象；處理結(jié)束時(shí)（20 d），植株整體較黃，長(zhǎng)勢(shì)較弱，部分葉片變褐色。維納斯黃金的試管苗耐熱性相對(duì)較好，處理10 d 時(shí)與對(duì)照的差別不大；處理結(jié)束時(shí)（20 d），整體較黃，部分葉片變褐色。新2001 富士熱處理脫毒的植株長(zhǎng)勢(shì)弱，處理結(jié)束時(shí)，底部葉片出現(xiàn)黑褐色；而熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫毒的植株長(zhǎng)勢(shì)較好，處理結(jié)束時(shí)，只有部分葉片變褐色。處理結(jié)束后，3個(gè)品種的脫毒試管苗均未有死亡的（圖版1、表3）。

表3 3 個(gè)蘋果品種試管苗脫毒處理過程中植株的生長(zhǎng)狀況

2.2.2 株高和增殖

從圖1 可以看出，處理結(jié)束后，植株株高和增殖品種間差異較大。富嘎熱處理脫毒植株的株高和增殖與對(duì)照無顯著差異，但熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫毒植株的株高顯著高于對(duì)照，而增殖數(shù)顯著低于對(duì)照組植株。維納斯黃金2 組脫毒處理植株的株高和增殖與對(duì)照沒有顯著差異。新2001 富士2 組脫毒處理植株的株高和增殖數(shù)均顯著低于對(duì)照組植株。

圖1 3 個(gè)蘋果品種試管苗脫毒處理20 d 時(shí)的株高和增殖情況

2.3 脫毒處理對(duì)3 個(gè)蘋果品種試管苗再生植株成活率和病毒脫除率的影響

從表4 可以看出，第1 次繼代結(jié)束后，維納斯黃金2 種脫毒處理再生植株的平均成活率最高，為83.2%；富嘎和新2001 富士2 種脫毒處理再生植株的平均成活率差別不大，分別為64.0%和59.2%。富嘎和維納斯黃金熱處理脫毒的再生植株成活率均略高于熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫毒的，分別高5.4、2.8 個(gè)百分點(diǎn)，而新2001 富士熱處理脫毒的再生植株的成活率低于熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫毒的，低18.4 個(gè)百分點(diǎn)。

表4 3 個(gè)蘋果品種脫毒試管苗再生植株的成活率和病毒脫除率

繼代2 次后，3 個(gè)蘋果品種試管苗熱處理脫毒的再生植株脫毒率均較低，富嘎和新2001 富士均未獲得無毒植株，而維納斯黃金不足20%。3 個(gè)蘋果品種試管苗熱處理結(jié)合化學(xué)處理脫毒的再生植株均獲得了無毒種苗，富嘎和維納斯黃金的脫毒率較高，分別為94.7%和88.9%；新2001 富士較低，為46.2%（表4）。

2.4 不同病毒的脫除效率

分析發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)蘋果品種中，ACLSV、ASGV和ASPV 的平均脫除率分別為56.1%、41.0%和63.9%。富嘎和維納斯黃金中ASPV 的平均脫除率分別為65.9%和60.0%，富嘎、維納斯黃金、新2001富士中ASGV 的平均脫除率分別為43.9%、50.0%、27.3%。

3 討論與結(jié)論

本研究采用熱處理、熱處理結(jié)合化學(xué)處理對(duì)3個(gè)攜帶不同種類病毒的蘋果品種試管苗進(jìn)行脫毒，結(jié)果顯示，脫除效率與病毒種類數(shù)量不存在明顯的相關(guān)性，但與病毒種類關(guān)系密切，3 種病毒中ASGV最難于脫除，直接影響品種的脫毒率。如富嘎熱處理脫毒的再生植株中ACLSV、ASGV 和ASPV 的脫除率分別為18.2%、0、36.4%，所有再生植株中均攜帶ASGV，因此該品種熱處理脫毒后未獲得無毒植株。其次，脫除效率與蘋果品種有關(guān)，即不同品種間同一病毒的脫除率存在差異，富嘎和維納斯黃金熱處理脫毒的再生植株中ASPV 的脫除率分別為36.4%、27.3%。

蘋果主要通過嫁接進(jìn)行繁育，砧木或接穗一方帶毒，植株將終身攜帶。病毒主要依賴寄主完成繁衍，因此，一般的化學(xué)農(nóng)藥很難對(duì)其造成威脅。目前，脫毒處理是獲得無病毒苗木最有效的方法。其中，熱處理是傳統(tǒng)的植物病毒脫除方法，其優(yōu)點(diǎn)是所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，目前通過高溫處理已經(jīng)獲得多種果樹的無病毒植株[14-18]。然而，該方法存在一定的局限，即高溫條件下植物的死亡率較高，尤其是對(duì)一些不耐高溫的植物?；瘜W(xué)處理在植物病毒的脫除研究中也被廣泛應(yīng)用，所用的抗病毒劑大多為一些核酸類似物。病毒醚為常用的病毒抑制劑，在果樹病毒的脫除中被廣泛引用[7,19-22]。但在使用過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病毒醚的濃度≥50 μg/mL 時(shí)，植株產(chǎn)生藥害，葉片上出現(xiàn)褪綠和壞死斑，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致植株死亡[22]。

除上述2 種方法外，現(xiàn)有的脫毒方法均存在一定的局限，單獨(dú)選擇某一種方法進(jìn)行脫毒處理很難獲得滿意的脫除效果，因此，通常選擇2 種或者2種以上的方法同時(shí)脫毒，本研究選用的熱處理結(jié)合化學(xué)處理的脫除效果明顯優(yōu)于單獨(dú)熱處理的脫除效果。此外，熱處理結(jié)合超低溫處理、化學(xué)處理結(jié)合低溫處理、熱處理結(jié)合低溫處理等方法也在蘋果病毒的脫除中得到應(yīng)用[23-26]。

綜上，果樹脫毒的脫除效率與待脫毒的品種類型及病毒的種類有關(guān)，在脫毒處理前要綜合考慮不同脫毒方法的利弊，選擇適宜的方法，為了獲得較好的脫除效果，可同時(shí)選擇2 種或2 種以上的脫除方法。