張琳琳，劉振麗，王 淳，彭詩濤，寧張弛△，宋志前△

(1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310052；2.國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310052；3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

乳香為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw，樹皮滲出的樹脂具有活血定痛、消腫生肌的功效，主治胸痹心痛、產(chǎn)后瘀阻、跌打損傷和風(fēng)濕痹痛等血瘀證[1]。乳香始載于《名醫(yī)別錄》，后《本草綱目》《證類本草》均有記載并沿用至今[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，乳香具有抗腫瘤、抗炎、止痛、調(diào)節(jié)免疫等作用[3-7]。中醫(yī)認(rèn)為炮制輔料醋入肝經(jīng)，具有活血行氣、散瘀解毒、開胃養(yǎng)肝等功效[8]。乳香醋炙后能增強(qiáng)活血化瘀、消腫止痛功效，并能降低其刺激性，因此中醫(yī)臨床常用乳香的炮制品醋乳香飲片入藥[9]。

由瘀血內(nèi)阻而引起的病證，中醫(yī)稱為血瘀證[10]，可涉及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腫瘤、冠心病、腦梗死、免疫性疾病等多種疾病。已有研究證明，乳香具有較好的活血化瘀作用，但其醋炙前后對(duì)血瘀證模型動(dòng)物的作用差異研究較少。

本研究擬從體內(nèi)體外兩方面評(píng)價(jià)乳香醋炙前后對(duì)大鼠血瘀模型的改善作用。體外實(shí)驗(yàn)采用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)為誘導(dǎo)劑，比較乳香和醋乳香對(duì)大鼠體外全血血小板聚集的影響。體內(nèi)活血作用擬采用大鼠寒凝血瘀模型，以血液流變指標(biāo)和凝血因子指標(biāo)比較乳香和醋乳香的體內(nèi)活血作用。通過探討乳香醋炙前后體內(nèi)外活血作用的藥效學(xué)差異，以期闡明乳香醋炙的科學(xué)性和合理性。本研究通過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2020-066)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

采用清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(280±10)g，購于中國食品藥品檢定研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(京)2017-0005。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度50%～70%，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

乳香購于北京同仁堂藥店(批號(hào)805270216)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.樹皮滲出的樹脂；阿司匹林腸溶片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)BJ16287；鹽酸腎上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)1312151。

1.3 主要試劑及儀器

ADP(批號(hào)212010319)，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；異氟烷(批號(hào)19021501)，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)測(cè)定試劑盒(批號(hào)STY20301-49)、凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)測(cè)定試劑盒(批號(hào)STY20101-75B)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)測(cè)定試劑盒(批號(hào)STY20401-57)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)試劑盒(批號(hào)STY20201-46)，北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司；肝素真空采血管(批號(hào)20190801)、枸櫞酸鈉真空采血管(批號(hào)20190701)，江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司。

LD5-10低速臺(tái)式離心機(jī)(北京瑞邦興業(yè)科技有限公司)；590 Whole-Blood aggregometer全血血小板聚集儀(Chrono-LOG公司)；LG-Paber-Ⅱ全自動(dòng)凝血因子分析儀(北京世帝科學(xué)儀器)；BT-300全自動(dòng)血液流變儀(北京博萊特通科技有限公司)。

2 方法

2.1 乳香、醋乳香混懸液的配制

根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[11]和2020版《中華人民共和國藥典》[1]制備醋乳香。稱取乳香適量置炒鍋中，采用中火炒制9 min后表面微溶，按照10∶1比例噴淋米醋，繼續(xù)翻炒，約11 min后觀察到表面呈油亮光澤時(shí)迅速取出，將炒制好的醋乳香轉(zhuǎn)移至托盤中，攤放晾涼備用。

取等量的乳香和醋乳香，相同條件下粉碎，過100目篩。按照70 kg人體用藥劑量，用0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)溶液制成濃度為86.4 g/L的乳香和醋乳香混懸液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用時(shí)室溫放置60 min，振搖使其混勻。

2.2 體外全血血小板聚集試驗(yàn)

2.2.1 ADP溶液的配制 取ADP適量精密稱定，加0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含0.4 mg ADP的溶液。

2.2.2 大鼠麻醉和取血 取6只正常大鼠以異氟烷呼吸麻醉，待大鼠麻醉成功后腹主動(dòng)脈取血，置于肝素鈉抗凝管中待測(cè)。

2.2.3 供試品溶液制備 取乳香和醋乳香粉末3 g，加25倍95%乙醇超聲30 min提取2次，過濾并合并濾液，減壓干燥，殘?jiān)?0 mL 2%氫氧化鉀溶解即得。取阿司匹林片粉碎，稱取10 mg于10 mL 2%氫氧化鉀溶解即得。

2.2.4 全血血小板聚集測(cè)定 測(cè)定全血血小板聚合值常用的方法有比濁法和電阻法[12]。本實(shí)驗(yàn)采用電阻法，以2%氫氧化鉀為空白對(duì)照組、阿司匹林為陽性對(duì)照組，通過比較乳香、醋乳香提取物對(duì)ADP誘導(dǎo)正常大鼠全血血小板聚集的聚合值以及電阻變化斜率，考察乳香醋炙前后對(duì)體外全血血小板聚集的影響。具體方法為：5個(gè)反應(yīng)杯中均放入磁棒，置于預(yù)溫孔(37 ℃)預(yù)溫10 min，依次加入0.9%氯化鈉溶液500 μL、肝素鈉抗凝全血500 μL后，陽性對(duì)照組及乳香、醋乳香組分別加入阿司匹林、乳香和醋乳香供試品溶液10 μL，空白對(duì)照組加入2%氫氧化鉀10 μL。將反應(yīng)杯放入反應(yīng)孔中，反應(yīng)5 min插入檢測(cè)電極，待基線平穩(wěn)2 min后，加入10 μL ADP溶液于反應(yīng)體系中，記錄電阻的變化曲線，測(cè)定并比較各組血小板聚合值及電阻變化曲線斜率。

2.3 體內(nèi)活血實(shí)驗(yàn)

2.3.1 寒凝血瘀證大鼠模型 采用注射腎上腺素和冰水浴刺激的方法建立寒凝血瘀證動(dòng)物模型[13]。大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素(0.8 mg/kg)，2 h后置于4 ℃冰水中游泳3.5 min，用毛巾擦拭，吹風(fēng)機(jī)吹干，等待2 h后再皮下注射等劑量的鹽酸腎上腺素，末次給藥后禁食12 h后采血。

2.3.2 動(dòng)物分組及給藥方法 將模型動(dòng)物分為模型組、乳香組(0.90 g/kg)、醋乳香組(0.90 g/kg)、陽性藥組(54 mg/kg)4組各6只。正常組與模型組灌胃給予0.5% CMC-Na溶液，給藥組按上述劑量分別灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥2周。

2.3.3 血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后禁食12 h。各組大鼠吸入異氟烷麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后置于肝素鈉采血管，用于全血黏度、血沉及紅細(xì)胞壓積的檢測(cè)。另取抗凝血液1 mL，離心后取血漿測(cè)定血漿黏度。

2.3.4 凝血因子指標(biāo)檢測(cè) 腹主動(dòng)脈取血，置于3.2 %枸櫞酸鈉抗凝管(1∶9)中，離心后取血漿，檢測(cè)PT、APTT、TT、FIB、血沉及紅細(xì)胞壓積水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 乳香醋炙前后對(duì)ADP誘導(dǎo)全血血小板聚集作用

采用ADP誘導(dǎo)大鼠全血血小板聚集試驗(yàn)，比較醋乳香和乳香體外活血活性(見圖1)。與對(duì)照組比較，阿司匹林組、醋乳香組和乳香組的血小板聚合值和斜率均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，且醋乳香組血小板聚合值和斜率低于乳香組。結(jié)果表明，醋乳香較乳香能夠更好地抑制ADP誘導(dǎo)的全血血小板聚合值及斜率。

注：A.血小板聚合值；B.斜率；與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01圖1 乳香醋炙前后對(duì)ADP誘導(dǎo)的全血血小板聚集試驗(yàn)結(jié)果

3.2 乳香醋炙前后對(duì)寒凝血瘀模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的作用

以寒凝血瘀模型對(duì)比醋乳香和乳香對(duì)體內(nèi)血液流變學(xué)的影響(結(jié)果見表1)。與正常組比較，模型組5個(gè)切變率下的全血黏度、血漿黏度、血沉以及紅細(xì)胞壓積均顯著提升(P<0.05，P<0.01)，表明模型制備成功。與模型組比較，醋乳香組和陽性藥組切變率1(1/s)的全血黏度、血漿黏度及紅細(xì)胞壓積均顯著下降(P<0.05或P<0.01)，而乳香組僅有紅細(xì)胞壓積明顯下降(P<0.05)。結(jié)果表明，在改善寒凝血瘀模型大鼠血液流變學(xué)方面，醋乳香的作用優(yōu)于乳香。

表1 乳香和醋乳香對(duì)大鼠血液流變學(xué)的影響

3.3 乳香醋炙前后對(duì)寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的作用

比較醋乳香和乳香對(duì)寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的影響(見表2)。與正常組比較，模型組TT和PT值顯著降低，F(xiàn)IB值顯著升高(P<0.05，P<0.01)，表明寒凝血瘀模型造模成功。與模型組比較，陽性藥組以及醋乳香組的TT和PT值顯著升高，F(xiàn)IB值顯著降低(P<0.01)；乳香組僅TT值明顯上升(P<0.01)。結(jié)果表明，醋乳香比乳香抑制寒凝血瘀模型大鼠凝血功能效果更好。

表2 乳香醋炙前后對(duì)寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的影響

4 討論

《素問·調(diào)經(jīng)論篇》：“血?dú)庹?，喜溫而惡寒，寒則泣不能流，溫則消而去之?！薄鹅`樞》：“寒邪客于經(jīng)絡(luò)之中，則血泣，血泣則不通?！敝嗅t(yī)認(rèn)為“寒氣入經(jīng)而稽遲，泣而不行”，即寒邪使血脈運(yùn)行不暢而致寒凝血瘀，以及形成“惡血”與“留血”等[10]。血液流變學(xué)主要是通過檢測(cè)血液黏度和凝集、紅細(xì)胞的聚集以及全血血小板的聚集等指標(biāo)來研究血液的流動(dòng)性及變形性規(guī)律[14]。血液流變學(xué)異常主要表現(xiàn)為血流速減慢、黏度增高，呈“黏、濃、凝、稠、聚”狀態(tài)。凝血因子是評(píng)價(jià)機(jī)體血液凝血功能的重要指標(biāo)，PT反映血漿中凝血因子X、Ⅶ、Ⅱ、V和I水平，APTT反映血漿中凝血因子Ⅺ、Ⅸ和Ⅷ水平，TT反映血液中凝血因子的抗凝劑是否增加。FIB是一種具有凝血功能的蛋白質(zhì)，可促使紅細(xì)胞聚集[15，16]。血瘀證的表現(xiàn)與血液流變學(xué)及凝血功能異常頗為一致，故臨床常將血液流變學(xué)和凝血因子作為評(píng)價(jià)血瘀證的重要指標(biāo)。本研究采用冰浴應(yīng)激加腎上腺素方法，模擬寒凝血瘀證的病理過程制備動(dòng)物模型?；谀蜃雍脱毫髯儗W(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)乳香醋炙前后對(duì)寒凝血瘀證大鼠干預(yù)作用的差異，結(jié)果表明醋乳香改善寒凝血瘀大鼠血液流變學(xué)和抗凝血的作用更強(qiáng)。此外，ADP是一種血小板釋放的自體凝血物質(zhì)，其通過血小板膜的ADP受體誘導(dǎo)血小板聚集。研究借助ADP誘導(dǎo)血小板聚集的體外實(shí)驗(yàn)，比較乳香醋炙前后的解聚作用，結(jié)果表明醋乳香對(duì)ADP誘導(dǎo)的全血血小板聚集的抑制作用更強(qiáng)，可見乳香醋炙對(duì)活血活性的增效作用可能與血液中血小板的ADP受體有關(guān)。

血瘀證作為臨床重要證型之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為與血液流變學(xué)異常、微循環(huán)障礙、免疫性炎癥反應(yīng)以及結(jié)締組織代謝異常等病理變化有關(guān)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞變化是病變的中心環(huán)節(jié)[17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，乳香可以降低炎性因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的分泌，從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[18]。乳香提取物對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎作用是基于其系統(tǒng)調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)基因變化而發(fā)揮的，如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopeptidase，MMP)-3、MMP-10和MMP-12[19]。最新1項(xiàng)研究成果證實(shí)，乳香對(duì)于糖尿病微血管病變、糖尿病足也有一定的改善作用，其可以通過抑制氧化炎癥標(biāo)志物表達(dá)，促進(jìn)膠原合成，加快愈合速度，顯著減少傷口細(xì)胞壞死程度[20]。

藥效作用的產(chǎn)生與物質(zhì)基礎(chǔ)密切相關(guān)。課題組前期對(duì)炮制輔料醋和乳香化學(xué)成分開展了相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn)，炮制輔料醋中具有活血止痛作用的川芎嗪、四氫哈爾滿堿、麥角胺等活性成分，這些成分是乳香醋炙后活血止痛作用增強(qiáng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[21]。乳香最主要的活性物質(zhì)是三萜類的乳香酸成分[22，23]，主要包括11-羰基-β-乳香酸(11-keto-β-boswellic acid，KBA)和3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA)、乙酰-β-乳香酸(acetyl-β-boswellic acid，β-ABA)、β-乳香酸(β-boswellic acid，β-BA)等[24，25]。乳香中的主要乳香酸成分AKBA可以通過介導(dǎo)核因子(nuclear factor，NF)-κB通路發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[26]，β-BA可以刺激內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的釋放，從而改善血瘀引發(fā)的內(nèi)皮功能紊亂[27]。乳香的水提取液通過抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen0activated protein kinase，MAPK)和熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)27通路，削弱血小板源生長因子對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移作用[28]。課題組前期研究結(jié)果顯示，乳香醋炙后AKBA與β-BA的含量大大提升，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)具有9,11-去氫結(jié)構(gòu)的乳香酸成分在醋炙后含量增加10.8倍。而體外初步的抗炎篩選結(jié)果也表明，該類成分的抗炎活性與AKBA和β-BA類似[29]，這可能也是乳香醋炙后改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化作用增強(qiáng)的原因。

分子生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)進(jìn)一步揭示乳香醋炙前后差異化學(xué)成分藥理作用和作用機(jī)制，結(jié)果顯示[29]炎癥反應(yīng)是血管的初級(jí)反應(yīng)，乳香醋炙前后可能通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGFA)、MMP-9、TNF、IL-1β、轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silenceing，PTGS)等炎癥相關(guān)靶點(diǎn)增效對(duì)血管炎癥的干預(yù)效果，其中VEGFA可促進(jìn)新生血管形成，增加血管通透性[30]，而MMP-9與創(chuàng)面愈合及血管新生過程高度相關(guān)[31]。TNF和IL-1β是血管病變出現(xiàn)引發(fā)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體活化等細(xì)胞焦亡過程中的作用靶點(diǎn)[32]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示[29]，乳香醋炙后作用增強(qiáng)的通路如晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體(advanced glycation end products and their receptors，AGE-RAGE)信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等均與血管病變的改善作用密切相關(guān)，而研究表明抑制和阻斷二者能夠增加VEGF、一氧化氮等因子分泌，從而促進(jìn)血管新生[30]。

中醫(yī)理論認(rèn)為，氣、血、津液的運(yùn)化失調(diào)是導(dǎo)致血管病變的本質(zhì)原因，其病理產(chǎn)物痰、瘀、濁、毒在血脈中的蓄積則是關(guān)鍵的致病因素[33，34]。乳香味辛性散，具有走竄的特性，其既行氣分又入血分，內(nèi)至臟腑宣通氣血，外至經(jīng)絡(luò)通達(dá)瘀滯[35]，而乳香醋炙后可以增強(qiáng)其活血化瘀的作用特點(diǎn)。故本實(shí)驗(yàn)開展乳香和醋乳香的藥效對(duì)比研究，為擴(kuò)展傳統(tǒng)中藥炮制的臨床應(yīng)用、推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程、揭示傳統(tǒng)中藥炮制理論的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。