邵曉潔，管文婕，洪占梅，陳 明，王 凡，呂東來，3，張旭東

(1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，安徽 合肥 230032；3. 陸軍軍醫(yī)大學西南癌癥中心，重慶 400038)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SPF級，♂，新生24 h SD大鼠，體質(zhì)量(6.02 ± 0.01)g，購買于上海斯萊克實驗動物有限公司，SCXK(滬)2018-0002，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學實驗動物學部，SYXK(皖)2020-0019。

1.1.2藥物與試劑 大豆異黃酮(華北制藥股份有限公司，批號：060104)；Aβ1-42[翌圣生物科技(上海)股份有限公司，貨號：20602ES03]；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號：C11330500BT)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(上?；鄯f生物科技有限公司，貨號：FB15015)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，濟南世紀通達化工有限公司，貨號：CAS67-68-5 ) MTT檢測試劑盒(上海生工生物工程有限公司，貨號：E606334)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：CA1020)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術，貨號：P0012S)；顯影定影試劑盒(上海碧云天生物技術，貨號：P0019)；山羊抗兔(上海碧云天生物技術，貨號：A0408)；山羊抗小鼠(上海碧云天生物技術，貨號：A0412)；一抗稀釋液(上海碧云天生物技術，貨號：P0256)；二抗稀釋液(上海碧云天生物技術，貨號：P0258)；環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)一抗(Cell Signaling Technology，貨號；4842)；TNF-ɑ一抗(Cell Signaling Technology，貨號；8643)；IκBα一抗(Santa Cruz Biotechnology，貨號：sc-52900)；p-IκBα一抗(Santa Cruz Biotechnology，貨號：sc-8404)；NF-κB p65一抗(Santa Cruz Biotechnology，貨號：sc-8008)；p-NF-κB p65一抗(Santa Cruz Biotechnology，貨號：sc-398442)；cleaved-caspase-3一抗(Cell Signaling Technology，貨號：9664)；Bcl-2一抗(Cell Signaling Technology，貨號：15071)；β-actin一抗(上海碧云天生物技術，貨號：AF5001)。

1.1.3主要儀器 TWK-FST32型組織勻漿儀(武漢泰普拓科技有限公司)；Micro17R型高速冷凍離心機(離心半徑：6 cm)、FC型全自動多功能酶標檢測儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；1658033型電泳儀、ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)與鑒定 新生24 h大鼠采用酒精消毒、斷頭處理，并在無菌條件下取出大腦并分離海馬組織；海馬組織剪碎并加入0.25%的胰蛋白酶消化30 min；加入DEME/F12培養(yǎng)基終止消化，將細胞懸液放置離心機內(nèi)，設置轉(zhuǎn)速度1 200 r·min-1離心5 min，靜置2 min后吸去上清液，加入新鮮的細胞培養(yǎng)基吹打并將其懸液過200目篩網(wǎng)進行過濾，調(diào)整好細胞濃度并接種至經(jīng)過L-多聚賴氨酸處理后6孔板內(nèi)，放置于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h；加入5 g·L-1阿糖胞苷抑制非神經(jīng)細胞活性。期間每3 d對原細胞培養(yǎng)基進行1/2體積更換。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)10 d，采用免疫熒光染色法鑒定神經(jīng)元，神經(jīng)元神經(jīng)絲蛋白(NF)2000抗體結(jié)合山羊抗兔免疫熒光二抗熒光染色鑒定。

1.2.2海馬神經(jīng)元分組與給藥處理 實驗分為對照組(Control)、Aβ1-42處理組、SI低、中、高給藥濃度組。其中Cotrol組與含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h；Aβ1-42處理組海馬神經(jīng)元加入30 μmol·L-1的Aβ1-42處理48 h；SI低、中、高劑量組(SI-L、SI-M、SI-H)海馬神經(jīng)元首先分別加入終濃度10、20和40 mg·L-1的SI預處理2 h，然后加入30 μmol·L-1的Aβ1-42處理48 h。

1.2.3MTT檢測海馬神經(jīng)元存活率 大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞按照96孔板密度為：1×107·L-1密度接種，按照實驗分組進行對應處理，培養(yǎng)48 h，每組設置6個復孔，重復實驗3次，每孔加入MTT溶液10 μL(5 g·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄去細胞上清，每孔加入150 μL的DMSO震蕩10 min，使得充分溶解，酶標儀設定波長為570 nm檢測各孔的吸光度值，以光密度(optical density，OD)值反映海馬神經(jīng)元活力。海馬神經(jīng)元存活率/%=各處理組細胞OD/對照組OD值×100%。

智慧商圈系統(tǒng)中商圈客流分析的核心是對商圈的靜態(tài)數(shù)據(jù)和動態(tài)數(shù)據(jù)進行分析,分析的維度決定分析的價值?？土鞣治霾粌H僅是獲取總客流量，還需根據(jù)各區(qū)域、各樓層的客流分布、變化情況和成交率[1]，通過正確的數(shù)據(jù)清洗和分析，利用專業(yè)的可視化分析工具得出對商圈有較高價值的數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.2.4TUNEL染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡率 海馬神經(jīng)元按照1×107·L-1密度接種于12孔板內(nèi)，按照TUNEL染色檢測試劑盒進行海馬神經(jīng)元凋亡檢測。于200倍光學顯微鏡下隨機性選取3個視野觀察各組海馬神經(jīng)元凋亡情況。TUNEL陽性細胞(凋亡細胞)染色呈棕色。海馬神經(jīng)元凋亡率/%=TUNEL陽性細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100%。

1.2.5Western blot檢測海馬神經(jīng)元相關蛋白表達 海馬神經(jīng)元加入細胞裂解液后于冰上裂解40 min；4 ℃，12 000 r·min-1，離心10 min，吸取細胞上清液；BCA法測定各組海馬神經(jīng)元蛋白質(zhì)濃度；上樣(按照每孔上樣量30 μg計算得出上樣體積)；凝膠電泳(80 V，30 min后120 V，60 min)；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜90 min；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別加COX-2一抗(1 ∶1 000)、TNF-ɑ一抗(1 ∶1 000)、IκBα一抗(1 ∶1 000)、p-IκBα一抗(1 ∶1 000)、NF-κB p65一抗(1 ∶1000)、p-NF-κB p65一抗(1 ∶1 000)及β-actin抗體(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜；加對應的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1～2 h；加吐溫20磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，每次5 min，加入顯影液，顯影并拍照。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定光學顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元生長情況。10 d可見海馬神經(jīng)元之間的突起形成網(wǎng)狀，胞體呈錐體狀和紡錘狀，伴有長軸突和樹突形成。熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元NF200染色呈紅色，細胞核染色呈藍色，大約90%以上呈NF200陽性，表明原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定獲得成功(Fig 1)。

Fig 1 Culture and identification of primary hippocampal neurons (200×)

2.2 各組海馬神經(jīng)元存活率情況MTT檢測顯示，與Control組相比，Model組海馬神經(jīng)元存活率明顯降低(P<0.01)。與Model組相比，SI-L、SI-M、SI-H組海馬神經(jīng)元存活率明顯升高(P<0.05或P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Comparison of survival rate of

2.3 SI對Aβ1-42誘導海馬神經(jīng)元炎癥因子表達的影響Western blot檢測海馬神經(jīng)元COX-2和TNF-ɑ蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與Control相比，Model組細胞TNF-ɑ和COX-2蛋白表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與Model組相比，SI-H組細胞TNF-ɑ和COX-2蛋白表達明顯降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 3)。

Fig 3 The expression levels of TNF-ɑ andCOX-2 in hippocampal neurons n=3)

2.4 SI對Aβ1-42誘導海馬神經(jīng)元凋亡的影響TUNEL染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組海馬神經(jīng)元凋亡率明顯增加(P<0.01)。與Model組相比，SI-M、SI-H組海馬神經(jīng)元凋亡率明顯降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 4)。進一步Western blot檢測海馬神經(jīng)元凋亡相關蛋白表達，結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組cleaved-caspase-3蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.01)。與Model組相比，SI-L、SI-M、SI-H組cleaved-caspase-3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05或P<0.01)(Fig 5)。

Fig 4 Comparison of apoptotic rate of hippocampal neurons

Fig 5 The expression levels of cleaved-caspase-3 and Bcl-2 in hippocampal neurons n=3)

2.5 SI對海馬神經(jīng)元NF-κB p65信號通路相關蛋白表達影響Western blot檢測海馬神經(jīng)元NF-κB p65信號通路相關蛋白表達。結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達均明顯升高(P<0.01)。與Model組相比，SI-L、SI-M、SI-H組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達均明顯降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 6)。

Fig 6 The expression of NF-κB p65 signaling pathway proteins in hippocampal neurons

3 討論

AD是老年人常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)記憶力損害。AD發(fā)病機制復雜，主要包括Aβ神經(jīng)病毒學說、膽堿能神經(jīng)功能抑制、Tau蛋白學說以及神經(jīng)炎癥機制等[11]。其中Aβ神經(jīng)病毒學說在AD的發(fā)生、發(fā)展中被廣泛研究，研究學者認為淀粉前體樣蛋白酶切代謝產(chǎn)物Aβ是AD發(fā)病早期發(fā)揮主要誘因[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ能夠誘導海馬神經(jīng)元炎癥和凋亡，導致神經(jīng)元細胞丟失[13]。神經(jīng)元細胞大量丟失是AD典型病理特征之一，海馬神經(jīng)元凋亡則是神經(jīng)元丟失的表現(xiàn)形式。因此，以Aβ誘導海馬神經(jīng)元凋亡為基礎，探究AD發(fā)生、發(fā)展中的分子調(diào)節(jié)機制尤為重要。既往研究證實，NF-κB/p65信號傳導在神經(jīng)元炎癥反應和凋亡中發(fā)揮重要作用[5]。NF-κB共有5種蛋白組成，靜息狀態(tài)下在細胞質(zhì)內(nèi)NF-κB與IκBα結(jié)合形成復合物。當IκBα被激活形成p-IκBα后，IκBα會發(fā)生泛素化并降解，從而釋放結(jié)合NF-κB p65。而釋放的NF-κB p65會被進一步磷酸化形成p-NF-κB p65，增強其和定位信號，進入細胞核促進下游基因表達[14]。研究顯示Aβ25-35能夠通過激活IκBα/NF-κB通路，誘導海馬神經(jīng)炎癥，增加神經(jīng)元凋亡，進而導致海馬神經(jīng)元存活率降低[15]。另外，抑制NF-κB活化能夠明顯降低Aβ誘導的海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)元細胞丟失[16]。因此，抑制NF-κB p65信號激活已逐漸成為阻止Aβ誘導海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡的目標。SI是一類與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關的異黃酮類化合物總稱。研究發(fā)現(xiàn)SI能夠增加去卵巢大鼠海馬突觸密度，改善海馬功能[17]。另外，研究也證實SI能夠通過調(diào)控AD大鼠海馬組織caspase-3活性，改善AD大鼠學習記憶能力[18]。在腦缺血/再灌注損傷大鼠模型，SI能夠通過抑制NF-κB活化降低海馬神經(jīng)炎癥反應，減少海馬神經(jīng)元凋亡[10]。基于以上研究，我們推測SI可能通過調(diào)控NF-κB p65信號通路影響AD海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡。為此，本實驗通過體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元，觀察SI對Aβ誘導海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡的影響。

本實驗首先通過體外原代海馬神經(jīng)元分離培養(yǎng)與鑒定，結(jié)果顯示10 d可見海馬神經(jīng)元之間的突起形成網(wǎng)狀，胞體呈錐體狀和紡錘狀，伴有長軸突和樹突形成。熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元NF200染色呈紅色，細胞核染色呈藍色，表明原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定成功。Aβ1-42是常用于AD體外細胞模型研究。眾多研究已證實Aβ1-42能夠明顯促進海馬神經(jīng)元凋亡。為此，本研究以海馬神經(jīng)元終濃度30 μmol·L-1的Aβ1-42處理48 h構(gòu)建體外細胞模型。結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組海馬神經(jīng)元存活率明顯減低，凋亡率明顯升高，表明Aβ1-42誘導海馬神經(jīng)元凋亡模型構(gòu)建成功。為明確SI對Aβ1-42誘導海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡的影響及作用機制。本實驗通過設置SI-L、SI-M和SI-H濃度，觀察海馬神經(jīng)元存活率、炎癥、凋亡率以及NF-κB信號活化情況。MTT和TUNEL染色檢測顯示，與Model相比，SI-L、SI-M和SI-H組海馬神經(jīng)元存活率明顯升高，凋亡率降低。Western blot檢查顯示，與Control組相比，Model組海馬神經(jīng)元COX-2、TNF-ɑ、p-IκBα、p-NF-κB p65、cleaved-caspase-3蛋白表達均明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低，表明Aβ1-42能夠通過活化NF-κB p65，誘導海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡。與Model組相比，SI處理后能夠明顯抑制NF-κB p65信號活化，降低COX-2、TNF-ɑ、cleaved-caspase-3表達，促進Bcl-2蛋白表達。以往研究顯示COX-2啟動子含有NF-κB結(jié)合位點。在炎癥激活狀態(tài)下，p-NF-κB與COX-2生成呈正相關[15]。TNF-α是NF-κB強烈的激活劑，而NF-κB的激活能夠誘導細胞釋放TNF-α，從而形成一個正反饋NF-κB活化途徑[10]。

綜上所述，SI能夠抑制Aβ1-42誘導的海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡，其機制與調(diào)控NF-κB p65信號通路相關。本實驗初次在細胞層面上證實了SI在海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡中的保護作用，后續(xù)將在體內(nèi)動物實驗中進一步探究SI在AD大鼠海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡中的保護作用以及NF-κB p65信號的上游調(diào)控機制，以期為AD的SI防治提供更多參考依據(jù)。

(致謝：感謝安徽醫(yī)科大學科研中心的老師給予的幫助！)