徐慶萍, 鐘小藝, 秦 學(xué), 馮靜韻, 彭 歡, 蘇永少, 馬智超, 周四桂

(廣東藥科大學(xué)1. 中藥學(xué)院，廣州 510006；2. 附屬第一醫(yī)院臨床藥學(xué)重點(diǎn)專科，廣東 廣州 510699)

心力衰竭是人類健康的“第一殺手”，是心血管疾病的終末階段。心力衰竭屬于發(fā)病率、住院率和死亡率高的疾病，甚至比許多癌癥還高[1]，隨著現(xiàn)代社會(huì)老齡化趨勢(shì)逐漸增強(qiáng)，心血管疾病發(fā)病人數(shù)逐年上升，因此，尋找更有效的心力衰竭治療藥物迫在眉睫。

心肌能量代謝障礙與心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)[2]。短鏈?；o酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD)是脂肪酸β氧化的限速酶，催化短鏈酰基輔酶A的脫氫反應(yīng)[3]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),SCAD在慢性高血壓、心肌梗死后心力衰竭大鼠及心肌細(xì)胞凋亡模型中表達(dá)顯著下調(diào)[4-6]，而SCAD重組腺病毒能明顯改善大鼠心肌梗死后心力衰竭[7]。核黃素(riboflavin)又稱維生素B2，其在體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一為黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)，F(xiàn)AD是真核細(xì)胞中大量脫氫酶的輔酶[8]。FAD參與?；o酶A脫氫酶家族發(fā)揮生理作用的過(guò)程，而SCAD是?；o酶A脫氫酶家族成員中和FAD綁定最緊密的一員[9]。本課題組前期研究表明，F(xiàn)AD可通過(guò)激活SCAD來(lái)抑制大鼠病理性心肌肥厚以及心肌纖維化[10]。研究發(fā)現(xiàn)，核黃素能減輕大鼠I型糖尿病心力衰竭和小鼠心肌梗死模型的心肌損傷[11-12]。然而，核黃素能否通過(guò)提高FAD含量，激活SCAD從而抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心力衰竭，尚不清楚。

本研究采用主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)(thoracic aortic constriction, TAC)構(gòu)建壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心力衰竭模型，術(shù)前1周及術(shù)后8周進(jìn)行核黃素灌胃治療，觀察核黃素對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)小鼠心力衰竭的作用及其防治機(jī)制，為核黃素用于臨床防治心力衰竭提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑SPF級(jí)C57BL/6J小鼠40只，♂，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0034。核黃素(Sigma，批號(hào)：WXBD28883V)、SCAD酶活性試劑盒(GENMED，批號(hào)：1-2018412-10)、SYBR Green (TaKaRa，批號(hào): AJ12457A)、多克隆兔抗SCAD(ProteinTech，批號(hào)：00012655)、多克隆兔抗Bcl-2(ProteinTech，批號(hào)：00083551)、多克隆兔抗Bax(ProteinTech,批號(hào)：00082363)、多克隆兔抗cleaved-caspase-3(ProteinTech,批號(hào)：00088666)、單克隆鼠抗GAPDH(ProteinTech，批號(hào)：10013030)、ATP試劑盒(碧云天，批號(hào)：082720201203)、FAD酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(上海雙贏生物科技，批號(hào)：202106)、游離脂肪酸試劑盒(南京建成，批號(hào)：20210813)。

1.2 儀器紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(SHIMADZU)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (SpectraMax i3x)，化學(xué)發(fā)光儀(上海勤翔)，酶標(biāo)儀(Thermo)，熒光定量PCR儀(伯樂(lè))，電儀分析天平(SHIMADZU),微量分光光度計(jì)(ALLSHENG Nano-100)。

1.3 小鼠TAC術(shù)誘導(dǎo)心力衰竭模型構(gòu)建以及核黃素干預(yù)選取8周齡C57BL/6J ♂小鼠48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：Sham組(10只)、Sham+核黃素組(10只)、TAC組(14只)以及TAC+核黃素組(14只)。采用TAC術(shù)構(gòu)建壓力超負(fù)荷小鼠心力衰竭模型，用0.45%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)腹腔注射麻醉小鼠后，打開(kāi)小鼠胸腔，TAC組用0.5 mm孔徑的墊針結(jié)扎主動(dòng)脈弓，Sham組只開(kāi)胸穿線但不結(jié)扎。Sham+核黃素以及TAC+核黃素組術(shù)前1周以及術(shù)后8周進(jìn)行灌胃給藥核黃素(20 mg·kg-1·d-1)，Sham以及TAC組小鼠予以相同體積的生理鹽水灌胃，TAC組及TAC+核黃素組小鼠在手術(shù)過(guò)程和術(shù)后各死亡4只，而Sham組以及Sham+核黃素組在8周內(nèi)無(wú)小鼠死亡情況，40只小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。術(shù)后8周各組10只小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后取材，并進(jìn)行心臟體重比檢測(cè)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取每組各6只小鼠用于染色、蛋白表達(dá)及生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢查T(mén)AC術(shù)后8周，各組小鼠經(jīng)異氟烷(劑量控制：0%～5%)吸入麻醉后，進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)。測(cè)量小鼠的各心功能指標(biāo)：心臟射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)和心臟的縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening, FS)、收縮末期左心室內(nèi)徑(left ventricular dimensions at end systole, LVIDs)和舒張末期左心室內(nèi)徑(left ventricular dimensions at end diastole, LVIDd)、心博出量(cardiac output, CO)、心每博輸出量 (stroke volume, SV)、收縮末期左心室容積(left ventricular end systolic volume, LVESV)和舒張末期左心室容積(left ventricular end diastole volume, LVEDV)等。

1.5 動(dòng)物取材各組小鼠取材前12 h禁食，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)摘眼球取血后，靜置血樣分離血清，心臟用冷凍PBS充分灌注后，取出心臟。部分心臟組織以及全部血清及時(shí)速凍置于-80 ℃保存，部分心臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定進(jìn)行石蠟包埋切片。

1.6 心肌組織形態(tài)學(xué)檢查用組織固定液固定部分心臟組織，石蠟包埋后切片，之后采用TUNEL熒光染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比，從而判斷心力衰竭程度。采用免疫熒光染色法檢測(cè)SCAD在心肌組織的表達(dá)。

1.7 線粒體膜腫脹程度檢測(cè)用組織線粒體分離試劑盒提取小鼠心肌組織線粒體，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)開(kāi)放情況，用BCA試劑盒測(cè)定線粒體蛋白含量。配制線粒體反應(yīng)緩沖液，其組分為[150 mmol·L-1KCl、10 mmol·L-1Tris、20 mmol·L-1MOPS、5 mmol·L-1KH2PO4(pH 7.4)]，加入相同質(zhì)量濃度的線粒體后，在540 nm波長(zhǎng)處，每間隔1 min，測(cè)試20 min，檢測(cè)吸光度值的下降幅度，設(shè)吸光值變化的量ΔA，初始為A，以ΔA/A表示小鼠心肌組織中線粒體膜腫脹程度。

1.8 線粒體膜電位檢測(cè)用上述線粒體提取試劑盒提取心肌線粒體后，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行，測(cè)定JC-1單體及其聚合物的熒光強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)各組相對(duì)對(duì)照組的JC-1聚合物與單體熒光強(qiáng)度比值，即為各組的心肌線粒體膜電位變化。

1.9 心肌中FAD含量檢測(cè)用生理鹽水搗碎心肌組織后，離心后取上清，得組織勻漿，之后嚴(yán)格按照試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.10 ATP含量測(cè)定用試劑盒提供的ATP檢測(cè)裂解液裂解心肌組織后，把所測(cè)得的樣品熒光值代入根據(jù)試劑盒制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得ATP濃度，同時(shí)進(jìn)行蛋白定量，檢測(cè)各組心肌組織中ATP含量。

1.11 SCAD酶活性檢測(cè)根據(jù)2,6-二氯靛酚鈉作為人工電子受體，在SCAD的催化下，由短鏈脂酰輔酶A乙酰輔酶A提供的電子，經(jīng)過(guò)硫酸鉀脂吩嗪的傳遞，產(chǎn)生其還原產(chǎn)物的吸光度值降低的原理，采用比色法進(jìn)行SCAD酶活性測(cè)定，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.12 游離脂肪酸含量檢測(cè)游離脂肪酸能與銅試劑反應(yīng)生成對(duì)應(yīng)銅鹽，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組樣品OD數(shù)值，代入試劑盒提供的計(jì)算公式，得心肌與血清中游離脂肪酸含量，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.13 Western blot分析用RIPA裂解液裂解心臟組織，提取蛋白，用BCA試劑盒蛋白定量后，100 ℃煮沸蛋白5 min。配濃縮膠以及分離膠，控制每塊膠的梳孔上等量蛋白樣品，隨后進(jìn)行電泳，條件為濃縮膠70 V，30 min，分離膠120 V，90 min。按照快速轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為：330 mA，37 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，TBST緩沖液洗膜，再用5%BSA溶液室溫封閉1.5 h。封閉后，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，一抗的稀釋比為：SCAD抗體(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、cleaved caspase-3(1 ∶1 000)、pro-caspase-3(1 ∶1 000)、GAPDH抗體(1 ∶100 000)。d 2用TBST緩沖液洗膜后，室溫孵育二抗1 h，二抗稀釋比為兔抗(1 ∶10 000)、鼠抗(1 ∶10 000)。最后TBST緩沖液洗膜后，用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.14 Real-time PCR用裂解液TRIzol裂解心肌組織，提取RNA，隨后測(cè)定RNA的純度和濃度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，把RNA反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，保存于-20 ℃冰箱中。d 2，配制RT- PCR 反應(yīng)體系，上機(jī)檢測(cè)。小鼠源SCAD基因引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Real-time PCR experimental gene primer sequences

2 結(jié)果

2.1 核黃素對(duì)小鼠心臟體重比的影響由Fig 1所示，與Sham組相比，TAC誘導(dǎo)心力衰竭模型組的小鼠心臟體重比明顯增大(P<0.01)；與TAC組相比，TAC+核黃素組小鼠心臟體重比明顯減小(P<0.01)，表明核黃素明顯改善了壓力過(guò)載誘導(dǎo)心力衰竭小鼠的心臟體積與重量增加。

Fig 1 Comparison of ratios of heart weight (HW)/body weight (BW) of mice in each n=10)

2.2 核黃素對(duì)小鼠超聲心動(dòng)圖的影響如Fig 2A所示，Sham組和Sham+核黃素組左心室壁收縮舒張功能正常，TAC組左心室壁出現(xiàn)收縮舒張功能障礙的情況，心室腔增大。與TAC組相比，TAC+核黃素組收縮舒張功能明顯增強(qiáng)，心室腔減小。如Fig 2B所示，與Sham組相比，TAC組的心輸出量、每搏輸出量、EF值和FS值均明顯減小(P<0.01)，而收縮/舒張末期左心室內(nèi)徑與容積均明顯增大(P<0.01)，表明TAC術(shù)后8周小鼠心臟收縮舒張功能障礙，心臟射血能力及心功能指數(shù)明顯下降，心力衰竭模型構(gòu)建成功。與TAC組相比，TAC+核黃素組的上述指標(biāo)均得到明顯改善。以上結(jié)果表明，核黃素能明顯延緩TAC手術(shù)后小鼠發(fā)展為心力衰竭的病理進(jìn)程。

Fig 2 Changes of echocardiography in each group n=10)

2.3 核黃素對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響由Fig 3 TUNEL熒光結(jié)果圖顯示，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。其中Sham組及Sham+Riboflavin組左心室沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；與Sham組比較，TAC組左心室陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于Sham組(P<0.01),出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。與TAC組相比，TAC+Riboflavin組左心室心肌細(xì)胞凋亡情況得到明顯改善，陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0.01)，表明核黃素具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。

Fig 3 TUNEL staining of mice in each group (400×) n=6)

2.4 核黃素對(duì)小鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，與Sham組相比，TAC組小鼠的心肌組織促凋亡蛋白Bax與cleaved-caspase-3表達(dá)均明顯增加(P<0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減少(P<0.01)。與TAC組相比，TAC+Riboflavin組心肌組織促凋亡蛋白Bax與cleaved-caspase-3表達(dá)均明顯減少(P<0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯增加(P<0.01)，以上變化與心肌組織TUNEL熒光染色結(jié)果一致，表明核黃素能夠明顯改善心肌細(xì)胞凋亡。

Fig 4 Expression of apoptotic protein in myocardial tissues of mice in each group n=6)

2.5 核黃素對(duì)小鼠心肌組織中SCAD表達(dá)、酶活性以及FAD含量的影響由Fig 5A-C所示，與Sham組相比，TAC組小鼠心肌組織中SCAD的蛋白、mRNA表達(dá)和其酶活性均明顯減少(P<0.01)；與TAC組相比，TAC+Riboflavin組小鼠SCAD蛋白、mRNA在心肌組織中表達(dá)及其酶活性均明顯增加(P<0.01)。由Fig 5D所示，與Sham組相比，TAC組小鼠心肌組織中FAD含量明顯減少(P<0.01)；與TAC組相比，TAC+Riboflavin組小鼠心肌組織中FAD含量明顯增加(P<0.01)，表明核黃素可能通過(guò)提高FAD水平，從而激活SCAD，起到抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心力衰竭作用。

Fig 5 SCAD protein, mRNA, enzyme activity and FAD content in myocardial tissues of mice in each group n=6)

2.6 核黃素對(duì)小鼠心肌組織中SCAD免疫熒光的影響如Fig 6所示，與Sham組相比，TAC組小鼠心肌組織SCAD免疫熒光明顯減弱，SCAD表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與TAC組相比，TAC+Riboflavin組小鼠心肌組織SCAD免疫熒光明顯增強(qiáng)，SCAD表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，與SCAD的mRNA及酶活性水平變化一致。

Fig 6 SCAD immunofluorescence staining in myocardial tissues of mice in each group n=6)

2.7 核黃素對(duì)小鼠心肌能量代謝的影響如Fig 7A、B所示，與Sham組相比，TAC組小鼠心肌線粒體膜電位明顯下降(P<0.01)，膜腫脹程度明顯增加(P<0.01)；與TAC組相比，TAC+Riboflavin組小鼠心肌線粒體膜電位顯著上升(P<0.01)，膜腫脹程度明顯減少(P<0.01)。表明TAC組小鼠心肌線粒體功能障礙，核黃素干預(yù)后小鼠心肌線粒體功能得到明顯改善。如Fig 7C所示，與Sham組相比，TAC組心肌組織中ATP含量明顯減少(P<0.01)；與TAC組相比，TAC+Riboflavin組心肌組織中ATP含量明顯增加(P<0.01)。與Sham組相比，TAC組心肌以及血清中的游離脂肪酸含量均明顯增加(P<0.01)；與TAC組比，TAC+Riboflavin組心肌以及血清中的游離脂肪酸含量均明顯減少(P<0.01)。表明核黃素可能通過(guò)激活SCAD，改善心肌能量代謝，從而抑制小鼠心力衰竭。

Fig 7 Changes of cardiac mitochondrial membrane potential and membrane swelling, myocardial tissue ATP, and free fatty acids in tissues and serum in each group of mice n=6)

3 討論

心力衰竭最基本的表現(xiàn)為心肌收縮舒張功能障礙，供血能力降低，不能滿足機(jī)體正?；顒?dòng)需要。心肌能量代謝障礙與心力衰竭發(fā)生密切相關(guān)。生理狀態(tài)下，心肌中線粒體脂肪酸β氧化提供70%能量供應(yīng)。在心力衰竭情況下，心肌代謝方式由脂肪酸β氧化轉(zhuǎn)變成葡萄糖氧化，此時(shí)，脂肪酸大量積累，其氧化能力減弱，而葡萄糖氧化產(chǎn)生的能量卻不足以供應(yīng)心肌正常能量需要[13]。

SCAD是脂肪酸β氧化限速酶，也是黃素蛋白之一，在心肌能量代謝中發(fā)揮重要作用。我們前期研究顯示，SCAD對(duì)心力衰竭具有負(fù)性調(diào)控作用。FAD為核黃素在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，是體內(nèi)多種黃素蛋白參與氧化還原反應(yīng)的輔助因子，而FAD可調(diào)節(jié)SCAD的基因表達(dá)[14]。核黃素作為FAD的前體，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成FAD。臨床上，核黃素主要用于防治口、眼和外生殖器部位的炎癥如口角炎、眼結(jié)膜炎和陰囊炎等核黃素缺乏病。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)核黃素與許多新的臨床疾病相關(guān)，如秋季腹瀉、燒傷以及心血管疾病等[15]。其中心力衰竭與核黃素的關(guān)系近年來(lái)似乎得到研究者的青睞。相關(guān)研究表明，大多數(shù)心衰病人存在微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏癥，而且心衰病人比普通人群更易患有B族維生素缺乏癥[16]。核黃素作為B族維生素之一，參與機(jī)體大量的能量代謝過(guò)程，同時(shí)也是心衰病人的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。缺乏B族維生素可能是心衰病人心肌能量供應(yīng)不足的原因之一，給予心衰病人適當(dāng)補(bǔ)充B族維生素有利于改善患者心肌能量代謝[17]。因此，本研究進(jìn)一步探索核黃素對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)小鼠心力衰竭的作用及其作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，在TAC誘導(dǎo)壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心力衰竭病理狀態(tài)下，TAC組小鼠出現(xiàn)了明顯的心肌收縮舒張功能以及線粒體功能障礙，線粒體膜電位減少，膜腫脹程度增加，心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡。核黃素治療后小鼠的心肌收縮舒張功能以及線粒體功能均得到明顯改善，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，表明核黃素能有效延緩心力衰竭的病理進(jìn)程。TAC組小鼠心肌中FAD含量明顯降低，ATP含量明顯減少，心肌和血清中游離脂肪酸含量明顯增加， SCAD表達(dá)明顯減少、酶活性降低，表明壓力超負(fù)荷小鼠出現(xiàn)了明顯的心肌能量代謝障礙。經(jīng)核黃素治療后，小鼠心肌中FAD含量明顯增加、SCAD酶活性及ATP含量顯著增加，游離脂肪酸含量明顯減少，表明核黃素能顯著改善TAC誘導(dǎo)壓力超負(fù)荷小鼠的心肌能量代謝障礙。

已有研究表明，核黃素可通過(guò)提高血紅素氧合酶-1蛋白表達(dá)和超氧化物歧化酶活性，從而降低心肌氧化應(yīng)激，減輕大鼠經(jīng)單次注射鏈脲佐菌素誘發(fā)Ⅰ型糖尿病的心力衰竭，顯著改善左心室收縮舒張功能[11]。此外，有學(xué)者采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)建立小鼠急性心肌梗死后心力衰竭模型，證實(shí)核黃素能減輕小鼠心肌梗死模型的心肌損傷[12]，這一作用是通過(guò)激活賴氨酸特異性脫甲基酶1的活性、調(diào)節(jié)相關(guān)磷脂代謝基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究采用TAC術(shù)模擬長(zhǎng)期壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭，觀察到核黃素對(duì)慢性心力衰竭具有相似的保護(hù)作用，且從心肌能量代謝新視角闡明了核黃素通過(guò)提高FAD含量、激活SCAD，促進(jìn)線粒體脂肪酸β氧化反應(yīng)，改善心肌能量代謝，抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用，這可能是核黃素具有心臟保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制之一。以上研究結(jié)果為核黃素在臨床上用于防治心力衰竭提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，具有十分重要的臨床意義。然而，本研究由于樣本量相對(duì)較少，得出的初步結(jié)果還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，有關(guān)核黃素通過(guò)激活SCAD抑制小鼠心力衰竭的分子機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究。