石明明 李惠霞 劉永剛 李文豪 倪春輝 韓變 連蕓蕓 姜偉

摘要 為明確甘肅省黨參根結線蟲病的發(fā)生、分布及病原種類，在甘肅省黨參主產(chǎn)區(qū)調查、統(tǒng)計田間根結線蟲病發(fā)生情況，并通過形態(tài)學和分子生物學方法進行種類鑒定。結果表明，甘肅省6個黨參主產(chǎn)區(qū)均有根結線蟲病發(fā)生，病田率、病株率分別為40.7%、13.2%，病情指數(shù)為10.4。依據(jù)根結線蟲各蟲態(tài)的形態(tài)測量值和雌蟲會陰花紋等特征，將危害黨參的根結線蟲初步鑒定為北方根結線蟲Meloidogyne hapla Chitwood，1949。rDNA-ITS區(qū)段和28S rDNA D2D3區(qū)段序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，6個根結線蟲群體無核苷酸差異，與多個北方根結線蟲聚為一支且有較高的置信度。利用特異性引物Mh-F/Mh-R擴增得到北方根結線蟲的特異性片段，大小為462 bp。故綜合形態(tài)學和分子生物學特征，將危害甘肅省黨參的根結線蟲鑒定為北方根結線蟲。

關鍵詞 黨參;北方根結線蟲;鑒定;發(fā)生

中圖分類號： S435.67

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021203

Abstract In order to clarify the occurrence， distribution and species of the root-knot nematode disease of Codonopsis pilosula in Gansu， China， the disease incidence in the field of C.pilosula was surveyed in main growing areas of Gansu province， and the species was identified using morphological and molecular biological methods. The results showed that root-knot nematode disease occurred in six main growing areas of C.pilosula. It was found that 40.7% of fields and 13.2% of plants were infected， and the disease index was 10.4. Based on morphometrics of nematodes and perineal patterns of females， the nematodes were identified as Meloidogyne hapla Chitwood， 1949. Sequence alignment of rDNA-ITS and 28S rDNA D2D3 and phylogenetic analysis revealed that there was no difference in nucleotide among six populations of root-knot nematodes on C.pilosula， which clustered with M.hapla with high confidence. Moreover， a specific fragment of 462 bp in size was obtained from the tested samples using the specific primers Mh-F/Mh-R. Therefore， the root-knot nematode infecting C.pilosula in Gansu was identified as M.hapla by using morphological and molecular methods.

Key words Codonopsis pilosula;Meloidogyne hapla;identification;occurrence

黨參Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.為桔梗科黨參屬植物[1]，是中國傳統(tǒng)名貴中藥材。其味甘、性平，臨床上常用于補中益氣、止渴、健脾益肺和養(yǎng)血生津[2]。甘肅省是我國黨參的主產(chǎn)區(qū)，有“千年藥鄉(xiāng)”之稱[3]，據(jù)統(tǒng)計，黨參種植面積約為4.22萬 hm2，總產(chǎn)量達10 250萬 kg，居于全國前列[4]。甘肅省因其獨特的地理條件，所產(chǎn)黨參主根肥大粗壯、肉質甜味重香氣濃，銷往東南沿海各大城市，廣受歡迎[5]。近年來，黨參市場需求量增加，種植面積也不斷擴大，黨參病害日益嚴重，常見病害有根腐病、銹病、紫紋羽病、白粉病和霜霉病[4]，但對黨參線蟲病報道較少。

根結線蟲（root-knot nematode， RKN）隸屬于墊刃目Tylenchida異皮科Heteroderidae根結線蟲屬Meloidogyne[6]。其分布廣泛，適應性強，寄主多樣，常造成嚴重的經(jīng)濟損失[7]。迄今為止，國內外已經(jīng)報道的根結線蟲有100多種[8-9]，廣泛寄生于糧食作物、經(jīng)濟作物、蔬菜、果樹、觀賞植物和雜草[10]。其中，對經(jīng)濟有重大影響的種類有南方根結線蟲M.incognita、花生根結線蟲M.arenaria、爪哇根結線蟲M.javanica和北方根結線蟲M.hapla等4種[11]。北方根結線蟲是冷涼地區(qū)植物的重要根結線蟲種類，主要分布在北緯34°到43°[12]，能侵染甘草Glycyrrhiza uralensis、薄荷Mentha canadensis、當歸Angelica sinensis、白芷Angelica dahurica和桔梗Platycodon grandiflorus等60多種藥材[13]，造成主根生長受阻，植株須根增多，呈須根團，嚴重影響藥材質量。甘肅省定西市和隴南市宕昌縣地處北緯34°到36°之間，氣候涼爽陰濕，且大面積種植黨參、當歸和黃芪等中藥材。

2020年，我們在甘肅省渭源縣黨參上首次發(fā)現(xiàn)北方根結線蟲[14]，本試驗擬對甘肅省黨參主產(chǎn)區(qū)根結線蟲病進行調查，以探明該線蟲病的發(fā)生和分布情況，同時鑒定根結線蟲種類，為該地區(qū)黨參根結線蟲病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品：2020年9月-11月，采用田間隨機取樣法對甘肅省黨參種植區(qū)進行系統(tǒng)調查，采集黨參病株，同時收集病株根際土壤約500 g，共179份樣品，裝入自封袋中，帶回實驗室備用。

LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物10 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂粉15 g，加蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌25 min，冷卻至50℃加入100 mg/mL氨芐青霉素1 mL，倒入培養(yǎng)皿中凝固后備用。

試劑：瓊脂糖，廣州賽國生物科技有限公司;2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素，生工生物工程（上海）股份有限公司;線蟲裂解液（10 mmol/L Tris HCl，50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，0.45%NP40，0.45%Tween20，pH 8.3）、pMDTM18-T載體、大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細胞，寶日醫(yī)生物技術有限公司;DNA凝膠回收試劑盒、核酸染料，北京擎科生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：OLYMPUS SZX16體視顯微鏡，日本奧林巴斯公司;HPX-Ⅱ-80培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司;Axio Lab.A1顯微鏡，德國Carl Zeiss公司;T100PCR儀，美國Bio-Rad 公司;DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠;Essential V6凝膠成像分析系統(tǒng)，英國UVITEC公司。

1.2 方法

1.2.1 黨參根結線蟲病發(fā)生情況調查

調查地點為甘肅省黨參主產(chǎn)區(qū)，調查品種為‘白條黨’，調查時間為2020年9月-11月。調查時記錄經(jīng)緯度、海拔、生境和前茬作物等信息，帶回實驗室進一步分離鑒定并統(tǒng)計病田率、病株率和病情指數(shù)。

參照劉紀霜等[15]和張鋒等[16]的分級標準統(tǒng)計黨參根結線蟲病發(fā)生情況。0級：所有須根都無根結;1級：只有少數(shù)須根有根結， 根結數(shù)在10個以下，根結百分率小于10%;2級：大部分須根有根結，根結數(shù)10～50個，根結百分率11%～25%;3級：須根有較多根結，根結百分率為26%～50%;4級：須根有許多串珠狀根結，根結百分率為51%～75%;5級：根結互相連接成須根團，根結百分率為76%～100%。

病田率=發(fā)病田數(shù)/調查總田數(shù)×100%;

病株率= 發(fā)病株數(shù)/調查總株數(shù)×100%;

病情指數(shù)=∑（各病級植株數(shù)×病級值）調查總株數(shù)×最高病級值×100。

1.2.2 根結線蟲的分離和形態(tài)學鑒定

1.2.2.1 雌蟲的分離和形態(tài)觀察

將洗凈的黨參病株根系置于體視顯微鏡下，用解剖刀將根結表皮輕輕剖開，可見乳白色的球狀物即為根結線蟲雌蟲，用毛刷或軟鑷子夾出，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將收集到的雌蟲置于盛有0.9%NaCl溶液的載玻片上，觀察形態(tài)特征并拍照。每個樣本挑取20頭，參照謝輝[17]的方法測量形態(tài)值。拍照后的雌蟲用于會陰花紋的制作。

會陰花紋的制作：將雌蟲置于盛有一滴45%乳酸的載玻片上，先用解剖刀將雌蟲頸部切去，輕輕擠壓蟲體使內含物排出，將含有會陰花紋的蟲體后部切下。用特制的毛針清理會陰部角質層，將其轉移到另一滴純甘油中，用毛針撥正鋪平，蓋上蓋玻片，用指甲油封固，進行形態(tài)觀察并拍照。

1.2.2.2 2齡幼蟲的分離和形態(tài)觀察

參照楊艷梅等的方法[18]，將卵塊置于盛有一滴蒸餾水的培養(yǎng)皿中，（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化2～3 d，得到大量2齡幼蟲。

每個樣本挑取20條2齡幼蟲，置于盛有一滴蒸餾水的載玻片上。用酒精燈外焰加熱，每隔2～3 s在顯微鏡下觀察蟲體，若蟲體突然伸直，表明線蟲死亡。將死亡的線蟲置于載玻片上進行形態(tài)觀察并拍照，參照謝輝[17]的方法測量形態(tài)值。

1.2.3 分子生物學鑒定

1.2.3.1 線蟲DNA的提取

線蟲DNA的提取參照王江嶺等[19]和王曦茁等[20]的方法并稍作改進：將卵塊中孵化的單條2齡幼蟲挑至ddH2O中清洗2～3次，隨后轉移到含有10 μL線蟲裂解液的PCR管中。用滅菌解剖刀將線蟲切成數(shù)節(jié)，短暫離心后，加入1 mg/mL的蛋白酶K 1 μL，置于PCR儀中，65℃1 h，95℃10 min，得到線蟲DNA粗提取液。

1.2.3.2 目的片段的PCR擴增

采用線蟲rDNA-ITS通用引物TW81/AB28[21]、28S rDNA D2D3區(qū)段通用引物D2A/D3B[22]及北方根結線蟲的特異性引物Mh-F/Mh-R[23]進行PCR擴增。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

PCR反應體系：DNA模板3 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O補足到25 μL。

PCR程序：95℃預變性3 min;95℃變性30 s，退火溫度（表1）退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。

取擴增產(chǎn)物5 μL經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.2.3.3 擴增產(chǎn)物的測序及數(shù)據(jù)分析

參照DNA凝膠回收試劑盒說明書，回收該根結線蟲rDNA-ITS序列和28S rDNA D2D3區(qū)段序列的擴增產(chǎn)物，將回收后的產(chǎn)物與pMDTM18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，最后委托北京擎科生物科技有限公司雙向測序。采用Clustal W對所得的序列和近源種的序列進行比對分析，用Gblock 0.91b 選擇保守區(qū)域，并用MeModeltest vesion 2.3進行核苷酸替換模型的選擇，最后用MrBayes構建系統(tǒng)發(fā)育樹。以大豆孢囊線蟲Heterodera glycines（登錄號KY964273）和禾谷孢囊線蟲Heterodera avenae（登錄號KY468873）為ITS系統(tǒng)發(fā)育樹外群，以禾谷孢囊線蟲Heterodera avenae（登錄號為KX573052和LT159825）為28S rDNA D2D3區(qū)段序列系統(tǒng)發(fā)育樹外群。

2 結果與分析

2.1 甘肅省黨參主產(chǎn)區(qū)根結線蟲病的發(fā)生與分布

如表2所示，黨參主產(chǎn)區(qū)定西市臨洮縣、渭源縣、漳縣、隴西縣、岷縣和隴南市宕昌縣均發(fā)生黨參根結線蟲病，平均病田率為40.7%，病株率為13.2%，病情指數(shù)為10.4。

其中岷縣的病田率和病株率均最高，分別為62.3%和21.2%，其次為臨洮縣，隴西縣病田率和病株率最低，分別為23.0%和5.7%。病情指數(shù)以臨洮縣最高，為29.8，其次為岷縣，為12.7，隴西縣最低，為3.2。

2.2 黨參根結線蟲病癥狀

黨參感染根結線蟲后，地上部表現(xiàn)為植株矮小黃化，生長緩慢，類似肥水不足。在田間，發(fā)黃的病株常呈現(xiàn)塊狀分布，嚴重時全田可發(fā)病，植株死亡（圖1a）。病株地上部整體呈簇狀，生長受到抑制。地下部癥狀明顯，初期幼根根尖膨大，逐漸變成小米粒大小不規(guī)則的瘤狀物，初期乳白色，表面光滑，后期變深褐色。生長后期黨參根部主要表現(xiàn)為主根弱化，須根增多，大量的根結連接成須根團（圖1c～d），刨開根結可見針頭大乳白色的雌成蟲。

2.3 黨參根結線蟲形態(tài)學特征

黨參上分離到的根結線蟲雌蟲形態(tài)測量值見表3。雌蟲蟲體為檸檬形或梨形（圖2a，c），乳白色，平均體長531.9～633.4 μm，體寬364.3～397.0 μm，蟲體前端突出如頸，后端呈圓球形?？卺槒妷眩▓D2b），長11.4～12.6 μm，背食道腺開口到口針基部球的距離3.5～4.0 μm。中食道球發(fā)達，近圓形，頭端到中食道球中央的距離62.2～68.8 μm。雌蟲會陰花紋整體呈卵圓形，背弓略平緩，有些群體刻線明顯，有些不明顯（圖2d），肛門處有刻點。所觀察的線蟲群體會陰花紋特征與北方根結線蟲的一致。

分離到的根結線蟲雄蟲形態(tài)測量值見表3。雄蟲蟲體蠕蟲形（圖3a），體長956.1～1 225.9 μm，口針粗壯（圖3b），長18.7～19.8 μm，背食道腺開口到口針基部球的距離3.1～4.6 μm。尾部鈍圓，殺死后稍向腹面彎曲，交合刺成對，針狀，長22.8～24.3 μm （圖3c）。

分離到的根結線蟲2齡幼蟲形態(tài)測量值見表4。蟲體細長，兩端稍尖細（圖3d），長367.1～383.1 μm，體寬15.0～16.2 μm，唇區(qū)無明顯縊縮，口針發(fā)達（圖3e），長10.2～11.1 μm，口針基部球明顯，呈圓形，寬1.5～1.8 μm，高1.2～1.4 μm。背食道腺開口到口針基部球的距離2.8～3.2 μm，中食道球長10.5～11.2 μm，中食道球寬7.5～8.3 μm，排泄孔至頭端的距離64.9～67.9 μm。尾部形態(tài)多變，尾長39.0～45.5 μm，尾部透明區(qū)清晰，這些形態(tài)特征均與北方根結線蟲的相符。

2.4 分子生物學特征

利用通用引物TW81和AB28擴增得到rDNA-ITS片段，6個群體的片段大小均為557 bp，序列一致性為100%。Blastn比對結果顯示，6個根結線蟲群體rDNA-ITS序列（GenBank登錄號MW690027-MW690032）與北方根結線蟲（GenBank登錄號MT490918、MN752202等）一致性為99.46%～100.00%。基于GTR+I+G模型構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，6個根結線蟲均聚在一起，置信度為58%，且與上述13個北方根結線蟲序列聚為一大支，置信度為94%，與其他16個根結線蟲序列可明顯區(qū)分開（圖4）。

利用通用引物D2A和D3B擴增得到28S rDNA D2D3區(qū)段，6個群體的片段大小均為762 bp。Blastn比對結果顯示，這6個根結線蟲群體序列（GenBank登錄號MW690210-MW690215）與北方根結線蟲（GenBank登錄號MK213348、KJ645233等）一致性為99.60%～100.00%?；贕TR+I+G模型構建6個地區(qū)黨參根結線蟲28S系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該根結線蟲28S rDNA D2D3序列與上述21個北方根結線蟲序列聚為一支，置信度達100%，與14個其他根結線蟲序列可明顯區(qū)分開（圖5）。

利用北方根結線蟲特異性引物Mh-F/Mh-R擴增均得到大小為462 bp的特異性片段（圖6），而對照樣品沒有擴增到條帶。綜上所述，形態(tài)學特征結合rDNA-ITS序列、28S rDNA D2D3區(qū)序列和北方根結線蟲特異性片段擴增結果，將上述6個黨參根結線蟲群體均鑒定為北方根結線蟲Meloidogyne hapla Chitwood， 1949。

3 討論

黨參作為經(jīng)濟價值較高的藥材，近年來在甘肅省種植面積逐年擴大[24]，但隨著市場需求量的增加，黨參田連作現(xiàn)象愈加嚴重，加重了土傳病害的發(fā)生。2020年，本課題組在定西市渭源縣部分黨參植株上發(fā)現(xiàn)根結線蟲病[14]，但未對甘肅省其他種植區(qū)進行詳細的調查。基于此，本試驗對甘肅省6個黨參種植區(qū)進行系統(tǒng)調查，結果顯示，甘肅省6個黨參種植區(qū)均發(fā)現(xiàn)根結線蟲病，其中定西市岷縣最為嚴重，病田率和病株率分別為62.3%和21.2%，病情指數(shù)為12.7。其次為臨洮縣、宕昌縣、漳縣和渭源縣，隴西縣發(fā)病最輕。

根結線蟲的鑒定通常采用形態(tài)學特征和分子生物學特征相結合的方法。雌蟲會陰花紋是根結線蟲重要的形態(tài)學鑒別特征[25]，本試驗收集了甘肅省不同地區(qū)黨參根結線蟲雌成蟲的會陰花紋，發(fā)現(xiàn)其背弓緩，側線在部分群體中不存在，肛門處有刻點，這與楊艷梅等[18]在云南紫莖澤蘭上發(fā)現(xiàn)的北方根結線蟲雌蟲會陰花紋形狀相似。除2齡幼蟲中食道球到頭端的距離偏大外，本研究6個地區(qū)雌雄蟲和2齡幼蟲其他測量值均與Whitehead[26]所描述的北方根結線蟲測量值基本相符。本試驗發(fā)現(xiàn)黨參根結線蟲2齡幼蟲尾部存在多種不同的形態(tài)，尾尖常出現(xiàn)不規(guī)則的形狀，與簡恒等描述結果一致[27]。綜上，將甘肅省黨參種植區(qū)的黨參根結線蟲初步鑒定為北方根結線蟲Meloidogyne hapla。由于根結線蟲近緣種形態(tài)差異較小且測量值重疊，根結線蟲雌蟲的會陰花紋存在一定程度的種內變異[28-29]，故很難單獨依靠形態(tài)準確鑒定種類，因此，還需結合分子生物學的方法進行準確鑒定。本試驗擴增了6個黨參種植區(qū)根結線蟲rDNA-ITS和28S rDNA D2D3區(qū)序列并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示：6個根結線蟲群體的序列均無核苷酸差異，且與江蘇、新疆、云南北方根結線蟲群體有較高的相似性。特異性擴增與馮光泉等[23]結果一致，說明甘肅省黨參主產(chǎn)區(qū)根結線蟲種類單一，均為北方根結線蟲。

北方根結線蟲最早由Cunningham[30]在長島的馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)Chitwood描述并命名[31]。在我國，該線蟲最先由楊寶君[32]在北京月季、葡萄上發(fā)現(xiàn)，隨后在全國17個省市均有發(fā)現(xiàn)。甘肅省是北方根結線蟲新分布區(qū)，黨參是其新寄主，且黨參種植區(qū)因其獨特的地理和氣候條件，適合北方根結線蟲生長發(fā)育，有逐步擴大加重的趨勢。定西市岷縣和隴南市部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)為甘肅省主要的黨參育苗基地，其他各縣區(qū)黨參苗多從這兩地輸出，而調查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)黨參根結線蟲病發(fā)病最為嚴重，這將非常有利于黨參根結線蟲病在其他主產(chǎn)區(qū)傳播，因此，急需引起當?shù)刂鞴懿块T的重視，并采取相應的防治措施阻斷其傳播蔓延。

甘肅省地理位置特殊，氣候復雜，適合多種中藥材生長[33]，除黨參外，還種植黃芪、當歸、柴胡、獨活、黃芩、防風和甘草等中藥材[24]。趙來順等[13]發(fā)現(xiàn)北方根結線蟲可寄生豆科、傘形科和唇形科等多種中藥材，因此，應警惕該地區(qū)除黨參外其他中藥材受北方根結線蟲的危害。另外，馬鈴薯是北方根結線蟲的模式寄主，而該地區(qū)是我國重要的馬鈴薯種植基地，且中藥材常與馬鈴薯倒茬輪作，因此，在甘肅省中南部，北方根結線蟲在黨參上的侵染規(guī)律和對黨參產(chǎn)量的影響，以及對馬鈴薯和其他中藥材的危害情況均有待進一步研究。

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（責任編輯：楊明麗）