馬景雪張培玉王宗興鄭明剛高 萍曲凌云王 波鄭風(fēng)榮*

(1.青島大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266071;2.自然資源部 第一海洋研究所,山東 青島 266061;3.自然資源部 海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266061)

中國(guó)擁有豐富的海洋漁業(yè)資源[1],海水養(yǎng)殖在海洋漁業(yè)中占有重要的地位。近年來,我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛,其中貝類養(yǎng)殖已經(jīng)發(fā)展成為我國(guó)海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)[2],據(jù)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì),2019年全國(guó)貝類的海水養(yǎng)殖面積為120.42×104萬(wàn)m2,占全國(guó)海水養(yǎng)殖總面積60.45%;2019年全國(guó)貝類海水養(yǎng)殖產(chǎn)量為1 438.97萬(wàn)t,占全國(guó)海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的69.67%,其中山東省位居全國(guó)沿海省份貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量首位[3]。

養(yǎng)殖規(guī)模的增加,加速了向沿海生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分排放[4-7],使近海養(yǎng)殖水域的環(huán)境惡化,導(dǎo)致病害頻發(fā),給貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。養(yǎng)殖自身污染問題成為養(yǎng)殖海域環(huán)境惡化的主要原因之一[8],加劇了海水富營(yíng)養(yǎng)化程度,破壞了生物多樣性,在不同濃度有機(jī)質(zhì)的影響下,微生物群落的生理機(jī)能也隨之發(fā)生改變[9-10],而每天過濾大量海水的濾食性動(dòng)物——雙殼貝類則更容易受到水中細(xì)菌群落變化的影響[11],從而誘發(fā)貝類病變。

位于青島嶗山灣海域的青山村扇貝養(yǎng)殖區(qū)規(guī)模龐大,其中櫛孔扇貝的筏式養(yǎng)殖占據(jù)主要比例。該養(yǎng)殖區(qū)位于河口附近,河流的輸入會(huì)導(dǎo)致近海岸呈現(xiàn)顯著的鹽度梯度,p H、溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽也發(fā)生明顯變化,從而形成動(dòng)態(tài)復(fù)雜的水環(huán)境系統(tǒng)[12]。前人對(duì)養(yǎng)殖區(qū)浮游植物群落結(jié)構(gòu)多樣性頗有研究[13-20],而對(duì)近海扇貝養(yǎng)殖區(qū)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究鮮少。2019年本研究選取養(yǎng)殖活動(dòng)頻繁的5月至10月,對(duì)該海域環(huán)境理化因子進(jìn)行監(jiān)測(cè),利用基于16S rRNA基因的Illumina Miseq高通量測(cè)序方法對(duì)其細(xì)菌群落多樣性及其在空間和時(shí)間尺度上的變化進(jìn)行分析,并探討了環(huán)境因子與菌群結(jié)構(gòu)的相互作用,以期為該水域的水產(chǎn)養(yǎng)殖及近海海域生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集時(shí)間與地點(diǎn)

本研究于2019年5至10月在青島市嶗山灣青山村近海扇貝養(yǎng)殖海域采樣,每月采集1次。采樣區(qū)(圖1)分為養(yǎng)殖密區(qū)(120°41′40″E,36°09′21″N)、養(yǎng)殖疏區(qū)(120°42′04″E,36°09′28″N)、對(duì)照區(qū)(120°42′24″E,36°09′35″N)三個(gè)區(qū),分別命名為M 區(qū)、S區(qū)和D 區(qū),在每個(gè)區(qū)域均等地選3個(gè)站位采樣(間距＞500 m)。

圖1 樣品采集地理位置示意圖Fig.1 Geographic location of sample collection

1.2 樣品采集與處理

用手持式柱狀采水器在指定點(diǎn)采取1 L表層水,在低溫(4 ℃)條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室;采用0.22μm 的濾膜負(fù)壓過濾300 m L水樣,將處理好的濾膜用液氮速凍,放-80 ℃冰箱保存。每份水樣過濾重復(fù)3次。

1.2.1 環(huán)境因子的測(cè)量

本研究采用WZB-170型便攜式濁度計(jì)測(cè)量水樣濁度,JENCO 9030M 便攜式溶氧(S)測(cè)定儀測(cè)量溶氧(Dissolved Oxygen,DO)質(zhì)量濃度和溫度(θ),556MPS 便攜式多參數(shù)水質(zhì)測(cè)量?jī)x測(cè)量鹽度,TURNER Designs Triligy實(shí)驗(yàn)室熒光儀測(cè)量葉綠素a(Chl-a)質(zhì)量濃度,其他參數(shù)在實(shí)驗(yàn)室中均用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)菌豐度

各站位取4 m L海水至凍存管中,隨后加入444μL戊二醛固定,在低溫避光的條件下帶回實(shí)驗(yàn)室,液氮處理后,-80 ℃保存。采用細(xì)胞流式儀進(jìn)樣前,取180μL 樣品和20μLSYBRTMGreenⅠnucleic acid gelstain(invitrogen,USA)染料混勻,染色完成后,上機(jī)測(cè)樣。使用低流速(14μL/min),激發(fā)電壓為SSC 450、FL1 500、FL2 510和FL3 661。

1.2.3 Illumina Miseq高通量測(cè)序

用DNeasy Powerwater Pro Kit試劑盒(QIAGEN,USA)提取DNA,用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取的DNA 質(zhì)量。分別用細(xì)菌通用引物338F-806R[21]和弧菌特異性引物V_169F-V_680R[22-23]兩對(duì)引物對(duì)DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(表1)。將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)回收產(chǎn)物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用QuantusTMFluorometer(Promega,USA)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用均值法處理環(huán)境因子的數(shù)據(jù)及細(xì)菌細(xì)胞的豐度;使用Fastp軟件[24]和FLASH 軟件[25]分別對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控和拼接,利用UPARSE 軟件根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類并剔除嵌合體[26-27]。利用RDP classifier[28]對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋。利用R 語(yǔ)言(version 3.3.1)進(jìn)行物種組成分析、環(huán)境因子與群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析及冗余分析。利用SPSS 22.0 的單因素方差分析(one-way Analysis of Variance,one-way ANOVA)進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境因子理化指標(biāo)

養(yǎng)殖環(huán)境是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一個(gè)不可忽視的部分,養(yǎng)殖用水的理化性質(zhì)是養(yǎng)殖活動(dòng)的重要保證,表2展示了嶗山灣青山村近海養(yǎng)殖區(qū)在2019年5月至10月的環(huán)境理化指標(biāo)變化,養(yǎng)殖水質(zhì)符合《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3097-1997)[29]第二類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求。

表2 2019年嶗山灣青山村扇貝養(yǎng)殖區(qū)理化性質(zhì)指標(biāo)Table 2 Physical and chemical properties of scallop culture area in Qingshan Village,Laoshan District from May to October in 2019

續(xù)表

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)菌豐度結(jié)果

從海水中細(xì)菌單細(xì)胞的集聚分布情況(圖2)所示,側(cè)向散射光(Side Scattering,SSC)與細(xì)胞的內(nèi)容物含量有關(guān),FL表示顆粒被染上的熒光的數(shù)量。通過SSC對(duì)FL1和FL3對(duì)FL1雙參數(shù)圖對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)。R1和R2分別為在不同的熒光強(qiáng)度下根據(jù)聚集情況劃分的細(xì)菌細(xì)胞門。由流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果(圖2)可知,每毫升海水的細(xì)胞數(shù)的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。養(yǎng)殖密區(qū)及疏區(qū)均在9月達(dá)到最高點(diǎn),對(duì)照區(qū)的最高點(diǎn)出現(xiàn)在8月,其最低點(diǎn)均出現(xiàn)在5月(圖3)。

圖2 細(xì)胞流式圖Fig.2 Cell flow diagram

圖3 2019年5月至10月養(yǎng)殖區(qū)海域細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量Fig.3 The number of bacterial cells in the aquaculture area from May to October in 2019

2.3 水體菌群多樣性及其對(duì)環(huán)境因子響應(yīng)

2.3.1 微生物Alpha多樣性分析

通過聚類操作,根據(jù)97%的相似度水平,對(duì)所有序列進(jìn)行OTU 劃分,青山村扇貝養(yǎng)殖區(qū)及對(duì)照區(qū)細(xì)菌的香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Weiner Index)呈現(xiàn)波動(dòng)的變化趨勢(shì),養(yǎng)殖疏區(qū)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)?；【南戕r(nóng)-威納指數(shù)均呈現(xiàn)M 型變化。2019年9月,細(xì)菌多樣性升高而弧菌多樣性降低,且細(xì)菌細(xì)胞數(shù)也達(dá)到峰值(圖4a和4b)。

圖4 2019年5月至10月水環(huán)境細(xì)菌和弧菌多樣Fig.4 The diversities of bacteria and Vibrio in water environment from May to October in 2019

2.3.2 水環(huán)境群落組成

本研究共檢測(cè)出52 個(gè)細(xì)菌門,其中存在11 個(gè)優(yōu)勢(shì)門(豐度占比大于1%),分別為變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、Patescibacteria、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Marinimicrobia_SAR406-clade、綠彎菌門(Chloroflexi)、Epsilonbacteraeota、酸桿菌門(Acidobacteria),其中變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌門(圖5)。

圖5 細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)組成Fig.5 Compostion of community structure at bacterial phylum level

在綱水平,共檢測(cè)出115個(gè)綱,其中存在13個(gè)優(yōu)勢(shì)綱(豐度占比大于1%),相對(duì)豐度較高的是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和放線菌綱(Actinobacteria)(圖6)。

圖6 細(xì)菌綱水平群落結(jié)構(gòu)組成Fig.6 Composition of community structure at bacterial class level

弧菌屬在細(xì)菌屬水平豐度中占據(jù)重要的比例(圖7),養(yǎng)殖密區(qū)在2019年6月和7月出現(xiàn)較高的豐度比例,對(duì)照區(qū)在2019年7月的豐度比例最高。

圖7 養(yǎng)殖區(qū)弧菌豐度比例分布Fig.7 Diagram of abundance proportion of Vibrio in culture area from May to October in 2019

對(duì)各區(qū)不同月份的樣品及密區(qū)、疏區(qū)和對(duì)照區(qū)的樣品進(jìn)行優(yōu)勢(shì)門的組間差異顯著性檢驗(yàn)分析,結(jié)果表明,各區(qū)樣品在不同月份Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Marinimicrobia_SAR406_clade、Chloroflexi、Acidobacteria具有差異(P＜0.05)或顯著差異(P＜0.01),而密區(qū)、疏區(qū)和對(duì)照區(qū)的樣品在門水平上微生物組成沒有顯著差異(圖8)。

圖8 組間差異顯著分析Fig.8 Analysis of significant differences between groups from May to October in 2019

2.3.3 水環(huán)境群落組成與環(huán)境因子的相關(guān)性

RDA 分析揭示了不同區(qū)域樣品中微生物組成與環(huán)境因子的相關(guān)性,采用bioenv函數(shù)檢驗(yàn)了每個(gè)環(huán)境因子的顯著性,在養(yǎng)殖密區(qū)、養(yǎng)殖疏區(qū)和對(duì)照區(qū)的RDA 分析中,第一坐標(biāo)軸和第二坐標(biāo)軸共貢獻(xiàn)解釋量分別為59.25%、47.1%和45.27%。結(jié)果表明,濁度(P=0.027)對(duì)養(yǎng)殖密區(qū)OTU 水平的物種組成和群落結(jié)構(gòu)具有顯著的影響;硝酸鹽(P=0.017)、濁度(P=0.033)對(duì)養(yǎng)殖疏區(qū)OTU 水平的物種組成和群落結(jié)構(gòu)具有顯著的影響,磷酸鹽(P=0.004)、DO(P=0.001)、p H(P=0.004)對(duì)其具有顯著的影響;DO(P=0.018)對(duì)對(duì)照區(qū)OTU 水平的物種組成和群落結(jié)構(gòu)具有顯著的影響(圖9)。

圖9 細(xì)菌OTU 水平環(huán)境因子RDA 分析Fig.9 RDA analysis on the correlation between environmental factors and bacterial OTU level

通過Spearman 相關(guān)性計(jì)算,利用求平均的方式對(duì)環(huán)境因子和物種層級(jí)進(jìn)行聚類,選取門水平上豐度為前11位的物種進(jìn)行分析,相關(guān)性Heatmap圖和環(huán)境因子聚類樹分析結(jié)果表明:

1)在門水平上,養(yǎng)殖密區(qū)的細(xì)菌群落物種與環(huán)境因子均具有不同程度的相關(guān)性,其中,擬桿菌門與鹽度(Spearman相關(guān)系數(shù)r=-0.776,P＜0.001)呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;綠彎菌門與濁度(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.744,P＜0.001)呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系。養(yǎng)殖疏區(qū)的放線菌門與濁度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.808,P＜0.001);Marinimicrobia_SAR406_clade與鹽度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.856,P＜0.001),厚壁菌門分別與DIN(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.760,P＜0.001)和硝酸鹽(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.751,P＜0.001)呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系(圖10和圖11)。

圖10 養(yǎng)殖密區(qū)細(xì)菌門水平環(huán)境因子相關(guān)性Heatmap圖Fig.10 Heatmap diagram of correlation between bacterial phylum level and environmental factors in intensive culture area

圖11 養(yǎng)殖疏區(qū)細(xì)菌門水平環(huán)境因子相關(guān)性Heatmap圖Fig.11 Heatmap diagram of correlation between bacterial phylum level and environmental factors in sparse culture area

2)在門水平上,對(duì)照區(qū)的物種與環(huán)境因子具有不同程度的相關(guān)性,與養(yǎng)殖區(qū)不同,其中,酸桿菌門和厚壁菌門與葉綠素分別呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=-0.612,P＜0.01)和極顯著正相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.736,P=0.001),Patescibacteria與溫度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.650,P＜0.01),綠彎菌門和擬桿菌門分別與濁度具有顯著正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.642,P＜0.01)和極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=-0.722,P＜0.001),放線菌門與溶解氧呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.607,P＜0.01)(圖12)。

圖12 對(duì)照區(qū)細(xì)菌門水平環(huán)境因子相關(guān)性Heatmap圖Fig.12 Heatmap diagram of correlation between bacterial phylum level and environmental factors in control area

3 討論

3.1 海水水樣細(xì)菌群落多樣性

通過Illumina Miseq高通量測(cè)序的方法對(duì)養(yǎng)殖區(qū)海水水樣進(jìn)行門、綱水平的群落結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明,在水樣樣品中共檢測(cè)到52個(gè)門、115個(gè)綱,香農(nóng)-威納指數(shù)為4.762～5.539,Sobs指數(shù)為676～2 140。2019年8月和9月的細(xì)菌多樣性指數(shù)較高,香濃指數(shù)總體上隨溫度的變化而變化,但2019年7月的養(yǎng)殖密區(qū)和對(duì)照區(qū)的多樣性指數(shù)相對(duì)低于趨勢(shì)線,這可能是由在該月份取樣時(shí)出現(xiàn)連續(xù)的雷雨天氣所致。根據(jù)圖5可知,不同區(qū)域不同月份的樣品中的優(yōu)勢(shì)群落均為變形菌門(Proteobacteria),占總?cè)郝?0%以上,主要包括α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria。其他的優(yōu)勢(shì)菌門排列依次是藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、Patescibacteria、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Marinimicrobia、綠彎菌門(Chloroflexi)、Epsilonbacteraeota、酸桿菌門(Acidobacteria)。檢測(cè)結(jié)果與近年來的研究結(jié)果相似,楊銘玉等[30]對(duì)東海舟山漁場(chǎng)近岸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析得出,該養(yǎng)殖區(qū)主要的細(xì)菌群落類群為變形菌(62.99%)、擬桿菌群(10.23%)、藍(lán)藻細(xì)菌(9.69%)、放線菌門(8.94%)。遼東灣沿海的仿刺參、對(duì)蝦混養(yǎng)養(yǎng)殖水體中主要是變形菌門(51.5%),其次是放線菌門(23.6%)、擬桿菌門(11.3%)、厚壁菌門(9.1%)[31]。王飛飛[32]利用高通量測(cè)序、分子生物學(xué)方法等手段對(duì)黃海北部海域貝類養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行細(xì)菌群落分析,也證明養(yǎng)殖區(qū)的海水中變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

在綱水平中,γ-變形菌綱在群落中占據(jù)了主導(dǎo)地位,且養(yǎng)殖區(qū)豐度占比高于對(duì)照區(qū),其中包含許多重要的病原菌,如沙門氏菌屬(Salmonella)、耶爾辛氏菌屬(Yersinia)、弧菌屬(Vibrio),這些菌群會(huì)引起不同程度的生物感染,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致大面積流行病的爆發(fā)。變形菌門中σ-變形菌綱的比例相對(duì)較小,具有硫氧化、固碳、C1利用和異養(yǎng)能力[33],在2019年8、9和10月份活動(dòng)較為頻繁。SAR406在2019年9和10月份占比較高,該菌門參與厭氧氨氧化與磷循環(huán)的過程[34-35],且能夠影響無機(jī)碳的固定[36]。

在屬水平,弧菌屬是我們重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象,研究發(fā)現(xiàn)2019年6月的弧菌屬比例在養(yǎng)殖區(qū)處在最高點(diǎn),弧菌多樣性也處于較高值,說明單一弧菌種的數(shù)量較低,且細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量也較低,因此患病的幾率大幅降低。2019年7月弧菌的相對(duì)比例較高,細(xì)菌總數(shù)下降,弧菌多樣性降低,因此單一弧菌種數(shù)量增加。2019年7月、8月和9月處于高溫時(shí)期,適宜弧菌的快速繁殖,同時(shí)會(huì)降低扇貝的活性。因此該時(shí)期易爆發(fā)弧菌病。2019年9月份雖然弧菌屬占比不高,但是細(xì)胞總數(shù)處于峰值,且細(xì)菌多樣性增大而弧菌多樣性減少。因此2019年9月相較于其他高溫月份(2019年7月和8月)更具有爆發(fā)弧菌病的條件。鄧歡等[37]也曾報(bào)道過在2019年9月份大連爆發(fā)了扇貝弧菌病,造成了扇貝群體突發(fā)性死亡。

對(duì)各區(qū)不同月份的樣品及密、疏、對(duì)照區(qū)的樣品進(jìn)行優(yōu)勢(shì)門的組間差異顯著性檢驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)海水中菌群優(yōu)勢(shì)門的影響不大,組間沒有明顯差異,表明從養(yǎng)殖區(qū)到海區(qū),浮游細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)門季節(jié)變化大于空間尺度差異。Lü 等[38]研究表明黃河三角洲演替潮灘的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在季節(jié)性差異。而MA等[39]認(rèn)為黃海沿岸由于河口的存在,從河流到深海,浮游細(xì)菌群落的空間變化大于季節(jié)尺度。

3.2 環(huán)境因子相關(guān)性分析

環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響一直是學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)。不同的地理位置、環(huán)境因子與海域浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成之間會(huì)進(jìn)行相互作用。在黃海沿岸,鹽度是導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)向河流、河口兩部分空間分化的主要因素[39]。而在黃河三角洲附近,溫度和亞硝酸鹽構(gòu)成菌群結(jié)構(gòu)季節(jié)變化的主要驅(qū)動(dòng)力[38]。王彩霞等[9]對(duì)渤海三灣環(huán)境因子與菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行Heatmap相關(guān)性分析得出,溫度、磷酸鹽、硝酸鹽和銨鹽與門水平上物種分布有顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01),而溶解氧、緯度和鹽度與門水平上物種組成有明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。養(yǎng)殖活動(dòng)是否會(huì)影響環(huán)境因子與近海細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相互作用,大家鮮少關(guān)注。通過對(duì)環(huán)境因子與菌群結(jié)構(gòu)的Heatmap相關(guān)性分析,我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照區(qū)與養(yǎng)殖區(qū)所呈現(xiàn)的相關(guān)性結(jié)果之間還是有明顯的差異。在門水平上,養(yǎng)殖區(qū)與對(duì)照區(qū)的相同的菌群所受到的不同環(huán)境因子影響,不但表現(xiàn)在相關(guān)性的程度上,甚至還改變了其作用方向,例如疣微菌門,在養(yǎng)密區(qū)與硝酸鹽呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,而在對(duì)照區(qū)與其呈現(xiàn)微弱的正相關(guān)關(guān)系。綠彎菌門在養(yǎng)殖密區(qū)與溫度(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.636,P＜0.01)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系,養(yǎng)殖疏區(qū)與溫度(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.678,P＜0.01)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系,而在對(duì)照區(qū)綠彎菌門與溫度(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.555,P＜0.05)的相關(guān)性區(qū)域性降低。綠彎菌門在海洋生態(tài)系統(tǒng)中參與光合作用的過程,利用3-羥基丙酸途徑來固定二氧化碳,養(yǎng)殖區(qū)中的綠彎菌門更易受溫度升高而增加,加強(qiáng)光合作用,釋放更多的溶解氧,而扇貝是高耗氧生物,集聚性養(yǎng)殖會(huì)消耗大量溶解氧,綠灣菌門在養(yǎng)殖區(qū)與對(duì)照區(qū)中的相關(guān)性差異結(jié)果也證實(shí)養(yǎng)殖活動(dòng)會(huì)影響環(huán)境因子與菌落結(jié)構(gòu)的相關(guān)程度,這與先前的研究結(jié)果一致[10]。研究近海養(yǎng)殖區(qū)海域微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性和環(huán)境因子相關(guān)性為保護(hù)近海養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展以及扇貝健康養(yǎng)殖提供了更好的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文利用細(xì)胞流式儀和高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)青島嶗山灣近海扇貝養(yǎng)殖水樣進(jìn)行多層次的分析,集中分析扇貝高發(fā)病月份的細(xì)菌群落變化情況,并綜合考慮環(huán)境因子的變化,對(duì)樣品菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子相關(guān)性進(jìn)行了分析,得到的結(jié)論如下:

1)青島嶗山灣近海扇貝養(yǎng)殖水樣中的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門,其中,γ-變形菌綱在群落菌門中占據(jù)主導(dǎo)地位,養(yǎng)殖區(qū)γ-變形菌綱豐度占比高于對(duì)照區(qū),由于γ-變形菌綱中含有多種致病菌,豐度占比增長(zhǎng)的同時(shí)也增加了養(yǎng)殖區(qū)扇貝感染流行病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。9月處于高溫時(shí)期,細(xì)菌總數(shù)增大,養(yǎng)殖區(qū)的細(xì)胞多樣性上升且弧菌多樣性指數(shù)降低,使得扇貝在9月爆發(fā)弧菌病的可能性驟增。

2)在該近海區(qū),養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)海水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響主要以季節(jié)變化為主,在門水平上,濁度對(duì)養(yǎng)殖密區(qū)的菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響,DO 對(duì)對(duì)照區(qū)的菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響。

3)養(yǎng)殖活動(dòng)不僅影響了環(huán)境因子與菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)性的程度,甚至還會(huì)改變其相互作用的方向。

研究結(jié)果表明,青島嶗山灣近海扇貝養(yǎng)殖活動(dòng)影響了正常的近海菌落的結(jié)構(gòu)分布,集聚式養(yǎng)殖不同程度上增加了某些病原菌的豐度,增加了該區(qū)近海生物疾病爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),因此在近海養(yǎng)殖活動(dòng)中要做到合理布局、科學(xué)喂養(yǎng)、適當(dāng)降低養(yǎng)殖密度,這些措施對(duì)降低養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)菌落結(jié)構(gòu)多樣性的影響具有重要意義。本文的研究結(jié)果可為實(shí)現(xiàn)近?？茖W(xué)養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。