劉嘉華，王夢(mèng)杰，張龍飛，薛才華，武 強(qiáng)，武鴻蓮，王 碩，吳 華

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

肝癌是全球六大高發(fā)癌癥之一，其發(fā)病癥狀隱匿，病程較短，嚴(yán)重威脅著人類的健康。天然植物提取物大多具有藥用價(jià)值，從天然植物提取物中尋找無毒、綠色、作用強(qiáng)的抗癌藥物已成為目前的研究熱點(diǎn)。黑果枸杞屬于茄科、枸杞屬的灌木，是我國青海、寧夏、甘肅、新疆等地特有的藥用植物品種之一，是提取花青素的最佳原材料，素有“花青素之王”的美稱[1]。已有研究表明，黑果枸杞花青素(Anthocyanins fromLyciumruthenicumMurr，ALR)具有降血糖、降血脂和抗氧化、抗腫瘤及提高免疫能力等特性，且其抗腫瘤作用可能是通過促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等方式實(shí)現(xiàn)[2-3]。

細(xì)胞凋亡與自噬是引發(fā)細(xì)胞程序性死亡的兩種方式，二者可被相同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)或相同的刺激因素激活，在正常的生理或病理狀態(tài)下發(fā)揮重要作用。凋亡與自噬之間可能存在的關(guān)系為相互促進(jìn)、相互拮抗、相互獨(dú)立等[4-5]。研究并利用這些交互作用，對(duì)于探究腫瘤的發(fā)生機(jī)制以及腫瘤疾病的治療方法具有重要作用。有研究證實(shí)，花青素可通過活化自噬信號(hào)通路，抑制大鼠軟骨細(xì)胞凋亡[6]。但目前關(guān)于ALR對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡與自噬相互作用的研究鮮見報(bào)道?；诖耍驹囼?yàn)以黑果枸杞花青素和人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，通過檢測(cè)ALR結(jié)合自噬抑制劑3-MA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，及ALR結(jié)合JAK2/STST3凋亡通路抑制劑AG490對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬的影響，探究二者之間的相互關(guān)系，以期為ALR的深度開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人肝癌HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

ALR購自青海金麥杞生物科技有限公司(花青素64.4%，蛋白6%，糖1.32%，氨基酸3.56%，灰分0.6%，其他24.12%)[7]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑配制

(1)ALR溶液。稱取10 mg ALR溶于50 mL DMEM培養(yǎng)基，配制成200 μg/mL的溶液于4 ℃冰箱避光保存。

(2)3-MA自噬抑制劑。稱取20 mg 3-MA溶于3.36 mL PBS緩沖液，配制成20 mmoL的溶液，試驗(yàn)濃度為5 mmoL。

(3)AG490凋亡通路抑制劑。稱取10 mg AG490溶于3.398 mL DMEM培養(yǎng)基，配制成10 mmoL的溶液，試驗(yàn)濃度為10 mmoL。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，將人肝癌HepG2細(xì)胞放置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。收集0.1 mL對(duì)數(shù)期細(xì)胞懸液于1.5 mL離心管，加入0.8 mL PBS溶液與0.1 mL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，搖勻并在室溫條件下放置2～3 min,用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.3 分組及處理 細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋到1×106個(gè)/孔，取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入500 μL的細(xì)胞稀釋液，然后按分組分別加入ALR母液、AG490母液，再加入DMEM培養(yǎng)液調(diào)整至相應(yīng)濃度,每孔終體積為2 mL，每組3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。按照青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)課題組前期試驗(yàn)篩選出的ALR最佳增殖濃度(25 μg/mL)分組：①3-MA抑制劑試驗(yàn)組：對(duì)照組和ALR組、3-MA組、ALR+3-MA組。②AG490抑制劑試驗(yàn)組：對(duì)照組和ALR組、AG490組、ALR組+AG490組。

1.2.4 人肝癌HepG2細(xì)胞核形態(tài)變化檢測(cè) 以每孔4×104個(gè)細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板，按對(duì)照組和ALR組、3-MA組、ALR+3-MA組進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞用1% PBS洗滌2次并用4%甲醛固定，加入Hoechst染液，室溫孵育30 min后再用1% PBS洗滌2次，然后使用倒置熒光顯微鏡觀察。使用Nikon Eclipse Ti熒光顯微鏡捕獲顯微照片，并使用DS-Qi1黑白相機(jī)拍照。

1.2.5 人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 以每孔5×106個(gè)細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板，按對(duì)照組和ALR組、3-MA組、ALR+3-MA組進(jìn)行培養(yǎng)。處理24 h后，離心并用PBS洗滌兩次，按試劑盒說明書進(jìn)行AnnexinV/PI染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 凋亡及自噬相關(guān)因子的mRNA表達(dá)檢測(cè) 用TRNzol法分別提取各組細(xì)胞總RNA,并進(jìn)行RNA完整性及濃度檢測(cè)，隨后按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書要求將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后采用SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑盒進(jìn)行定量PCR分析。qRT-PCR引物序列見表1。

1.2.7 凋亡及自噬相關(guān)因子的蛋白表達(dá)檢測(cè) 分別提取各組細(xì)胞總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。使用SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜及封閉，配制及加入一抗(p-JAK2抗體、p-STAT3抗體、LC3-Ⅱ抗體及GADPH抗體)，4 ℃孵育過夜，加入山羊抗IgG二抗，室溫下孵育1 h后洗膜，在暗室顯影，并定影。采用Image J對(duì)條帶吸光度(A)值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS 21.0)分析，應(yīng)用one-way ANOVA選擇Duncan′s法進(jìn)行多重比較，采用繪圖軟件(GraphPad Prism8.0)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響

ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響情況見圖1。

圖1 ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響

圖1顯示，對(duì)照組細(xì)胞核核膜完整，染色均勻，呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色熒光；與對(duì)照組相比，ALR組、3-MA組及ALR+3-MA組細(xì)胞核均呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光，說明細(xì)胞發(fā)生凋亡，且ALR+3-MA組細(xì)胞凋亡特征最明顯。說明抑制自噬可促進(jìn)ALR誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

2.2 ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率的影響見圖2。由圖2可知，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為10.52%，ALR組凋亡率為18.17%，3-MA組凋亡率為18.83%，ALR+3-MA組凋亡率為22.15%。與對(duì)照組相比，ALR組、3-MA組及ALR+3-MA組細(xì)胞凋亡率明顯提高。與3-MA組相比，ALR+3-MA組細(xì)胞凋亡率明顯提高。說明抑制自噬可促進(jìn)ALR誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

圖2 ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響見圖3。由圖3可知，與對(duì)照組相比，ALR組JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)被顯著抑制(P<0.05)；3-MA組JAK2的mRNA表達(dá)被顯著抑制(P<0.05)，STAT3的mRNA表達(dá)被極顯著抑制(P<0.01)；ALR+3-MA組JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)被極顯著抑制(P<0.01)。與3-MA組相比，ALR+3-MA組JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)被顯著抑制(P<0.05)。說明抑制細(xì)胞自噬的同時(shí)ALR可通過抑制JAK2/STAT3凋亡通路中JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖3 JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平圖

2.4 ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

ALR結(jié)合3-MA對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見圖4和圖5。由圖4和圖5可知，與對(duì)照組相比，ALR組、3-MA組、ALR+3-MA組p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)被極顯著抑制(P<0.01)。與3-MA組相比，ALR+3-MA組p-JAK2的蛋白表達(dá)被極顯著抑制(P<0.01)，p-STAT3的蛋白表達(dá)被顯著抑制(P<0.05)。說明抑制細(xì)胞自噬的同時(shí)ALR可通過抑制p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖4 p-JAK2和p-STAT3蛋白條帶圖

圖5 p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平圖

2.5 ALR結(jié)合AG490對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

ALR結(jié)合AG490對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響見圖6。由圖6可知，與對(duì)照組相比，ALR組、AG490組、ALR+AG490組LC3的mRNA表達(dá)被極顯著促進(jìn)(P<0.01)。與AG490組相比，ALR+AG490組LC3的mRNA表達(dá)被顯著促進(jìn)(P<0.05)。說明促進(jìn)細(xì)胞凋亡的同時(shí)ALR可通過促進(jìn)LC3的mRNA表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞自噬。

圖6 LC3 mRNA表達(dá)水平圖

2.6 ALR結(jié)合AG490對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

ALR結(jié)合AG490對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見圖7和圖8。由圖7和圖8可知，與對(duì)照組相比，ALR組、ALR+AG490組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)被極顯著促進(jìn)(P<0.01)；AG490組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)被顯著促進(jìn)(P<0.05)。與AG490組相比，ALR+AG490組LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)被極顯著促進(jìn)(P<0.01)。說明促進(jìn)細(xì)胞凋亡的同時(shí)ALR可通過促進(jìn)LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞自噬。

圖7 LC3-Ⅱ蛋白條帶圖

圖8 LC3-Ⅱ 蛋白表達(dá)水平圖

3 討論與結(jié)論

3-MA是自噬抑制劑，可通過抑制Ⅲ型PI3K及干擾自噬隔離膜的形成抑制自噬。研究已證實(shí)，3-MA可能通過經(jīng)抑制饑餓處理的腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。在某些腫瘤的治療中，3-MA與化療藥物合用亦能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。JAK2/STAT3信號(hào)通路是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖與凋亡的重要通路，癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展與該通路的異常激活密切相關(guān)。膜受體被激活后，引起JAK2家族蛋白酶激化，促進(jìn)p-JAK2因子與p-STAT3因子表達(dá)，最終抑制癌細(xì)胞凋亡。Wang等[10]認(rèn)為，自噬通過激活JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ALR結(jié)合3-MA可促進(jìn)細(xì)胞核凋亡，提高細(xì)胞凋亡率，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路中凋亡因子p-JAK2、p-STAT3的mRNA及蛋白表達(dá)。說明抑制自噬可促進(jìn)ALR誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

AG490是JAK2/STAT3信號(hào)通路的特異性抑制劑，可通過阻斷JAK2特異位點(diǎn)上絲氨酸或酪氨酸的磷酸化而阻斷下游STAT3的磷酸化，起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[11-12]。有研究表明，阻斷JAK2后的癌細(xì)胞可通過激活自噬因子產(chǎn)生自噬[13]。LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，主要參與自噬體的形成。正常情況下LC3以I型的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)自噬激活時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)化為LC3-II。LC3-II被認(rèn)為是自噬標(biāo)記物，在一定程度上反映了自噬體的數(shù)量[14-15]。余揚(yáng)[16]證明AG490作用人惡性黑素瘤A357細(xì)胞72 h后，可促進(jìn)LC3-II的蛋白表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AG490可促進(jìn)LC3的mRNA及LC3-II的蛋白表達(dá)，說明AG490可促進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬。與AG490組相比，ALR結(jié)合AG490組可促進(jìn)自噬因子LC3的mRNA及LC3-II的蛋白表達(dá)。說明促進(jìn)凋亡可增強(qiáng)ALR誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞自噬。

綜上所述，ALR可誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，抑制自噬可促進(jìn)ALR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)凋亡可增強(qiáng)ALR誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。此結(jié)論可為ALR的深度開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。