黃彩霞，高 卓，李 浩，王志慧，劉炳炎，潘宇睦，蘆光新

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)集約化的快速發(fā)展，每年產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物[1]，這些廢棄物中產(chǎn)量最大的是畜禽糞便及農(nóng)作物秸稈[2]。高溫好氧堆肥是畜禽糞便無害化處理和肥料化利用的重要途徑[3]，已被廣泛應(yīng)用在固體廢棄物的處理中[4-5]。我國油菜種植面積大，秸稈資源豐富，然而很大一部分秸稈未被合理利用[6]。油菜秸稈C/N較高，不適宜單獨(dú)堆肥，與豬糞混合堆肥,加入調(diào)理劑調(diào)節(jié)為適合堆肥發(fā)酵的C/N[7]。C/N對堆肥中微生物的正?；顒雍陀袡C(jī)肥的品質(zhì)有重要影響，因此,合適的C/N對堆肥發(fā)酵過程的進(jìn)行有重要的意義[8-9]。

堆肥過程的本質(zhì)是一種由群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的微生物相互作用而形成的復(fù)雜、動態(tài)的生化過程，其中微生物對基質(zhì)的轉(zhuǎn)化和分解發(fā)揮著重要作用[10-11]。因此，研究微生物群落組成對了解堆肥過程至關(guān)重要。在堆肥過程中，細(xì)菌是分解有機(jī)物和產(chǎn)熱的主要微生物種群，也是整個堆肥過程中最普遍、數(shù)量最多的微生物。有研究者認(rèn)為，堆肥過程中不同階段細(xì)菌的種類和數(shù)量相差很大，且不同的細(xì)菌主導(dǎo)不同的階段[2,12]。李昌寧等[13]和王建才等[14]利用高通量測序技術(shù)研究了豬糞與秸稈堆肥中細(xì)菌群落的變化特征，發(fā)現(xiàn)不同溫度階段細(xì)菌的相對豐度和優(yōu)勢門、屬都不同。張喆[15]從土和牛糞樣品中以涂布平板分離法篩選并鑒定出耐冷細(xì)菌，能快速啟動堆肥升溫?？梢?，用高通量測序技術(shù)研究堆肥過程中細(xì)菌群落變化特征是較為常見的方法，另外，在堆肥過程可培養(yǎng)細(xì)菌的研究中對功能菌篩選鑒定的研究較多，對整個堆肥發(fā)酵過程中全部可培養(yǎng)細(xì)菌的研究鮮少報道，特別是針對高寒地區(qū)自然堆肥發(fā)酵過程中全部可培養(yǎng)細(xì)菌菌落特征變化的研究甚少。鑒于此，本研究以高寒地區(qū)的油菜秸稈與豬糞為主要原料，研究其在自然堆制過程中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量和種類變化，旨在為當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物秸稈的高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油菜秸稈由青海省互助土族自治縣昱青投資開發(fā)有限公司提供，新鮮豬糞由青海泰和宛生物有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基配制

LB培養(yǎng)基制備：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏粉3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃、0.1MPa滅菌30 min，備用。

1.3 堆肥方法

堆肥試驗(yàn)在青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行，采用戶外堆制方式，堆體為底部直徑1 m、高0.7 m的圓錐形。油菜秸稈切成3～5 cm的碎片，將豬糞與秸稈按3∶1的質(zhì)量混合，用麩皮調(diào)節(jié)C/N為25%左右，含水量控制在50%～70%。堆肥前，先在地面上鋪一層塑料，將豬糞、秸稈混勻，然后成堆，再用塑料布遮雨，便于翻堆。

1.4 測溫方法

堆肥時間為2020年6月1日至7月20日。每天上午9：00、下午16：00用TP300溫度計從堆體中上部分(堆體距地面垂直距離60 cm左右處)的不同方向測溫5次，取上午和下午溫度的平均值作為當(dāng)日的堆體溫度。試驗(yàn)中溫度可劃分為四個階段：由堆肥初期的常溫上升至50 ℃為升溫階段，溫度持續(xù)在50～70 ℃為高溫階段，隨后從高溫逐漸下降至40 ℃為降溫階段，溫度繼續(xù)下降至穩(wěn)定為腐熟階段。

1.5 采樣時間及方法

自堆肥開始后的第1、4、8、12、17、21、25、29、34、38、42、51天進(jìn)行取樣，方法如下：在離地面40～50 cm處，從3個方向的不同縱切面上進(jìn)行取樣，取樣深度為20～30 cm。樣品混勻后分成2份：1份用于細(xì)菌數(shù)量測定(樣品暫時保存于4 ℃冰箱，在24 h內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn))，另1份用于測定其他指標(biāo)。

1.6 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離及純化

采用稀釋平板涂布法進(jìn)行細(xì)菌的分離。具體方法為取1 g新鮮樣品放入裝有99 mL滅菌水的三角瓶(已滅菌)中，封口。在25 ℃、120 r/min條件下振蕩30 min，用已滅菌的紗布過濾得到濾液，并依次稀釋至10-6，取10-4、10-5、10-6均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌落形態(tài)初步統(tǒng)計固體LB培養(yǎng)基中所有細(xì)菌的菌落數(shù)，乘以水樣的稀釋倍數(shù)即為細(xì)菌總數(shù)。采用平板劃線分離法在固體LB培養(yǎng)基上將不同的菌落進(jìn)行純化，純化后的細(xì)菌接種到斜面固體LB培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)，保存。優(yōu)勢菌按照農(nóng)澤梅等[16]的方法進(jìn)行確定。

1.7 可培養(yǎng)細(xì)菌分子鑒定

(1)菌株基因組DNA的提取。用接種環(huán)蘸取經(jīng)純化的菌落放入液體LB培養(yǎng)基中，35 ℃、120 r/min條件下振蕩，至培養(yǎng)基由澄清變?yōu)闇啙幔苽涞木河糜谔崛〖?xì)菌的DNA。采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(編號：B518255-0050)提取菌株DNA，用16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：模板DNA 1 μL，上、下游引物各2 μL(濃度10 μmol/L)，2X SanTaq PCR Mix 25 μL，ddH2O 20 μL；反應(yīng)程序：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，57 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃、15 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

(2)細(xì)菌16S rDNA序列分析。將測序所得的序列用Contig Express軟件做序列拼接，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對，下載同源性高的序列及模式菌株的序列，選用MEGA 7.0軟件上的Clustal W功能進(jìn)行序列比對，用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)為1 000。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 26進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用單因素ANOVA檢驗(yàn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆制過程溫度的變化

由圖1可知，隨著堆肥時間的延長，堆體溫度整體趨勢表現(xiàn)為先升高后不斷下降并趨于穩(wěn)定。1～2 d為升溫階段，該階段隨著堆肥時間延長，溫度不斷上升，第2天溫度升至51.5 ℃。3～27 d為高溫階段，其中3～10 d為55 ℃以上的高溫持續(xù)期；在發(fā)酵第8天溫度達(dá)到最高，為68.0 ℃；第11天溫度降低至55 ℃以下；第16天溫度又升高至55 ℃以上，并維持了11 d，但此階段最高溫度(66.4 ℃)低于第8天的溫度(68.0 ℃)。28～40 d為降溫階段，溫度降低至55 ℃以下，在40～55 ℃維持了12 d。41～47 d為腐熟階段，溫度降低至40 ℃以下，并逐漸穩(wěn)定。在豬糞與秸稈的自然堆制發(fā)酵過程中，堆肥溫度達(dá)50～55 ℃超過5 d，符合GB 7959—2012《糞便無害化衛(wèi)生要求》[17]。

圖1 堆制過程中溫度的變化

2.2 堆制過程可培養(yǎng)細(xì)菌物種數(shù)和菌落數(shù)的變化

由表1可看出，隨著堆肥時間的延長，細(xì)菌物種數(shù)先減少后增加再減少并趨于穩(wěn)定，細(xì)菌菌落數(shù)先增加后逐漸減少。升溫階段中，堆肥第1天的樣品中細(xì)菌物種數(shù)11種、菌落數(shù)6.30×107CFU/g。高溫階段中，第4天細(xì)菌菌落數(shù)迅速升高，為23.16×107CFU/g，且顯著高于其他時間段(P<0.05)，之后堆體中細(xì)菌菌落數(shù)逐漸減少(第12天除外)。降溫階段和腐熟階段中，隨著堆肥時間的延長，細(xì)菌菌落數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定，但在第51天細(xì)菌菌落數(shù)增加，為2.08×107CFU/g。整個堆肥過程中，第1天和第8天細(xì)菌物種數(shù)最多，第4天細(xì)菌菌落數(shù)最多。第8天后，隨著堆肥時間的延長，物種數(shù)逐漸減少并趨于穩(wěn)定。由此可知，隨著堆肥時間及溫度的變化，堆體細(xì)菌菌落數(shù)和物種數(shù)逐漸減少。

表1 堆制過程中細(xì)菌物種數(shù)和細(xì)菌菌落數(shù)

2.3 堆制過程可培養(yǎng)細(xì)菌的序列分析

在堆體發(fā)酵過程中，共篩出細(xì)菌菌株30株，有9株菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果無法用于測序和鑒定微生物所屬種類，因此對21株細(xì)菌進(jìn)行了測序。菌株的序列分析結(jié)果如表2所示，可以看出除菌株DF200828和DF200104的相似度低于98%外，其余菌株與參比菌株的相似度和完整性高達(dá)98%及以上。

表2 菌株BLAST結(jié)果

2.4 堆制過程可培養(yǎng)細(xì)菌的群落特征分析

在堆體發(fā)酵過程中，共篩出細(xì)菌菌株30株，分離頻率高于20%的菌株如表3所示，可以看出分離頻率較高(50%及以上)和相對多度較高(10%以上)的菌株均是Stenotrophomonassp.、Bacillusvelezensis、Salmonellaenterica，其中Bacillusvelezensis的相對多度占42.31%，是所有可培養(yǎng)細(xì)菌中的最大優(yōu)勢菌；Stenotrophomonassp.為第二大優(yōu)勢菌，占20.76 %;Salmonellaenterica為第三大優(yōu)勢菌，占13.84%；其余菌株均為非優(yōu)勢菌。

表3 堆肥中細(xì)菌的分離頻率及相對多度

2.5 堆制過程優(yōu)勢菌菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色鑒定

在油菜秸稈與豬糞自然堆肥發(fā)酵過程中，共篩出可培養(yǎng)細(xì)菌菌株30株，其中編號為DF200114、DF200102、DF200107的3株菌為可培養(yǎng)細(xì)菌中的優(yōu)勢菌。DF200114的菌株菌落細(xì)小，呈土黃色，較透明，有光澤，易于培養(yǎng)基脫離，革蘭氏染色為陰性的桿狀細(xì)菌(圖2a)；DF200102的菌株菌落光滑、細(xì)小，稍透明，呈淺黃色，較濕潤，易挑起，革蘭氏染色為陽性的桿狀細(xì)菌(圖2b)；DF200107的菌株菌落邊緣稍透明，較濕潤，淡黃色，革蘭氏染色為陰性的桿狀細(xì)菌(圖2c)。

圖2 優(yōu)勢細(xì)菌菌株菌落形態(tài)特征照片和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(×1 000)

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析

對測序得到的21個菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，從圖3可以看出，這21個菌株隸屬于8個屬，分別為Bacillus、Lysinibacillus、Sphingobacterium、Comamonas、Stenotrophomonas、Acinetobacter、Salmonella、Escherichia。本研究中編號為DF200523的菌株與Genbank中編號為Bacillussp.strain 201705CJKOP-15的菌株單獨(dú)聚為1枝，兩者的親緣關(guān)系非常近，支持率達(dá)100%，初步鑒定為芽孢桿菌屬；DF200827、DF201033、DF201036也鑒定為芽孢桿菌屬。其中，DF200114鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，DF201035為解淀粉芽孢桿菌，DF200312為枯草芽孢桿菌，DF200418、DF200524為副地衣芽孢桿菌。DF200217鑒定為克氏單胞菌，DF200519為不動桿菌，DF200107為傷寒沙門氏菌。DF200104、DF200105、DF200115鑒定為大腸桿菌屬。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

堆肥過程是一個由微生物主導(dǎo)的生物學(xué)過程。在堆肥發(fā)酵過程中，堆體溫度的上升是微生物代謝產(chǎn)熱積累的結(jié)果，反映了微生物代謝強(qiáng)度和堆肥物質(zhì)轉(zhuǎn)化速度[18]，細(xì)菌是整個堆肥過程中最普遍、數(shù)量最多的微生物。本研究在高寒地區(qū)油菜秸稈與豬糞自然堆肥發(fā)酵過程中得出，發(fā)酵初期可培養(yǎng)細(xì)菌物種數(shù)有11種、菌落數(shù)為6.30×107CFU/g，之后溫度由第2天的51.5 ℃升高到第4天的66.1 ℃，可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)迅速增加，這與王瑤等[19]研究發(fā)現(xiàn)在豬糞堆肥試驗(yàn)中堆體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)隨著堆體溫度升高而迅速增加的結(jié)果一致。升溫階段中嗜溫性微生物利用可溶性和易降解性有機(jī)物作為營養(yǎng)和能量來源，迅速增殖；高溫時，隨著堆肥時間延長，溫度不斷升高，糞便中的大多數(shù)病原微生物被殺滅，堆體中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)下降明顯；第28天后，堆肥進(jìn)入降溫期，溫度逐漸降低并趨于穩(wěn)定，細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)基本保持穩(wěn)定，可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)也逐漸趨于穩(wěn)定。這與王瑤等[19]在豬糞堆肥研究中發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)隨著堆肥時間延長和溫度變化先增加后減少的結(jié)果一致；與劉有勝等[20]在城市餐廚垃圾堆肥研究中發(fā)現(xiàn)堆肥升溫期細(xì)菌種群豐富，高溫期減少，降溫期基本保持穩(wěn)定的結(jié)果一致。在整個自然堆肥發(fā)酵過程中，可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落數(shù)與溫度有相關(guān)性，可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)隨著溫度的升高而增加，隨著溫度的降低而減少，這與敖靜等[21]在雞糞堆肥研究中發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)的變化趨勢與堆體溫度變化趨勢相近的研究結(jié)果一致。由此可見，在高寒地區(qū)自然堆肥發(fā)酵過程中，可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)與堆體溫度之間的相關(guān)關(guān)系和其他地區(qū)相一致。

本文在油菜秸稈與豬糞自然堆肥過程中得到，芽孢桿菌屬的菌株優(yōu)勢度最高，這與李敬波[22]在大連地區(qū)牛糞堆肥試驗(yàn)中得出的研究結(jié)果相一致。芽孢桿菌能夠生成很厚的孢子壁，可以抵抗高溫，極易成為中高溫階段的優(yōu)勢菌。本研究中芽孢桿菌屬的貝萊斯芽孢桿菌的優(yōu)勢度最高，達(dá)到了42.31%。李玥等[23]從雞糞堆肥中篩選出了貝萊斯芽孢桿菌，李曉宇等[24]在大連地區(qū)從牛糞、玉米秸稈和牛屠宰廢棄物的堆肥中也篩選出此菌，本研究也表明貝萊斯芽孢桿菌容易從高寒地區(qū)堆肥中分離得到。此外，寡養(yǎng)單胞菌屬優(yōu)勢度也較高，相對多度達(dá)到了20.76%，目前，此菌從植物根際、污水、污泥等環(huán)境中分離出得較多，從豬糞堆肥中篩選出的還未見報道。

綜上可知，在高寒地區(qū)油菜秸稈與豬糞自然堆肥過程中，隨著溫度的升高，可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)增加；在降溫階段，可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)減少，物種數(shù)也減少并趨于穩(wěn)定。同時，共分離篩選出可培養(yǎng)細(xì)菌菌株30株，對21株菌株進(jìn)行鑒定，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示此21株菌株隸屬于8個屬，其中菌株Bacillusvelezensis、Stenotrophomonassp.、Salmonellaenterica為堆肥發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌。