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阿里牦牛經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)遺傳標(biāo)記基因型頻率研究

2022-06-06 13:32:48洛桑頓珠鮮莉莉平措占堆索朗多吉旦巴加參巴桑旺堆
關(guān)鍵詞:牦牛阿里基因型

張 強(qiáng),洛桑頓珠,鮮莉莉,平措占堆,索朗多吉,巴 多,旦 巴,旦巴加參,支 張,巴桑旺堆

(1.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,拉薩 850000;2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,拉薩 850009;3.西藏阿里地區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,西藏 阿里 859000;4.西藏阿里改則縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,西藏 阿里 859200)

【研究意義】牦牛(Bosgrunniens)廣泛分布于中國青藏高原海拔3000 m以上的地區(qū),其不僅可作為農(nóng)耕和高原運(yùn)輸工具,還可以為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┠?、肉、毛、役力、燃料等生產(chǎn)生活必需品,是青藏高原牧民重要的生活和經(jīng)濟(jì)支柱。目前,由于受到不同自然生態(tài)條件的自然選擇塑造,我國青藏高原牦牛資源形成了大量適應(yīng)性強(qiáng)和生產(chǎn)力各具特色的優(yōu)秀地方資源群體[1]。故而對(duì)不同地理分布的牦牛新資源進(jìn)行種質(zhì)資源保護(hù)狀態(tài)評(píng)價(jià)及遺傳改良評(píng)估是提升區(qū)域牦牛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要途徑[2]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(Single nucleotide polymorphism, SNP)作為基因組中分布最廣泛的遺傳變異類型,被廣泛用于物種起源進(jìn)化、種群遷徙等領(lǐng)域研究。特別是在家養(yǎng)動(dòng)物育種方面也扮演著重要的角色,如利用全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)重要經(jīng)濟(jì)性狀的受選擇區(qū)域進(jìn)行候選基因挖掘[3-5];全基因高密度SNP芯片(DNA chip)用于家養(yǎng)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析進(jìn)而篩選相關(guān)關(guān)鍵候選遺傳標(biāo)記[6-7]。與高成本的全基因組高通量測(cè)序技術(shù)和微陣列芯片相比,單個(gè)重要候選基因的SNP標(biāo)記與經(jīng)濟(jì)性狀間關(guān)聯(lián)分析在經(jīng)濟(jì)性狀重要候選基因定位中應(yīng)用更為廣泛。如,通過單基因SNP關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)在家雞上大量來自MyOD,IGF-I,IGFBP-3,ESM1和Smad3等基因的SNPs與多種屠宰、繁殖和生長性狀相關(guān)[8-12],對(duì)黃牛和水牛的研究也發(fā)現(xiàn)一系列與生長性狀相關(guān)的候選基因,如CDC10[13],MOGAT1[14],SPARC[15],PLAG1[16],IGF2[17]。另外發(fā)現(xiàn)GH和GHR基因與水牛的生長和產(chǎn)奶量相關(guān)[18-19]。盡管由于牦牛的生活環(huán)境限制而導(dǎo)致針對(duì)牦牛的經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)候選基因挖掘的研究較少,但仍有一些列與牦牛的經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因的分子標(biāo)記被鑒定。如研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)來自MC4R基因的SNP (1069GC)與麥洼牦牛18 月齡體重顯著相關(guān)(P<0.01)[20]。位于LPL基因編碼區(qū)域中的外顯子7的錯(cuò)義突變位點(diǎn)SNP(19913CT)與牦牛的體重相關(guān)(P<0.01),平均日增重、腰眼面積和內(nèi)臟脂肪重量都具有顯著相關(guān)性[21]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】阿里地區(qū)位于西藏西部,平均海拔4500 m,有“世界屋脊之屋脊”、“世界第三極”、“生命之禁區(qū)”的稱號(hào)。當(dāng)?shù)靥烊徊輬?chǎng)數(shù)量充沛,是良好的牦牛生產(chǎn)基地,阿里牦牛作為阿里地區(qū)特有的牧業(yè)資源,牦牛種群數(shù)量巨大,為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┝巳狻⒛?、役力等重要生產(chǎn)資料。本研究通過對(duì)阿里牦牛多種經(jīng)濟(jì)性狀的分析,從而獲得期望的結(jié)果?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究根據(jù)已報(bào)道的與牦牛多種經(jīng)濟(jì)性狀具有顯著相關(guān)性的候選遺傳標(biāo)記在西藏阿里牦牛生態(tài)類群內(nèi)優(yōu)勢(shì)基因型分布情況,以期評(píng)估種群遺傳改良的潛力。其次,對(duì)該群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估,為今后牦牛的遺傳資源保護(hù)工作提供理論參考。

1 材料與方法

于2020年5月赴阿里地區(qū)改則縣牦牛牧場(chǎng)(81°59′86″N;31°30′35″E)收集無血緣關(guān)系的青年健康阿里牦牛62頭(年齡為3~5歲),每只牦牛收集靜脈血液5 mL。利用GNTTM血液DNA提取試劑盒(吉恩生物,中國)提取牛血液全基因組DNA。DNA濃度利用NanoDrop2000DNA微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè),1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量和完整性。

根據(jù)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)牦牛參考基因組(BosGru_v2.0)序列信息,使用PrimerPlex 2軟件設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物(表1~2),單堿基延伸引物使用primer3plus(http://www.primer3plus.com/)設(shè)計(jì),并交由武漢天一華煜基因科技有限公司(武漢,中國)合成引物。

表1 7個(gè)牦牛生長性狀相關(guān)SNP標(biāo)記擴(kuò)增引物信息

PCR擴(kuò)增體系:5 μL 2×TaqPCR Mix,上下游引物各0.5 μL,1 μL DNA(20 ng/μL),3 μL ddH2O補(bǔ)足體系至10 μL。PCR 擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,循環(huán)40次;72 ℃延伸 10 min。SAP消化體系對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,詳細(xì)步驟如下:使用蝦堿酶純化法將殘余dNTPs去磷酸化,降解游離單鏈引物。取4 μL PCR產(chǎn)物,加入2 μL EX-SAP酶[其中包含ddH2O 0.75 μL,SAP(1 U/μL) 0.5 μL,ExoI(5 U/μL) 0.15 μL,10×SAP buffer 0.6 μL]。孵育程序:37 ℃ 40 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存。

將混合PCR產(chǎn)物模板純化后進(jìn)行電泳鑒定,根據(jù)濃度定量稀釋。將稀釋后的PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行SNaPshot反應(yīng)。反應(yīng)體系:SNaPshot Mix 0.5 mL,Pooled PCR Products 3 mL,Pooled Primers 1 mL,ddH2O 0.5 mL,即配制成5.0 mL的反應(yīng)體系;SNaPshot反應(yīng)程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,52 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),4 ℃ 保存。

SNaPshot產(chǎn)物純化體系:直接向SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物中加入2 μL SAP Mix[包含H2O 0.9 μL,SAP (1 U/μL) 0.5 μL,10×SAP buffer 0.6 μL)];SNaPshot產(chǎn)物消化反應(yīng)程序:37 ℃ 40 min,75 ℃ 15 min,4 ℃ 保存。

取2 μL消化后的SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物加入到含有0.4% LIZ120 8 μL去離子甲酰胺中,95 ℃變性5 min,然后放-20 ℃驟冷,PCR產(chǎn)物由武漢天一華煜基因科技有限公司(武漢,北京)利用ABI3130XL(美國AB應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,美國)完成測(cè)序,并利用Genemarker進(jìn)行SNP位點(diǎn)的基因型判定。

原始分型數(shù)據(jù)利用Microsatellite Toolkit軟件包計(jì)算各遺傳位點(diǎn)及群體的等位基因數(shù)(NA)、多態(tài)信息含量(PIC)、觀察雜合度(HO)和期望雜合度(HE)等。用Arlequin 3.5軟件[22]進(jìn)行群體內(nèi)各位點(diǎn)哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)(HWE)。

2 結(jié)果與分析

從表3可知,Hesx1_G618C標(biāo)記在所在的全部個(gè)體中都為純合子G/G型。而來自于相同HesxI基因的另一個(gè)標(biāo)記(Hesx1_T226C)在阿里群體內(nèi)具有一定多態(tài)性,但高頻率為T/T(82.2581%),等位基因T頻率為91.1300%。另外,ACSL1_A2079T 位點(diǎn)在群體內(nèi)最高頻率基因型為A/A(67.7419%),最低為T/T型(3.2258%),其中等位基因A和T頻率分別為82.2600%和17.7400%。ACSL1_G2409A位點(diǎn)的最高基因型為G/G型(58.0645%),最低為A/A型(11.2903%)。MyoD1_C1710T位點(diǎn)50%的個(gè)體攜帶C/T基因型,C/C 和T/T的頻率僅為25.8065%和24.1935%,其中等位基因C和T的頻率基本相當(dāng)(C=49.1900%,T=50.8100%)。來自TMEM-18基因的2個(gè)位點(diǎn)(TMEM-18_C1267T,TMEM-18_C4447T)在群體內(nèi)攜帶的最高頻率基因型均為C/C,且T/T為稀有等位基因型(1.6129%~3.2258%)。

表2 7個(gè)牦牛生長性狀相關(guān)SNP標(biāo)記單堿基延伸測(cè)序引物信息

表3 阿里牦牛群體內(nèi)7個(gè)牦牛生長性狀相關(guān)SNP標(biāo)記基因型頻率及遺傳多樣性信息

由于Hesx1_G618C全部個(gè)體都為G/G型,故而其HE、PIC和HO均為0,且無法進(jìn)行哈代—溫伯格平衡檢驗(yàn)。剩余位點(diǎn)中HO最高為MyoD1_C1710T(HO=0.5000)和ACSL1_G2409A(HO=0.3065),最低是TMEM-18_C4447T和TMEM-18_C1267T,均為0.1452。HE值高低排序與HO規(guī)律一致,且在群體內(nèi)各位點(diǎn)的HO和HE間存在分歧,但差距較小。PIC結(jié)果顯示,其值分布范圍為0.3749(MyoD1_C1710T)~0.1486(TMEM-18_C4447T和Hesx1_T226C),即全部位點(diǎn)中僅有2個(gè)(MyoD1_C1710T和ACSL1_G2409A)具有中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25

3 討 論

本研究利用SNaPshot基因分型技術(shù)對(duì)已明確與牦牛經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的7個(gè)候選SNPs標(biāo)記在阿里牦牛群體內(nèi)基因型分布開展進(jìn)行評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)阿里牦牛群體攜帶大量重要經(jīng)濟(jì)性狀標(biāo)記相關(guān)標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)基因型。眾所周知,垂體作為性腺軸成員,其在調(diào)控多種生長相關(guān)激素過程中起了至關(guān)重要作用,尤其是垂體前葉分泌的生長激素(Growth hormone, GH)在影響動(dòng)物生長的作用被廣泛證實(shí)[23-24]。研究表明,ES細(xì)胞表達(dá)同源異型盒基因(Homeobox expressed in ES cells, HesxI)是參與胚胎早期垂體發(fā)育的重要基因,影響腎上腺皮質(zhì)激素和甲狀腺素刺激素分泌[25-27],尤其是HesxI基因?qū)Υ贵w前葉分泌生長激素具有調(diào)控作用[24,28-29]。

在HesxI基因的內(nèi)含子1區(qū)域發(fā)現(xiàn)的SNP標(biāo)記與南陽牛日增重有顯著相關(guān),在外顯子4的突變位點(diǎn)與南陽牛胸圍、6月齡平均日增重、秦川牛的胸圍和體質(zhì)量等指標(biāo)都存在顯著相關(guān)[30]。在對(duì)山羊的研究中,HesxI基因中一些SNP位點(diǎn)被證實(shí)與山羊體質(zhì)量有顯著聯(lián)系,且A/A為優(yōu)勢(shì)基因型[31]。尤其是在青海大通牦牛的無角牦牛群體中發(fā)現(xiàn),多個(gè)來自HexsI基因的SNPs與其生長性能相關(guān),如HesxI_G-618C與6月齡和12月齡無角牦牛體質(zhì)量、體高、胸圍均有極顯著相關(guān)(P<0.01),另外,HesxI_T226C與12月齡無角牦牛的體重、體高、胸圍均有顯著相關(guān)(P<0. 05)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)阿里無角牦牛群體中HesxI_G-618C位點(diǎn)為純合G/G型,但在無角牦牛群體內(nèi)該位點(diǎn)位G/G:76.4000%,G/C:23.6000%。且G/G型為6月齡體質(zhì)量和胸圍、12月齡體斜長和體質(zhì)量、18月齡體質(zhì)量的非優(yōu)勢(shì)基因型[32]。表明HesxI_G-618C位點(diǎn)在阿里牦牛群體內(nèi)不具備分子遺傳改良與評(píng)估價(jià)值。另外,盡管約82.0000%阿里牦牛個(gè)體攜帶HesxI_T226C位點(diǎn)的T/T型,但仍有17.7419%的個(gè)體攜帶T/C型頻率,已有研究表明其與青海無角牦牛12月齡體質(zhì)量、體高和胸圍的關(guān)聯(lián)分析研究中確定T/C為優(yōu)勢(shì)基因型[32],故阿里牦牛在HesxI_T226C位點(diǎn)內(nèi)具有一定改良潛力。

來自于肌肉調(diào)節(jié)因子(Muscle Regulatory Factors, MRFS)家族的生肌決定因子(Myostatin 1, MyoD1)是調(diào)控骨骼肌生成的重要轉(zhuǎn)錄因子,它能夠激活肌肉基因轉(zhuǎn)錄,使非肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〖?xì)胞,調(diào)控肌細(xì)胞的融合,促進(jìn)成肌細(xì)胞分化為肌管,進(jìn)而融合為肌纖維,是調(diào)控脊椎動(dòng)物胚胎期肌肉發(fā)育過程的主調(diào)控因子[33-34],同時(shí)有研究證實(shí)該基因也與壞損組織修復(fù)存在密切關(guān)聯(lián)[34]。在家養(yǎng)動(dòng)物方面,目前大量在MyoD1基因區(qū)域的遺傳變異與家養(yǎng)動(dòng)物的生長和肉品質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀呈顯著相關(guān),如篩選獲得MyoD1基因內(nèi)含子1區(qū)的位點(diǎn)突變(T→A)在高郵鴨的49日齡的體重、胸肌重、胸肌橫截面積、胸肌纖維直徑以及胸肌纖維密度均顯著相關(guān)(P<0.05)[35]。豬MyoD1基因外顯子4上發(fā)現(xiàn)一個(gè)同義突變SNP(c.783 GA)與天府黑兔、伊拉兔和香檳兔的全凈膛重、半凈膛重間呈顯著相關(guān)(P<0.05)[36]。在長白豬和大白豬的MyoD1基因第1內(nèi)含子第257位存在1個(gè)A/C顛換被證實(shí)與肉色評(píng)分和失水率相關(guān)(P<0.05或P<0.01)[37]。在多個(gè)新疆地方綿羊群體中發(fā)現(xiàn)MyoD1基因第一外顯子的突變與其產(chǎn)肉性能有關(guān)[38-39]。在牛上同樣也發(fā)現(xiàn)在MyoD1基因內(nèi)存在大量與其生長和屠宰性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記[40-41]。尤其,研究發(fā)現(xiàn)申扎牦牛MyoD1基因外顯子3上的SNP(MyoD1_C1710T)與體尺性狀顯著(P<0.05)相關(guān),C/T為優(yōu)勢(shì)基因型[42]。本研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型在阿里牦牛群體中頻率為50%,暗示利用該標(biāo)記在此群體內(nèi)進(jìn)行分子選育的潛力巨大。

大量研究表明跨膜蛋白18(Transmembrane protein, TEME18)影響癌細(xì)胞的代謝和調(diào)節(jié)[43-44]并參與神經(jīng)元干細(xì)胞的遷移[45]。尤其是近些年研究發(fā)現(xiàn)TEME18可通過神經(jīng)調(diào)節(jié)而參與脂肪細(xì)胞的分化,從而影響機(jī)體肥胖[46-47]。通過人的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)TMEM18基因存在與人類食欲及生長發(fā)育相關(guān)的遺傳變異標(biāo)記[48-49]。在家養(yǎng)動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)TMEM18基因中多個(gè)SNP與豬和牛的多個(gè)生長經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)[50-51]。尤其是新近在天祝牦牛中發(fā)現(xiàn)TMEM18基因SNP標(biāo)記(C1267T)位點(diǎn)與牦牛的體高、體重和屠宰率差異顯著(P<0.05)。另外,TMEM18_C4447T位點(diǎn)與牦牛的體斜長、管圍、胸圍、體重、胴體重、凈肉重、凈肉率和屠宰率均存在顯著性差異(P<0.05)[52]。本研究發(fā)現(xiàn),兩個(gè)來自于TMEM18基因的SNP位點(diǎn)在阿里牦牛群體中都主要攜帶C/T和C/C,而T/T型稀少。據(jù)已有研究報(bào)道稱TMEM18_C4447T的C/T和C/C較T/T基因型在胸圍、管圍及體斜長指標(biāo)上均具有優(yōu)勢(shì),其性能均高于T/T型個(gè)體攜帶者[52]。

長鏈?;o酶A合成酶1(Long chain acyl-CoA synthetase 1, ACSL1)被證實(shí)廣泛參與甘油三酯、磷脂、膽固醇酯的合成及脂肪酸氧化作用[53-55]。眾所周知,鮮乳中最重要指標(biāo)之一的乳脂,其98%~99%是甘油三酯,主要由甘油和長鏈脂肪酸組成。有研究表明小鼠肝臟細(xì)胞及脂肪細(xì)胞中過表達(dá)ACSL1可增加長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯[56],故而理論上該基因能夠間接提高乳脂率。在家養(yǎng)動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)ACSL1被定位到影響豬(Sus scrofa)肉中脂肪酸組成的QTL區(qū)域[57]。另外,有研究發(fā)現(xiàn)ACSL1基因多態(tài)性與肉牛骨骼肌中脂肪酸組成和比例呈顯著相關(guān)[58]。尤其,新近研究發(fā)現(xiàn)ACSL1基因區(qū)域的大量遺傳變異與荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量的性狀呈顯著相關(guān),包括日產(chǎn)奶量(TDMY)、脂肪含量(FC)、蛋白質(zhì)含量(PC)和體細(xì)胞評(píng)分(SCS)[31]。

牦牛上,已有報(bào)道稱位于ACSL1基因啟動(dòng)子區(qū)存在2個(gè)SNP位點(diǎn)(ACSL1_A2079T和ACSL1_G2409A)并被證實(shí)與甘南牦牛的乳蛋白率及總固體物質(zhì)含量、乳脂率等乳性狀顯著相關(guān),且攜帶ACSL1_A2079T的T/A基因型個(gè)體的乳白蛋白率高于A/A型個(gè)體,攜帶ACSL1_G2409A位點(diǎn)的A/A型個(gè)體乳脂率和總固體含量指標(biāo)優(yōu)于其他基因型個(gè)體[59]。本研究的阿里牦牛群體中CSL1_A2079T位點(diǎn)攜帶T/A者占總?cè)后w的29.0323%,另外阿里牦牛攜帶ACSL1_G2409A位點(diǎn)的A/A基因型個(gè)體占種群11.2903%。這表明暗示阿里牦牛群體內(nèi)具有較高頻率ACSL1基因與產(chǎn)乳性能及乳品質(zhì)候選標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)基因型。最后,本研究中全部個(gè)體均未在阿里牦牛群體內(nèi)顯著偏離哈代—溫伯格平衡,暗示了阿里牦牛歷史上沒有經(jīng)歷強(qiáng)烈的人工選擇。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果顯示阿里牦牛群體在與生長及泌乳性狀相關(guān)基因的候選標(biāo)記座位上攜帶高比例優(yōu)勢(shì)基因型,如Hesx1-T226C、MyoD1-C1710T及TMEM-18-C4447T,表明阿里牦牛具有優(yōu)秀的分子遺傳改良潛力。

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