吳 燕, 龍 霞, 張才在, 王丹丹, 刑文昊, 廖朝美, 張依裕

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

1 材料與方法

1.1 材料

選取飼養(yǎng)于貴州大學(xué)家禽研究所科研農(nóng)場30周齡產(chǎn)蛋高峰期的三穗鴨20只，要求體質(zhì)相近、產(chǎn)蛋率一致.

1.2 樣品采集

觀察鴨個(gè)體的產(chǎn)蛋時(shí)間，并掌握其產(chǎn)蛋規(guī)律，按產(chǎn)蛋時(shí)間的集中程度分為4組，每組5只，分別于卵位于卵巢(產(chǎn)蛋后0 h)、膨大部(產(chǎn)蛋后2 h)、峽部(產(chǎn)蛋后5 h)、子宮(產(chǎn)蛋后16 h)時(shí)對供試鴨進(jìn)行全部宰殺，并迅速采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、十二指腸、胰臟、肌胃、腺胃、子宮、胸肌.采集后的組織置于凍存管中，置冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆?

1.3 總RNA的提取與cDNA的合成

采用Trizol法提取鴨各組織樣品的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性.采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用超微量紫外分光光度計(jì)檢測cDNA的濃度和完整性，置冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆?

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的鴨IP3R1基因(NC_051784.1)和SLC4A4基因(NC_040049.1)CDS區(qū)序列，進(jìn)行三穗鴨IP3R1、SLC4A4基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增.以β-actin(GenBank登錄號：EF667345)作為內(nèi)參基因，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3對引物，引物信息如表1所示.所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成.

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測鴨各組織樣品中IP3R1、SLC4A4基因的相對表達(dá)量.PCR反應(yīng)體系(10 μL)：5 μL 2×Taq Master Mix，上、下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA模板，最后加雙蒸水至10 μL.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù).PCR反應(yīng)程序：50 ℃下激活尿嘧啶DNA糖基酶(UDG)2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，退火(溫度如表1所示)15 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存.

表1 三穗鴨IP3R1、SLC4A4基因的引物信息Table 1 Primer sequences information for the IP3R1 and SLC4A4 genes of the Sansui duck

1.6 子宮Ca2+濃度的測定

采用總蛋白定量測試盒測定子宮組織的總蛋白濃度，再用鈣測試盒測定子宮組織的Ca2+濃度.準(zhǔn)確稱取產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期子宮組織重量，并分為4個(gè)組，每組按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的去離子水，冰水浴勻漿后，于2 500 r·min-1離心.離心結(jié)束后，每組取10%上清液到96孔板中，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)在96孔板中設(shè)置空白組和標(biāo)準(zhǔn)組，分別加入與試驗(yàn)組等體積的去離子水和鈣標(biāo)準(zhǔn)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，靜置5 min，以波長為610 nm的酶標(biāo)儀測定各孔的光密度(D)，并運(yùn)用公式計(jì)算組織中的Ca2+濃度.

1.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2019軟件對實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；參照文獻(xiàn)[11]的方法采用2-ΔΔCt法計(jì)算IP3R1、SLC4A4基因在三穗鴨各組織中的相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示,用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析和雙變量相關(guān)分析的方法分析其差異顯著性和相關(guān)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期IP3R1基因的組織表達(dá)差異

表2顯示，IP3R1基因在三穗鴨產(chǎn)蛋循環(huán)中各組織均能檢測到表達(dá).以胸肌為對照，產(chǎn)蛋后0 h，IP3R1基因在腎臟中的表達(dá)量達(dá)到極顯著最大值(P<0.01)，其次是胰臟，而在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、大腸、小腸、十二指腸、肌胃、腺胃、子宮中的表達(dá)量都較低；產(chǎn)蛋后2 h，IP3R1基因在肺臟中的表達(dá)量達(dá)到極顯著最大值(P<0.01)，其次是十二指腸，而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腸、小腸、胰臟、肌胃、腺胃、子宮中的表達(dá)量都較低；產(chǎn)蛋后5 h，IP3R1基因在子宮中的表達(dá)量達(dá)到極顯著最大值(P<0.01)，其次是心臟，而在肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、十二指腸、胰臟、肌胃、腺胃中的表達(dá)量都較低；產(chǎn)蛋后16 h，IP3R1基因在腎臟中的表達(dá)量達(dá)到極顯著最大值(P<0.01)，其次是肝臟、胰臟、子宮，而在心臟、脾臟、肺臟、大腸、小腸、十二指腸、肌胃、腺胃中的表達(dá)量都較低.

表2還顯示，各組織IP3R1基因的表達(dá)量在鴨產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期存在顯著差異.心臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腸、胰臟、子宮IP3R1基因的表達(dá)量在16 h達(dá)到最大值，極顯著高于0～5 h(P<0.01).心臟IP3R1基因在2 h的表達(dá)量極顯著高于0、5 h(P<0.01)；腎臟、胰臟在0 h的表達(dá)量極顯著高于2、5 h(P<0.01)，胰臟在2 h的表達(dá)量極顯著高于5 h(P<0.01)；子宮在5 h的表達(dá)量極顯著高于0、2 h(P<0.01)；肺臟在2 h的表達(dá)量極顯著高于0、5、16 h(P<0.01)，在16 h的表達(dá)量極顯著高于0、5 h(P<0.01)；十二指腸在2 h的表達(dá)量極顯著高于0、5、16 h(P<0.01)，在0 h的表達(dá)量極顯著高于5、16 h(P<0.01)；小腸在5 h的表達(dá)量顯著低于0、2、16 h(P<0.05)；肌胃在0 h的表達(dá)量極顯著高于2、5、16 h(P<0.01)；腺胃在2、16 h的表達(dá)量極顯著高于0、5 h(P<0.01).其他指標(biāo)間的差異不顯著(P>0.05).

表2 產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期IP3R1基因的組織表達(dá)差異1)Table 2 Expressions of IP3R1 gene in various duck tissues during different time points of egg-laying cycle

2.2 產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期SLC4A4基因的組織表達(dá)差異

表3顯示，SLC4A4基因在三穗鴨產(chǎn)蛋循環(huán)中各組織均能檢測到表達(dá).以胸肌為對照，產(chǎn)蛋后0 h，SLC4A4基因在十二指腸中的表達(dá)量達(dá)到極顯著最大值(P<0.01)，其次是肺臟，而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腸、小腸、胰臟、肌胃、腺胃、子宮中的表達(dá)量都較低；產(chǎn)蛋后2 h，SLC4A4基因在肺臟中的表達(dá)量達(dá)到極顯著最大值(P<0.01)，其次是肝臟、腺胃，而在心臟、脾臟、腎臟、大腸、小腸、胰臟、肌胃、子宮中的表達(dá)量都較低；產(chǎn)蛋后5 h，SLC4A4基因在肺臟中的表達(dá)量達(dá)到極顯著最大值(P<0.01)，其次是子宮，而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腸、小腸、十二指腸、胰臟、肌胃、腺胃中的表達(dá)量都較低；產(chǎn)蛋后16 h，SLC4A4基因在肺臟中的表達(dá)量達(dá)到極顯著最大值(P<0.01)，其次是心臟、大腸、胰臟、子宮，而在肝臟、脾臟、腎臟、小腸、十二指腸、肌胃、腺胃中的表達(dá)量都較低.

表3還顯示，各組織SLC4A4基因的表達(dá)量在鴨產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期存在顯著差異.心臟、肺臟、腎臟、大腸、胰臟、子宮SLC4A4基因的表達(dá)量在6 h極顯著高于0～5 h(P<0.01).腎臟、大腸SLC4A4基因的表達(dá)量在0 h極顯著高于2、5 h(P<0.01)；肝臟在0、2 h的表達(dá)量極顯著高于5、16 h(P<0.01)；脾臟在0、16 h的表達(dá)量極顯著高于2、5 h(P<0.01)；小腸在2 h的表達(dá)量顯著高于0、5、16 h(P<0.05)；十二指腸、肌胃在0 h的表達(dá)量極顯著高于2～16 h(P<0.01)；肌胃在5 h的表達(dá)量極顯著高于2、16 h(P<0.01)；腺胃在2 h的表達(dá)量極顯著高于0、5、16 h(P<0.01)，在16 h的表達(dá)量極顯著高于0、5 h(P<0.01).其他指標(biāo)間的差異不顯著(P>0.05).

表3 產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期SLC4A4基因的組織表達(dá)差異1)Table 3 Expression of SLC4A4 gene in various duck tissues during different time points of egg-laying cycle

2.3 產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期子宮Ca2+濃度的變化

圖1顯示：產(chǎn)蛋后0～2 h，子宮Ca2+濃度較低；產(chǎn)蛋后5 h，子宮Ca2+濃度逐漸升高，與0～2 h相比，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；產(chǎn)蛋后16 h，子宮Ca2+濃度達(dá)到最大值，極顯著高于0～5 h(P<0.01).

附不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).圖1 產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期子宮Ca2+濃度的變化Fig.1 Dynamics of uterine Ca2+ concentration during egg-laying cycle of duck

2.4 產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期IP3R1基因在各組織的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)性

鴨產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期IP3R1基因在各組織的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度之間的相關(guān)性(表4～7)顯示：產(chǎn)蛋后0 h，肝臟IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；胰臟的表達(dá)量與子宮的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與心臟的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；小腸的表達(dá)量與肝臟、脾臟的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05).產(chǎn)蛋后2 h，胸肌IP3R1基因的表達(dá)量與十二指腸的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與小腸的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；小腸的表達(dá)量與十二指腸的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；子宮的表達(dá)量與胰臟的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；肝臟的表達(dá)量與腺胃的表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01).產(chǎn)蛋后5 h，胸肌IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；小腸的表達(dá)量與腺胃的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05).產(chǎn)蛋后16 h，小腸IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；腎臟的表達(dá)量與胸肌的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，肝臟的表達(dá)量與十二指腸的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01).其他指標(biāo)間無相關(guān)性(P>0.05).

表4 產(chǎn)蛋后0 h,各組織IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)系數(shù)1)Table 4 Correlation coefficient between the expression of IP3R1 gene in various duck tissues and uterine Ca2+ concentration at 0 h after egg laying

表5 產(chǎn)蛋后2 h,各組織IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)系數(shù)1)Table 5 Correlation coefficient between the expression of IP3R1 gene in various duck tissues and uterine Ca2+ concentration at 2 h after egg laying

表7 產(chǎn)蛋后16 h,各組織IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)系數(shù)1)Table 7 Correlation coefficient between the expression of IP3R1 gene in various duck tissues and uterine Ca2+ concentration at 16 h after egg laying

2.5 產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期SLC4A4基因在各組織的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)性

鴨產(chǎn)蛋循環(huán)不同時(shí)期SLC4A4基因在各組織的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度之間的相關(guān)性(表8、表9)顯示：產(chǎn)蛋后0 h，十二指腸SLC4A4基因的表達(dá)量與大腸、小腸的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；胰臟的表達(dá)量與肺臟的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05).產(chǎn)蛋后2 h，肝臟SLC4A4基因的表達(dá)量與腺胃的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；大腸的表達(dá)量與脾臟的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；小腸的表達(dá)量與胰臟的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05).

表8 產(chǎn)蛋后0 h,各組織SLC4A4基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)系數(shù)1)Table 8 Correlation coefficient between the expression of SLC4A4 gene in various duck tissues and uterine Ca2+ concentration at 0 h after egg laying

表9 產(chǎn)蛋后2 h,各組織SLC4A4基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)系數(shù)1)Table 9 Correlation coefficient between the expression of SLC4A4 gene in various duck tissues and uterine Ca2+ concentration at 2 h after egg laying

表10、表11顯示：產(chǎn)蛋后5 h，脾臟SLC4A4基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度、胸肌的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與胰臟的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；胰臟的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；肺臟的表達(dá)量與小腸的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與肌胃的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；腎臟的表達(dá)量與十二指腸的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；小腸的表達(dá)量與肌胃的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；心臟的表達(dá)量與肝臟的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05).產(chǎn)蛋后16 h，大腸SLC4A4基因的表達(dá)量與小腸的表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；十二指腸的表達(dá)量與肌胃的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與脾臟的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05).其他指標(biāo)間無相關(guān)性(P<0.05).

表10 產(chǎn)蛋后5 h,各組織SLC4A4基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)系數(shù)1)Table 10 Correlation coefficient between the expression of SLC4A4 gene in various duck tissues and uterine Ca2+ concentration at 5 h after egg laying

表11 產(chǎn)蛋后16 h,各組織SLC4A4基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度的相關(guān)系數(shù)1)Table 11 Correlation coefficient between the expression of SLC4A4 gene in various duck tissues and uterine Ca2+ concentration at 16 h after egg laying

3 討論

前人研究表明：在鴨產(chǎn)蛋中期，IP3R1基因在腎臟、小腸、子宮中均存在不同程度的表達(dá)[9]；IP3R1基因在人類精子的頂體膜中存在表達(dá)，在受精過程中的表達(dá)量會減少[17]；SLC4A4基因在大鼠的許多組織中具有非常廣泛的表達(dá)，包括腎小管、十二指腸、小腸上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜、輸卵管上皮組織等[18-20].上述前人研究結(jié)果與本研究結(jié)果“鴨產(chǎn)蛋循環(huán)中，IP3R1、SLC4A4基因在各組織均有不同程度的表達(dá)”相似.蛋殼鈣主要來源腸道，腸道必須保持高效的運(yùn)轉(zhuǎn)才能滿足連續(xù)高產(chǎn)的要求，一旦發(fā)生腸道Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，極易引起蛋雞產(chǎn)蛋率的下降，誘發(fā)骨質(zhì)疏松等疾病[21].本研究結(jié)果表明：16 h的IP3R1基因在腎臟、大腸的表達(dá)量極顯著高于0～5 h，2 h的IP3R1基因在十二指腸的表達(dá)量極顯著高于0、5、16 h，0 h的IP3R1基因在十二指腸的表達(dá)量極顯著高于5、16 h，5 h的IP3R1基因在小腸的表達(dá)量顯著低于0、2、16 h；16 h的SLC4A4基因在腎臟、大腸的表達(dá)量極顯著高于0～5 h，0 h的SLC4A4基因在腎臟、大腸的表達(dá)量極顯著高于2、5 h，2 h的SLC4A4基因在小腸的表達(dá)量顯著高于0、5、16 h，0 h的SLC4A4基因在十二指腸的表達(dá)量極顯著高于2～16 h.由于蛋殼鈣化大多發(fā)生在夜晚，鈣主要來源于腸道，大量的鈣會被轉(zhuǎn)運(yùn)至子宮，而腸道的鈣來源于白天時(shí)，產(chǎn)蛋后0～2 h，此時(shí)鴨正處于進(jìn)食狀態(tài)，腸道會增加對食物中Ca2+的吸收[12].家禽鈣的吸收主要發(fā)生在小腸前段和十二指腸[22].由于0～2 h的IP3R1、SLC4A4基因在小腸、十二指腸的表達(dá)量極顯著高于其他時(shí)期，且在蛋殼鈣化過程中(產(chǎn)蛋后16 h)，IP3R1、SLC4A4基因在大腸、腎臟的表達(dá)量達(dá)到極顯著的最大值，故推測IP3R1、SLC4A4基因在蛋鴨腎臟、腸道Ca2+的吸收中起重要作用.本研究結(jié)果表明：產(chǎn)蛋后0 h，肝臟IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈顯著正相關(guān)；產(chǎn)蛋后5 h，胸肌IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈顯著負(fù)相關(guān)；產(chǎn)蛋后16 h，小腸IP3R1基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)；產(chǎn)蛋后5 h，脾臟SLC4A4基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，胰臟SLC4A4基因的表達(dá)量與子宮Ca2+濃度呈極顯著負(fù)相關(guān).上述結(jié)果與楊俊花[23]的研究結(jié)果“家禽腸道Ca2+的吸收主要發(fā)生在小腸前段(十二指腸、空腸)，在蛋殼鈣化開始前，大量的Ca2+被轉(zhuǎn)運(yùn)到子宮參與蛋殼鈣化”相似.推測在蛋殼鈣化時(shí)期大量的Ca2+被轉(zhuǎn)運(yùn)到子宮中參與蛋殼的形成，此時(shí)的小腸已完成Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，使IP3R1基因的表達(dá)量反而較低.本試驗(yàn)結(jié)果為今后研究IP3R1、SLC4A4基因在鴨蛋殼形成過程中影響Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)理提供了新的參考.