秦登利，高 錦

帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。PD發(fā)生的主要病理學(xué)特征為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性死亡[2]。雖然目前臨床上的藥物可以暫時減緩PD的運動癥狀，但卻不能阻止多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的漸進(jìn)性死亡[3]。眼發(fā)育缺失1(eye absent 1, Eya1)是Eya家族中的一員，是一種轉(zhuǎn)錄激活因子[4]。Eya家族成員主要由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即氨基端和羧基端結(jié)構(gòu)域[5]。研究顯示Eya1不僅在發(fā)育中，在腫瘤及神經(jīng)相關(guān)疾病中均發(fā)揮著重要的作用[6]。Eya1可修復(fù)大腸腫瘤細(xì)胞中斷裂的DNA，進(jìn)而拮抗細(xì)胞凋亡的作用[7]。在損傷早期的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中，Eya1通過轉(zhuǎn)錄因子Six2促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞系神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)而保護(hù)損傷的細(xì)胞[8]。然而，Eya1保護(hù)受損多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的具體機制尚未闡明。

該研究構(gòu)建了攜帶Eya1基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，篩選了穩(wěn)定高表達(dá)Eya1的細(xì)胞株，并通過CCK-8、Hoechst 33258染色和Western blot方法檢測過表達(dá)Eya1對細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 大鼠DA能神經(jīng)細(xì)胞系MES23.5細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)；HEK 293細(xì)胞購自美國ATCC公司；Lipofectamine 2000購自天津Invitrongen公司；ApaL I和Xho I等限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；Eya1 Polyclonal Antibody(貨號：22658-1-AP、稀釋比1 ∶500)、Bcl-2 Polyclonal Antibody(貨號：12789-1-AP、稀釋比1 ∶2 000)及Bax Polyclonal Antibody(貨號：50599-2-lg、稀釋比1 ∶5 000)均購自武漢三鷹Proteintech公司，細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(貨號：KGA317)購自南京凱基公司；Hoechst 33258染色試劑盒(貨號：C0003)購自上海碧云天公司；6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)藥物(貨號：HY-B1081A)購自上海MCE公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MES23.5細(xì)胞和HEK 293細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)生長到90%融合度左右時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，選擇處于對數(shù)生長期良好的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2攜帶Eya1基因的載體的構(gòu)建 利用NCBI數(shù)據(jù)庫下載Eya1基因序列(Gene ID:NM_001 310 459.1)，利用引物設(shè)計軟件，設(shè)計一對Eya1基因特異性的PCR引物，正向引物為5′-GCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGAA ATGCAGGATCCTAAACCAGCC-3′，反向引物為5′-TACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCAGGTACTCTA ATTCCAAGGCATG-3′，引物由上海生工有限公司合成。

PCR擴增目的基因Eya1，并使其兩端帶上Gibson(Gibson Assembly)反應(yīng)重疊區(qū)域。在核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的共同作用下發(fā)生Gibson反應(yīng)，將目的基因連接到入門載體，構(gòu)建pDown-mEya1入門載體。將Gibson反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，將平板37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，隨后挑取菌落，PCR反應(yīng)鑒定陽性克隆，DNA測序mEya1區(qū)域，確認(rèn)序列正確的克隆。然后，將攜帶attL4-EFIA-attR1序列的pUp-EF1A、攜帶attL1-mEya1-attL2序列的pDown-mEya1和攜帶attR4-Chl-ccdB-attR2序列的慢病毒終載體pLV.Des2d.C/mCherry:T2A:Puro LR反應(yīng)(reaction of an attL substrate with an attR substrate)，EF1A啟動子、mEya1/Flag按順序正確插入到終載體上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化挑菌、酶切鑒定得到正確的mEya1過表達(dá)慢病毒終載體(plv-mCherry:T2A:Puro-EF1A>mEya1/Flag)，過表達(dá)的Eya1轉(zhuǎn)錄本：[NM_001 310 459.1]。

1.2.3攜帶Eya1基因的慢病毒顆粒的包裝及病毒滴度測定 培養(yǎng)HEK 293細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，替換成無抗生素的完全培養(yǎng)基。加入質(zhì)粒DNA混合物(15 μg轉(zhuǎn)移載體和20 μg的包裝混合物)和脂質(zhì)體2 000。轉(zhuǎn)染后48～72 h，收集病毒上清液，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，用0.45 μm濾膜進(jìn)一步過濾病毒上清液。將200 μl病毒濃縮液加入至離心管，上層加入1.5 ml的20%蔗糖溶液，平衡后12 000 r/min離心2 h。離心去上清液，收集沉淀病毒顆粒，每管沉淀用200 μl Hank′s平衡鹽溶液重懸，測定病毒滴度。48～72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。選取熒光率在1%～20%的孔進(jìn)行滴度計算。

1.2.4篩選穩(wěn)定表達(dá)Eya1基因的MES23.5細(xì)胞 取對數(shù)生長期的MES23.5細(xì)胞按照每孔5×104個細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長到50%～60%融合度時感染病毒，分為對照組(未感染慢病毒的細(xì)胞)、空載體組(感染攜帶熒光蛋白但不攜帶Eya1基因的慢病毒)和慢病毒感染組(感染攜帶Eya1基因及熒光蛋白基因的重組慢病毒)。根據(jù)預(yù)實驗得到的最佳感染細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)在培養(yǎng)基中加入MOI=10的病毒量，同時加入感染試劑Polybrene(最終濃度應(yīng)為5 μg/ml)提高感染效率?；靹蚝笾糜诩?xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；12 h后更換新的培養(yǎng)基；48 h后熒光顯微鏡下觀察感染效率，并加入嘌呤霉素(預(yù)實驗測定的最佳藥物篩選濃度為8 μg/ml)篩選出感染成功的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.5MES23.5細(xì)胞損傷模型的制備 本課題組前期研究顯示，100 μmol/L 6-OHDA溶液加入多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞2 h，細(xì)胞生存率約為53%，所以選擇此濃度和時間用于后續(xù)實驗。待細(xì)胞生長密度到90%左右時，加入100 μmol/L 6-OHDA溶液，對照組加入含抗壞血酸的0.9%氯化鈉溶液，在加入6-OHDA 2 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行MES23.5細(xì)胞凋亡的檢測，以及采用Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)變化。

1.2.6CCK-8試驗檢測MES23.5細(xì)胞活力 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，將MES23.5細(xì)胞以每孔8×103個的密度接種在96孔板中，每組均設(shè)置6個復(fù)孔；24 h培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，對照組加抗壞血酸處理2 h，給予空載體組和過表達(dá)Eya1組加藥處理2 h后，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入100 μl培養(yǎng)基和10 μl CCK-8試劑，混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h。用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定各孔吸光度值。

1.2.7Hoechst 33258染色 細(xì)胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會發(fā)生固縮。Hoechst 33258對細(xì)胞進(jìn)行染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡的細(xì)胞核會呈致密濃染或呈碎片狀致密濃染。將細(xì)胞接種到24孔板中(5×104細(xì)胞/孔)，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%左右時，對照組加入抗壞血酸處理2 h，實驗組加入100 μmol/L 6-OHDA處理2 h，吸盡培養(yǎng)液，加入150 μl固定液，固定10 min后，用PBS洗3遍，加入150 μl Hoechst 33258染液，染色5 min，去染色液，用PBS洗2遍，吸盡液體，滴一滴抗熒光淬滅液于載玻片上，蓋上有細(xì)胞的蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.2.8Western blot檢測Eya1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，收集病毒感染細(xì)胞和6-OHDA處理后的細(xì)胞及對照組細(xì)胞，用預(yù)冷的RIPA裂解液提取總蛋白，12 000 r/min離心30 min，取上清用BCA(bicinchonininc acid)法測定蛋白濃度，按1 ∶4的體積比在蛋白樣品中加入5×SDS上樣緩沖液，95 ℃煮沸變性10 min。取60 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，并轉(zhuǎn)移至NC膜，使用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜，washing buffer洗滌條帶3次，每次10 min，室溫二抗避光孵育2 h，再用washing buffer洗滌條帶3次后用Odyssey CLX紅外激光成像系統(tǒng)掃描條帶。以β-actin為內(nèi)參，使用Image J分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 攜帶Eya1基因的慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定PCR擴增的目的片段Eya1經(jīng)Gibson和LR反應(yīng)后連接于慢病毒終載體，利用SnapGene軟件進(jìn)行酶切分析，可知使用ApaL I和Xho I連接的載體進(jìn)行雙酶切后，可以分別產(chǎn)生1 085、2 295、2 891、1 246、3 648 bp的5條DNA條帶(圖1A)。酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示有5條清晰的條帶，與預(yù)測的一致，其中2 295處所在的條帶包含目的基因Eya1(圖1B)。測序結(jié)果經(jīng)DNA分析比對與預(yù)期完全一致(圖2)。以上結(jié)果表明攜帶Eya1的重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 構(gòu)建的重組慢病毒質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析A：重組慢病毒質(zhì)粒；B：瓊脂糖凝膠電泳分析；M：DNA marker；P7：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；7：重組慢病毒質(zhì)粒

圖2 DNA測序圖譜及基因序列比對

2.2 攜帶Eya1基因的慢病毒的包裝及病毒滴度測定將Eya1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過熒光計數(shù)法進(jìn)行滴度測定。病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×1 000，結(jié)果顯示上清液中的病毒滴度為2.61×108(TU/ml)。

將慢病毒包裝的Eya1顆粒按照預(yù)實驗的感染復(fù)數(shù)MOI=10感染到MES23.5細(xì)胞中，48 h后能明顯觀察到大量mCherry紅色熒光(圖3)，感染效率達(dá)80%。經(jīng)嘌呤霉素藥物篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，即Eya1 MES23.5細(xì)胞株。

圖3 Eya1慢病毒感染MES23.5細(xì)胞 ×20A：明場顯微鏡下；B：熒光顯微鏡下

2.3 穩(wěn)定表達(dá)Eya1基因的MES23.5細(xì)胞中Eya1蛋白水平的鑒定收集培養(yǎng)的Eya1 MES23.5細(xì)胞株，Western blot方法鑒定細(xì)胞中Eya1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)Eya1組中Eya1蛋白表達(dá)水平明顯高于空載體組和對照組(F=11.82，P<0.05)，見圖4。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)Eya1的MES23.5細(xì)胞。

圖4 Western blot檢測MES23.5細(xì)胞中Eya1蛋白表達(dá)水平A：Western blot檢測Eya1基因的表達(dá)；B：各組Eya1蛋白灰度值統(tǒng)計圖；1：對照組；2：空載體組；3：過表達(dá)Eya1組；與空載體組比較：*P<0.05

2.4 過表達(dá)Eya1對6-OHDA誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞活力的影響用CCK-8試驗檢測了藥物處理后MES23.5細(xì)胞的活力變化并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示，過表達(dá)Eya1組細(xì)胞活力明顯高于空載組(F=9.159，P<0.05)，而對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。顯微鏡下觀察顯示，對照組細(xì)胞形態(tài)正常，胞體和突起均勻附著；加藥處理后細(xì)胞形態(tài)異常，胞體變小且皺縮，過表達(dá)Eya1組細(xì)胞胞體變小和皺縮明顯減輕(圖6)。以上結(jié)果表明過表達(dá)Eya1保護(hù)了藥物處理對MES23.5細(xì)胞的損傷作用。

圖5 CCK-8檢測各組細(xì)胞的活力1：對照組；2：空載體組；3：6-OHDA處理的空載體組；4：6-OHDA處理的過表達(dá)Eya1組；與6-OHDA處理的空載體組比較：*P<0.05；與對照組比較：#P<0.05

圖6 顯微鏡下MES23.5細(xì)胞形態(tài)的觀察 ×20A：對照組；B；空載體組；C：6-OHDA處理的空載體組；D：6-OHDA處理的過表達(dá)Eya1組

2.5 過表達(dá)Eya1對6-OHDA誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞凋亡的影響Hoechst 33258染色觀測了藥物處理后MES23.5細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下觀察到未加藥物處理組的細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻淡藍(lán)色，細(xì)胞核大小一致，形狀均勻(圖7A、B)。6-OHDA藥物處理后，空載體組細(xì)胞核發(fā)生固縮，變小，且出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞核呈現(xiàn)濃染致密的熒光(圖7C)；過表達(dá)Eya1組細(xì)胞核中凋亡小體與空載體組相比明顯減少。以上結(jié)果表明過表達(dá)Eya1可降低6-OHDA誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞的凋亡。

圖7 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞的凋亡情況 ×20A：對照組；B：空載體組；C：6-OHDA處理的空載體組；D：6-OHDA處理的過表達(dá)Eya1組；箭頭：為部分凋亡細(xì)胞

2.6 過表達(dá)Eya1對6-OHDA誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響Western blot方法檢測細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果顯示，未加藥物處理組中Bcl-2和Bax表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；6-OHDA誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，Eya1過表達(dá)組Bax表達(dá)明顯低于空載體組(F=11.89，P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)明顯高于對照組(F=27.83，P<0.05)(圖8)。說明過表達(dá)Eya1增強了MES23.5細(xì)胞的抗凋亡作用。

圖8 Western blot檢測各組Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)A：Western blot 檢測各組Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)B：每組Bcl-2蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計圖；C：每組Bax蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計圖；1：對照組；2：空載體組；3：6-OHDA處理的空載體組；4：6-OHDA處理的過表達(dá)Eya1組；與對照組比較：#P<0.05；與6-OHDA處理的空載體組比較：*P<0.05

3 討論

在各種病毒載體中，慢病毒載體具有將外源基因有效整合到宿主染色體上，因而可以持久性表達(dá)，同時，慢病毒載體還具有安全性高的特點[9]。本研究利用慢病毒載體建立穩(wěn)定高表達(dá)Eya1的細(xì)胞株，為研究Eya1基因在多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

本研究將構(gòu)建的Eya1過表達(dá)的穩(wěn)定感染的MES23.5細(xì)胞株及其空載體對照組細(xì)胞株給予6-OHDA處理2 h，構(gòu)建DA能神經(jīng)細(xì)胞的損傷模型。研究結(jié)果顯示，6-OHDA作用2 h時MES23.5細(xì)胞的活性降低了約50%，故選擇6-OHDA作用2 h，便于觀察Eya1過表達(dá)對損傷的細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。CCK-8檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)Eya1組的細(xì)胞活力明顯高于空載體對照組，這說明Eya1對損傷的MES23.5細(xì)胞具有保護(hù)作用。Hoechst 33258染色結(jié)果表明Eya1是通過拮抗細(xì)胞凋亡的作用發(fā)揮了對細(xì)胞的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡的主要途徑有死亡受體途徑和以線粒體為主的內(nèi)源性凋亡，線粒體信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起著重要的作用。線粒體凋亡途徑上Bcl-2蛋白家族作為參與細(xì)胞凋亡的核心家族，對凋亡的調(diào)控意義尤為突出[10]。在Bcl-2蛋白家族中Bcl-2是起主要作用的抗凋亡蛋白，有證據(jù)表明Bcl-2家族蛋白的功能與多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育密切相關(guān)，Bax是重要的促凋亡蛋白。正常情況下，腦組織神經(jīng)細(xì)胞處于抗凋亡與促凋亡相對平衡狀態(tài)。Bcl-2高表達(dá)狀態(tài)是為了阻止細(xì)胞凋亡，起到一種生理性神經(jīng)自我保護(hù)作用，而Bax高表達(dá)狀態(tài)則是促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，起到一種病理學(xué)破壞作用[11-12]。本研究在應(yīng)用Hoechst 33258法檢測細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，同步應(yīng)用Western blot方法對Bcl-2和Bax蛋白進(jìn)行檢測，進(jìn)一步證實了Eya1在損傷的細(xì)胞中具有拮抗細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)果顯示過表達(dá)Eya1組的Bcl-2表達(dá)明顯高于空載體組，Bax蛋白表達(dá)明顯低于空載體組。然而，本研究中課題組發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，即6-OHDA處理后的空載體組中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平與對照組相比增高，而不是降低。造成這種現(xiàn)象的原因可能為受損早期的細(xì)胞啟動自身的應(yīng)激性保護(hù)機制，調(diào)用自身抗凋亡系統(tǒng)來抵抗藥物造成的損傷。這也與本課題組前期研究[8]結(jié)果相一致，即在6-OHDA作用1～3 h時，Eya1表達(dá)一過性增高，以保護(hù)受損的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞。

綜上所述，該研究構(gòu)建了Eya1過表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體及Eya1穩(wěn)定表達(dá)的MES23.5細(xì)胞株，表明過表達(dá)Eya1通過調(diào)控Bcl-2、Bax表達(dá)，拮抗6-OHDA誘導(dǎo)的MES23.5多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。該研究為課題組進(jìn)一步開展Eya1基因在帕金森病中的功能和作用機制研究奠定了重要基礎(chǔ)。