劉興奮*， 孫 棋， 王 蕾， 黃艷琴， 范曲立

(南京郵電大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，有機(jī)電子與信息顯示國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物傳感材料與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210023)

核酸適配體(Aptamer,Apt)是人工合成的一小段單鏈DNA或RNA，對目標(biāo)物質(zhì)具有高度親和力和特異性。核酸適配體可通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)，從含有隨機(jī)核苷酸的單鏈核酸分子文庫中篩選得到[1,2]。迄今為止，已報道了各種目標(biāo)物質(zhì)的核酸適配體，包括金屬離子(K+、Pb2+、Na+、Sr2+)[3 - 6]、有機(jī)小分子(ATP、L-精氨酸)[7,8]、蛋白質(zhì)(腫瘤標(biāo)志物、凝血酶、干擾素、血管內(nèi)皮生長因子)[9 - 12]、癌細(xì)胞[13]和微生物(如炭疽病毒)[14]等。與抗體蛋白相比，核酸適配體分子量小，易于化學(xué)合成和修飾，穩(wěn)定性高且成本較低，可克服抗體在應(yīng)用中存在的局限性[15]。目前，核酸適配體已被廣泛用于生物分析、細(xì)胞成像、藥物遞送、靶向治療、食品污染檢測等領(lǐng)域[16 - 20]。近年來，研究者們將各種納米材料和技術(shù)與核酸適配體相結(jié)合，開展了廣泛深入的研究。Yuan課題組[21]開發(fā)了一系列可持續(xù)發(fā)光的納米材料，并用核酸適配體進(jìn)行功能化，可有效降低生物基質(zhì)的自熒光，提高血清中靶物質(zhì)檢測的靈敏度和腫瘤成像的分辨率。Yang課題組[22]構(gòu)建了一種多價適配體功能化的微流控生物芯片，可以有效提高對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲和釋放效率。Qi等[23]將適配體修飾在DNA四面體納米籠上，并將藥物阿霉素包裹在籠內(nèi)，這種納米藥物不僅提高了藥物的選擇性，而且降低了對生物體系的毒性，安全性更好。Lin課題組[24]構(gòu)建了基于DNA四面體的負(fù)載抗癌藥物5-氟尿嘧啶的新型納米藥物，有效提高了乳腺癌治療的靶向性和療效。

腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)是生命體系的能量分子，在細(xì)胞代謝和生化反應(yīng)中都起著重要作用。目前，已報道的各種基于核酸適配體的ATP檢測方法，如熒光法、比色法、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、表面增強(qiáng)拉曼散射、表面等離子體共振等[25 - 28]，大多是基于完整核酸適配體設(shè)計的。然而，未拆分的核酸適配體鏈相對較長，容易形成鏈內(nèi)或鏈間二級結(jié)構(gòu)，影響其與ATP的結(jié)合。研究者發(fā)現(xiàn)，將完整核酸適配體拆分為兩條較短的拆分型適配體，并對序列進(jìn)行合理設(shè)計，可構(gòu)建類似或完全不同于完整核酸適配體的傳感策略，在一定程度上彌補(bǔ)完整適配體在應(yīng)用中的不足[29 - 34]。

熒光分析是一種靈敏度高、選擇性好的生物傳感檢測方法。然而，由于引起熒光猝滅的因素較多(如溶劑、pH、溫度等)，“turn-off ”模式的熒光分析容易出現(xiàn)假陽性問題，特別是在檢測復(fù)雜體系和細(xì)胞內(nèi)生物分子時，其靈敏度和特異性還有待于提高。因此，亟需開發(fā)新型的熒光“turn-on”模式的簡便、快速且高靈敏度的生物分析方法，實(shí)現(xiàn)對血清、尿液、唾液等實(shí)際樣品中靶物質(zhì)的檢測。硫代黃素T(Thioflavin T,ThT)是一種苯并噻唑鹽熒光染料，具有獨(dú)特的熒光性質(zhì)。當(dāng)其以游離狀態(tài)存在時，可發(fā)射非常微弱的熒光；然而，當(dāng)其嵌入G -四鏈體結(jié)構(gòu)時，由于分子內(nèi)C-C單鍵的旋轉(zhuǎn)受限，使其分子呈平面化，熒光顯著增強(qiáng)。目前，ThT已被作為一種對核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有高度選擇性的熒光染料[35 - 37]，用于各種無標(biāo)記熒光探針的設(shè)計及光學(xué)生物傳感分析。本研究中，我們構(gòu)建一種基于拆分型核酸適配體和ThT的熒光“turn-on”模式的檢測方法，通過比較三組拆分型核酸適配體探針的熒光光譜，篩選出一組性能優(yōu)異的探針，成功實(shí)現(xiàn)了對復(fù)雜體系中ATP的快速、靈敏、無標(biāo)記檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu RF-6000熒光分光光度計(日本，島津公司)用于熒光光譜檢測。熒光光譜測量條件：氙燈激發(fā)，激發(fā)波長440 nm，掃描范圍460～650 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。所有樣品的測定均在室溫進(jìn)行。K30干式恒溫器(奧盛儀器有限公司(杭州))用于加熱。

寡核苷酸由上海生工生物工程股份有限公司合成，并通過高效液相色譜(HPLC)純化。三組ATP的拆分型核酸適配體的堿基序列見表1。腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、鳥苷三磷酸(GTP)和脫氧核苷酸混合物(dNTPs)，均購自上海生工生物工程股份有限公司。硫代黃素T(ThT)購自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司。胎牛血清(Gibco)購自KeyGen生物(南京)有限公司。所有緩沖溶液均使用Milli-Q水(18.2 MΩ·cm)配制。緩沖溶液Ⅰ(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.0)用于DNA溶液的配制和稀釋。緩沖溶液Ⅱ(5 mmol/L MgCl2,15 mmol/L KCl,100 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH=7.4)用于ATP、核酸適配體和ThT之間的反應(yīng)，以及后續(xù)的熒光光譜檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA預(yù)處理為去除核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)，在使用前對核酸適配體溶液進(jìn)行預(yù)處理。將4 μL 10 μmol/L的DNA溶液與一定體積緩沖溶液Ⅱ，在95 ℃加熱5 min，然后在冰上孵育10 min。

1.2.2 可行性分析三組拆分型核酸適配體對ATP的初步檢測。在預(yù)處理的Apt-1/Apt-2、Apt-3/Apt-4、Apt-5/Apt-6中，分別加入4 μL 100 μmol/L的ThT溶液。一組作為空白，另一組加入4 μL 100 mmol/L的ATP作為陽性對照。加入緩沖溶液 Ⅱ 至反應(yīng)體積為100 μL，37 ℃孵育60 min。最后再加入一定體積的緩沖溶液Ⅱ至400 μL，在440 nm激發(fā)波長下測量熒光光譜。以下所有實(shí)驗(yàn)中，ThT的用量及后續(xù)反應(yīng)溫度和時間均與該實(shí)驗(yàn)中相同。

拆分型核酸適配體與ThT之間的相互作用研究。在預(yù)處理的Apt-1、Apt-2和Apt-1/Apt-2中分別加入4 μL 100 μmol/L的ThT溶液。37 ℃孵育60 min，然后進(jìn)行熒光檢測。

1.2.3 特異性分析向預(yù)處理的Apt-1/Apt-2溶液中，分別加入4 μL 100 mmol/L的ATP、GTP、CTP、UTP和dNTPs，然后再加入ThT溶液和緩沖溶液Ⅱ。37 ℃孵育60 min后進(jìn)行熒光檢測。只含有Apt-1/Apt-2和ThT的樣品作為空白對照。

1.2.4 靈敏度分析向預(yù)處理的Apt-1/Apt-2溶液中，加入濃度為100 mmol/L的ATP溶液，體積分別為0、0.2、0.4、0.5、2、3、4 μL，然后再加入ThT溶液和緩沖溶液Ⅱ進(jìn)行反應(yīng)。其他實(shí)驗(yàn)過程與可行性分析中一致，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.5 10%血清中ATP的檢測血清體系中ATP的初步檢測。在緩沖溶液Ⅱ中加入一定量胎牛血清，配制含10%血清的緩沖溶液Ⅱ。向預(yù)處理的Apt-1/Apt-2中加入4 μL 100 mmol/L的ATP溶液，然后加入ThT和一定體積含10%血清的緩沖溶液Ⅱ。37 ℃孵育60 min，加入一定體積含10%血清的緩沖溶液Ⅱ至400 μL，進(jìn)行熒光光譜測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感策略

基于拆分型核酸適配體和ThT熒光“turn-on”模式的ATP檢測原理如圖1所示。Apt-1和Apt-2為將完整核酸適配體進(jìn)行拆分，并對堿基序列進(jìn)行優(yōu)化的兩段DNA，作為識別靶分子ATP的探針。ThT為可特異性結(jié)合G -四鏈體的熒光染料，作為光學(xué)報告基團(tuán)。當(dāng)體系中只有Apt-1、Apt-2和ThT時，由于Apt-1和Apt-2均為富G序列，在ThT的誘導(dǎo)下，兩段DNA鏈可分別形成含少量G4片層的分子內(nèi)G -四鏈體。嵌入G -四鏈體片層的ThT分子的數(shù)量與G4片層的數(shù)量成正比，此時體系熒光較弱。當(dāng)體系中存在ATP時，由于ATP與適配體分子之間具有更高的親和力和特異性[38]，會形成由Apt-1、ATP、Apt-2構(gòu)成的分子間G -四鏈體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)含有更多G4片層，因而嵌入ThT分子的數(shù)量更多，體系的熒光顯著增強(qiáng)。因此，通過檢測體系的熒光變化，可實(shí)現(xiàn)對靶分子ATP的簡便、快速和特異性檢測。

圖1 (A)基于拆分型核酸適配體與硫代黃素T(ThT)的ATP檢測原理圖;(B)ThT的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 (A) Scheme of ATP detection strategy based on split aptamer and ThT;(B) Chemical structure of ThT

2.2 可行性分析

首先，對拆分型核酸適配體探針的序列進(jìn)行優(yōu)化。共設(shè)計三組拆分型適配體：末端分別添加兩組GGG序列的探針Apt-1和Apt-2；未添加任何序列的直接拆分型適配體Apt-3和Apt-4；末端分別添加一組GGG序列和三組GGG序列的探針Apt-5和Apt-6。三組探針的堿基序列、堿基數(shù)量和G含量如表1所示。

分別用三組探針對ATP進(jìn)行初步檢測。如圖2A所示，用Apt-3和Apt-4進(jìn)行ATP檢測時，空白組和加入ATP的實(shí)驗(yàn)組的熒光信號都非常弱，表明無論是否存在ATP分子，探針都不能形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)。這是由于Apt-3和Apt-4的DNA鏈較短且串聯(lián)重復(fù)的G序列較少的緣故。用Apt-5和Apt-6進(jìn)行ATP檢測時，空白組熒光非常強(qiáng)，加入ATP的實(shí)驗(yàn)組熒光增強(qiáng)幅度較小，約為13%，尚未達(dá)到能與空白顯著區(qū)分的程度。這是由于Apt-6的G含量相對較高且有較多的串聯(lián)重復(fù)G堿基存在，其自身很容易形成G -四鏈體，導(dǎo)致空白背景信號較高。相比而言，用Apt-1和Apt-2檢測ATP時(圖2B)，空白組熒光較弱，陽性對照組熒光信號明顯增強(qiáng)，二者具有顯著差異，有望用于ATP的特異性檢測。

進(jìn)一步研究了Apt-1、Apt-2及Apt-1/Apt-2分別與ThT相互作用后體系熒光的變化。如圖2C所示，游離的ThT幾乎不發(fā)射熒光，這是由于分子內(nèi)C-C單鍵的旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生無輻射衰減，導(dǎo)致熒光猝滅的緣故。單獨(dú)的Apt-1、Apt-2由于可形成少量分子內(nèi)G4片層，ThT嵌入G -四鏈體后熒光有一定程度增強(qiáng)。當(dāng)Apt-1和Apt-2與ThT共同作用后，與單獨(dú)的Apt-1/ThT和Apt-2/ThT體系相比，熒光增強(qiáng)幅度非常小，表明ThT分子本身并不能誘導(dǎo)Apt-1和Apt-2形成分子間G -四鏈體。然而，向該體系中加入靶物質(zhì)ATP后，由于ATP誘導(dǎo)的分子間G -四鏈體的形成，熒光強(qiáng)度可增強(qiáng)至原來的2倍(圖2B)。此外，以單獨(dú)的Apt-1或Apt-2為探針，對ATP進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，與Apt-1/Apt-2/ThT/ATP體系相比，Apt-1/ThT/ATP和Apt-2/ThT/ATP體系的熒光都非常弱，表明單獨(dú)的Apt-1或Apt-2探針不能用于ATP檢測，只有Apt-1和Apt-2同時存在時才可以特異性識別并結(jié)合ATP?；谏鲜龇治?，以Apt-1、Apt-2為優(yōu)選探針，進(jìn)一步研究其在ATP檢測方面的綜合性能。

圖2 Apt-3/Apt-4和Apt-5/Apt-6(A)、Apt-1/Apt-2(B)檢測ATP的熒光光譜圖；Apt-1、Apt-2和 Apt-1/Apt-2分別與ThT作用后的熒光光譜圖(C)Fig.2 Fluorescence spectra for ATP detection based on Apt-3/Apt-4 and Apt-5/Apt-6(A),Apt-1/Apt-2(B);Fluorescence spectra for ThT,Apt-1/ThT,Apt-2/ThT,and Apt-1/Apt-2/ThT(C)

2.3 特異性分析

為了研究該方法檢測靶物質(zhì)ATP的特異性，將鳥苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)作為陰性對照進(jìn)行檢測，三者在體系中的濃度與ATP相同，均為1 mmol/L。此外，對脫氧核苷酸混合物(dNTPs)中的ATP也進(jìn)行了檢測，以初步分析該方法在復(fù)雜體系中檢測靶物質(zhì)的性能。如圖3所示，空白組和三個對照組GTP、CTP和UTP體系的熒光強(qiáng)度都比較低。而實(shí)驗(yàn)組ATP和dNTPs體系的熒光信號都顯著增強(qiáng)。表明拆分型核酸適配體對ATP具有高度選擇性。由于dNTPs中除了含有GTP、CTP和TTP以外，也含有相同濃度的ATP，因此具有顯著的熒光響應(yīng)。進(jìn)一步對腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)進(jìn)行檢測的結(jié)果顯示，ADP和AMP的熒光信號分別為ATP信號的60%和39%，表明該方法對ADP和AMP的區(qū)分程度與文獻(xiàn)報道[39]一致。上述研究證明，這種基于拆分型核酸適配體的方法對ATP檢測的特異性和選擇性都較高，其他核苷酸的存在對其檢測的干擾很小。

圖3 基于Apt-1/Apt-2和ThT的ATP、GTP、CTP、UTP和dNTPs檢測Fig.3 Detection of ATP,GTP,CTP,UTP,and dNTPs based on Apt-1/Apt-2 and ThT

2.4 靈敏度分析

緩沖溶液中不同濃度ATP(0、50、100、125、500、750、1 000 μmol/L)的檢測結(jié)果如圖4所示。隨著ATP濃度在0～1 000 μmol/L范圍內(nèi)的逐漸增大，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增加，表明ATP濃度與熒光強(qiáng)度之間呈正相關(guān)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在ATP濃度為0～500 μmol/L范圍內(nèi)，熒光信號與ATP的濃度之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y=0.66x+364.38(R2=0.9640)。其中y代表熒光強(qiáng)度值，x代表ATP的濃度(μmol/L)。根據(jù)3σ規(guī)則，計算得出在緩沖溶液中檢測ATP的檢測限為220 μmol/L。

圖4 ATP濃度(0～1 000 μmol/L)與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系圖(插圖中ATP濃度為0～500 μmol/L)Fig.4 Relationship between the concentration of ATP(0-1000 μmol/L) and fluorescence intensity(Inset:concentration of ATP is 0 - 500 μmol/L)

2.5 10%血清中ATP的檢測及靈敏度分析

為了進(jìn)一步評價該方法的實(shí)用性，對稀釋血清樣品中的ATP進(jìn)行了分析檢測。首先，比較和分析了緩沖溶液和血清體系中相同濃度ATP檢測的熒光光譜，如圖5A所示。與緩沖溶液中ATP檢測的熒光信號相比，在10%胎牛血清中進(jìn)行同一濃度的ATP檢測時，空白組和實(shí)驗(yàn)組的熒光信號都有升高。這是由于血清中含有的K+、Na+、Pb2+及凝血酶也可誘導(dǎo)富G序列形成G -四鏈體，因而會有更多的ThT分子嵌入G -四鏈體而發(fā)光[3,10,38]。值得注意的是，與空白組相比，加入ATP的陽性組的熒光強(qiáng)度仍可增加至空白的2倍多，初步表明該方法可以用于血清中靶物質(zhì)的檢測。其次，對10%血清體系中不同濃度的ATP(0、25、50、100、150、350、500、750、1 000 μmol/L)進(jìn)行了檢測。在0～1 000 μmol/L濃度范圍內(nèi)，體系的熒光信號隨ATP濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，如圖5B所示。在0～100 μmol/L范圍內(nèi)呈快速增加趨勢；在100～1 000 μmol/L范圍內(nèi)增速較緩慢。進(jìn)一步對更低濃度范圍的ATP(0、1、5、10、15、20、25、30、35、40 μmol/L)進(jìn)行了檢測(圖5C)。結(jié)果顯示，ATP濃度在15～40 μmol/L范圍內(nèi)，熒光信號基本趨于穩(wěn)定；而在0～15 μmol/L濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與ATP濃度之間具有較好的線性關(guān)系，其回歸方程為：y=17.27x+434.56(R2=0.9358)。根據(jù)3σ原則，計算得出10%血清體系中對ATP的檢測限為2.2 μmol/L。以上結(jié)果表明，成分復(fù)雜的血清體系中干擾物質(zhì)的存在不僅沒有影響對ATP的檢測，而且與緩沖溶液中相比，對ATP檢測的靈敏度提高了兩個數(shù)量級。原因可能是血清體系中的離子環(huán)境更適于ATP與核酸適配體之間的特異性結(jié)合，形成的G -四鏈體更穩(wěn)定，嵌入的ThT分子更多，體系的熒光信號更強(qiáng)，從而使靈敏度有一定程度的提高。

圖5 (A)緩沖溶液和10%血清中ATP檢測的熒光光譜對比；(B)10%血清中高濃度ATP(0～1 000 μmol/L)檢測結(jié)果；(C)10%血清中低濃度ATP(0～40 μmol/L)檢測結(jié)果(插圖中ATP濃度為0、1、5、10、15 μmol/L)Fig.5 (A) Comparison of ATP detection in buffer and 10% FBS;(B) Detection of ATP at high concentrations(0 - 1 000 μmol/L) in 10% FBS；(C) Detection of ATP at low concentrations(0 - 40 μmol/L)(Inset:concentration of ATP is 0,1,5,10,15 μmol/L,respectively)

2.6 方法的回收率實(shí)驗(yàn)

對10%血清體系中的ATP進(jìn)行了檢測和回收實(shí)驗(yàn)分析。如表2所示，當(dāng)ATP的加標(biāo)濃度為5、7.5、10 μmol/L時，其加標(biāo)回收率位于95%～105%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4%～7%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和良好的穩(wěn)定性。

表2 10%血清體系中的加標(biāo)回收率分析(n=3)

2.7 不同分析方法的比較

比較分析了文獻(xiàn)報道的幾種基于核酸適配體與ThT的ATP熒光檢測方法(表3)。這幾種方法雖然具有較高的靈敏度，但無論是基于完整適配體還是拆分型適配體，其傳感原理都是“turn-off ” 模式的光學(xué)檢測，實(shí)際樣品中的復(fù)雜組分可能會對檢測結(jié)果造成干擾。相比而言，本研究中建立的基于優(yōu)化拆分型核酸適配體的方法，不僅實(shí)現(xiàn)了“turn-on” 模式的靶物質(zhì)分析，而且在復(fù)雜的血清體系中表現(xiàn)出更優(yōu)異的檢測性能。

表3 幾種基于核酸適配體和硫代黃素T的ATP熒光檢測方法比較

3 結(jié)論

本研究中，我們報道了一種熒光“turn-on”模式且無需標(biāo)記的ATP檢測新方法。該方法利用熒光染料ThT對G -四鏈體具有高度選擇性的特點(diǎn)，合理優(yōu)化了拆分型核酸適配體的DNA序列，實(shí)現(xiàn)了對靶物質(zhì)的快速、靈敏、低成本檢測。此外，這種方法還具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值，用于稀釋血清中的ATP檢測時，具有良好的抗干擾性和更高的靈敏度，在化學(xué)與生物傳感、臨床檢驗(yàn)與分析檢測等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用潛力。