龔 云,劉曉莉，喬德才*

(1.北京師范大學(xué) 體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100875；2.西北師范大學(xué) 體育學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

突觸是神經(jīng)元之間的信息聯(lián)系節(jié)點(diǎn)，在諸多突觸類型中，軸-樹突觸最為常見，軸-樹突觸實(shí)質(zhì)為軸突終末與樹突棘形成的突觸聯(lián)系結(jié)構(gòu).樹突表面的微小棘狀突起稱為樹突棘，是突觸后結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，其可塑性變化主要體現(xiàn)在形態(tài)和功能上[1].樹突棘中豐富的細(xì)胞骨架—微絲與微管決定其形態(tài)及功能變化，它們在樹突棘可塑性中扮演重要角色[2].研究發(fā)現(xiàn)，在不同發(fā)育階段及學(xué)習(xí)記憶過程中，樹突棘均會(huì)發(fā)生可塑性變化[3].運(yùn)動(dòng)疲勞是制約體育成績或健身功效的關(guān)鍵因素.紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)的重要核團(tuán)，在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)調(diào)控環(huán)路中具有重要作用.Yasuyuki等[4]研究發(fā)現(xiàn)，跑步運(yùn)動(dòng)通過改變患者紋狀體樹突棘形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高其運(yùn)動(dòng)能力.Christoffel等[5]通過調(diào)節(jié)特定神經(jīng)元的活性改變樹突棘的可塑性.陳巍等[6]的研究顯示，運(yùn)動(dòng)疲勞可以使中等棘狀神經(jīng)元樹突棘的密度產(chǎn)生顯著變化.但這種變化的內(nèi)在機(jī)制與細(xì)胞骨架之間的關(guān)聯(lián)研究較少.鑒于此，文中通過7 d重復(fù)力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，建立運(yùn)動(dòng)疲勞模型，觀測樹突棘數(shù)量、形態(tài)變化及F-actin,MAP2,Tau基因表達(dá)情況，以期從細(xì)胞骨架視角探討運(yùn)動(dòng)疲勞引起大鼠紋狀體神經(jīng)元樹突棘可塑性變化的機(jī)制，為深入揭示運(yùn)動(dòng)性疲勞中樞機(jī)制積累分子水平的科學(xué)事實(shí).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

隨機(jī)選用Wistar成年雄性大鼠20只，體重185～200 g，購于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(甘)2018-0002)，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料(繁育級(jí))喂養(yǎng)、自由飲食、分籠飼養(yǎng)、自然光照，溫度22～23 ℃，濕度35%～40%，紫外線定期照射實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)器具.

1.2 分組、建模與取材

適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)將大鼠分為2組：對(duì)照組(CG)和實(shí)驗(yàn)組(PG)，后置跑臺(tái)(BCPT-96，中國杭州)上運(yùn)動(dòng)適應(yīng)3 d.在Bedford方法[7]的基礎(chǔ)上，對(duì)常用的遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案[8]予以改良：Ⅰ級(jí)負(fù)荷：速度15 m·min-1(30 min)；Ⅱ級(jí)負(fù)荷：速度20 m·min-1(30 min)；Ⅲ級(jí)負(fù)荷：速度25 m·min-1(60 min)，前6 d按既定負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，第7 d由第Ⅲ級(jí)負(fù)荷運(yùn)動(dòng)至力竭.力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：不能維持預(yù)定跑速，滯留跑道后擋板不動(dòng)，光、電、聲刺激及驅(qū)趕均無效，并伴有呼吸急促、俯臥、垂頭不起等行為表現(xiàn).第7 d力竭后即刻，各組大鼠行腹腔注射麻醉(0.4%戊巴比妥鈉)，心尖真空管抽血測試血糖(日本會(huì)好血糖儀)，后迅速剝?nèi)≌X、沿縱裂切分為二，用生理鹽水沖洗(>3次)表面血漬，左側(cè)置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h以上，高爾基染色備用；參照鼠腦圖譜剝離兩組大鼠右側(cè)紋狀體(圖1)，濾紙吸干表面水分、錫紙包裹后置于液氮罐冷藏供qRT-PCR備用.

1.3 高爾基染色、切片及拍照

取固定好的左側(cè)腦組織用生理鹽水漂洗3次，后置于裝有高爾基染液的容器中，放置在陰涼通風(fēng)避光處，48 h后換新染液,后每3 d換1次，第14 d將組織塊取出，先置于15%的蔗糖溶液中(4 ℃避光)脫水1 d，后置于30%的蔗糖溶液中(4 ℃、 避光)再脫水；2 d后將組織塊取出，先用蒸餾水沖洗1 min，后用濃氨水浸泡30～45 min，再用蒸餾水洗1 min，定影液處理30～45 min后，蒸餾水再?zèng)_洗1 min.后將組織塊置于30%的蔗糖溶液中(4℃、 避光)脫水2～3 d，冰凍切片機(jī)(CryoStar NX50)切片(100 μm)，撈片、貼片后用梯度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片.最后用Motic數(shù)碼顯微鏡(BA400/450，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)鏡檢并拍照(圖1)，每組分別拍攝400×,800×照片各10張.

a 電子圖譜，黑框?yàn)橛^測部位；b 高爾基染色切片，黑框?yàn)殓R檢及拍照部位

1.4 圖像分析

運(yùn)用Image J軟件分析樹突棘密度：將Golgi染色顯微照片(400×)用Image J軟件打開并選取任意部位，校對(duì)標(biāo)尺，截取適當(dāng)長度(像素131×152)的樹突(圖2a)進(jìn)行灰度化(圖2b)、二值化(圖2c)、 骨骼化(圖2d)處理， 計(jì)算樹突棘密度及長度.在800×照片上，運(yùn)用Image J軟件統(tǒng)計(jì)樹突棘的類型.

a 樹突；b 樹突灰變化；c 樹突二值化；d 樹突骨骼化

1.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

1.5.1 總RNA抽提及檢測 將兩組大鼠右側(cè)紋狀體從液氮罐中取出并復(fù)溫，采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟操作.使用超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)檢測RNA濃度及純度：儀器調(diào)零后取2.5 μl待測RNA溶液置檢測基座上，放下樣品臂，使用電腦自帶軟件檢測吸光值，測定樣品在260 nm/280 nm的吸光值以評(píng)定RNA的質(zhì)量.

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄 取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液，再加入 1 μL oligo(dT)18，用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12 μL；先置PCR儀上保溫5 min (65 ℃)，后置冰上冷卻；依次加入4 μL (5× Reaction Buffer), 2 μL (10 mmol·L-1dNTP Mix),1 μL (RiboLock RNAase抑制劑,20 U·μL-1和1 μL RevertAi M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U·μL-1)，用槍抽吸混勻；于PCR儀上42 ℃保溫60 min，結(jié)束后70 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶.

1.5.3 qRT-PCR引物設(shè)計(jì) 運(yùn)用Primer軟件對(duì)目的基因的mRNA序列進(jìn)行檢索，遵循qRT-PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物見表1.

表1 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)

1.5.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 取0.2 mL PCR管，配制反應(yīng)體系(表2)，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管.PCR擴(kuò)增：預(yù)變性(95 ℃，10 min)、變性(95 ℃，15 s)、退火延伸(60 ℃，60 s)，循環(huán)40次.用比較Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量(2-△△Ct).

表2 實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR反應(yīng)體系

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(M±DS)表示.定量數(shù)據(jù)差異比較采用t檢驗(yàn)，定類數(shù)據(jù)差異比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有顯著性意義，P<0.01表示差異有非常顯著性意義，用GraphPad Prism 6.01作圖.

2 結(jié)果

2.1 體重及血糖

體重與血糖是運(yùn)動(dòng)性疲勞的常用觀測指標(biāo).實(shí)驗(yàn)前、后兩組大鼠體重及血糖變化見表3.

表3 實(shí)驗(yàn)前、后大鼠體重及血糖變化(N=10)

注：▲表示P<0.05,與實(shí)驗(yàn)前本組大鼠比較；◆表示P<0.05,與實(shí)驗(yàn)后CG組大鼠比較.

由表3可見，重復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)7d后，兩組大鼠體重、血糖均較本組實(shí)驗(yàn)前顯著上升(P<0.05)；且實(shí)驗(yàn)后，PG組血糖較CG組顯著升高(P<0.05)，體重組間差異不顯著.

2.2 樹突棘觀測

2.2.1 樹突棘分型 樹突棘形態(tài)呈現(xiàn)多樣性(圖3a)，依據(jù)大小和形狀可分為：蘑菇型(Mushroom)、短粗型(Stubby)、細(xì)長型(Thin)和分叉型(Branch)4種類型[10].

a 樹突棘形態(tài)，800×；b 實(shí)驗(yàn)組樹突棘，400×；c 對(duì)照組樹突棘，400×

每組隨機(jī)選取10個(gè)視野(800×)，運(yùn)用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)4種類型樹突棘的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)百分比后進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果見表4.

表4 兩組大鼠紋狀體神經(jīng)元樹突棘分型百分比(n=10)

依據(jù)表4結(jié)果，運(yùn)用GraphPad Prism 6.01作圖，結(jié)果見圖4.

圖4 兩組大鼠樹突棘類型百分比

由表4和圖4可知，第7 d力竭后即刻，PG組細(xì)長型占比盡管較CG組有所升高，分叉型較CG組有所下降，但都不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).短粗型占比較CG組大鼠下降非常顯著(P<0.01)，蘑菇型占比較CG組大鼠升高非常顯著(P<0.01).

2.2.2 樹突棘密度 樹突棘的密度即單位長度內(nèi)樹突棘的個(gè)數(shù)，密度的變化不僅反應(yīng)局部神經(jīng)環(huán)路的調(diào)整，還直接影響神經(jīng)元間信息傳遞的效率，也可體現(xiàn)神經(jīng)元信息儲(chǔ)藏及傳遞的能力.本實(shí)驗(yàn)樹突棘密度分別以1 μm及10 μm長度內(nèi)的個(gè)數(shù)來統(tǒng)計(jì)(見表5， 圖3b,3c).

表5 兩組大鼠單位長度內(nèi)樹突棘密度的變化(M±SD， n=10)

由表5和圖3b,3c可知，與CG組相比，PG組大鼠紋狀體神經(jīng)元樹突棘數(shù)量及密度顯著增高(P<0.05)樹突棘平均長度在兩組之間無顯著性差異(P>0.05).

2.3 qRT-PCR

2.3.1 總RNA濃度及純度檢測 若OD260/280的比值在1.8～2.1視為抽提的RNA溶液純度很高.由表6可見，本次實(shí)驗(yàn)抽提的總RNA介于1.8～2.1，說明純度很高，無蛋白質(zhì)污染.

表6 兩組大鼠紋狀體RNA濃度及純度測定結(jié)果

2.3.2 qRT-PCR反應(yīng)結(jié)果 經(jīng)qRT-PCR反應(yīng)，以比較ΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，兩組各基因擴(kuò)增結(jié)果見表7.依據(jù)表7結(jié)果，運(yùn)用GraphPad Prism 6.01作圖，結(jié)果見圖5.由表7和圖5可知，運(yùn)用比較ΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以Ct均值和2-ΔΔCt呈現(xiàn)，結(jié)果顯示,PG組三種基因的表達(dá)量分別是CG組的1.33,1.06和1.71倍.

表7 兩組大鼠紋狀體神經(jīng)元3種基因Ct均值及相對(duì)表達(dá)量

圖5 兩組大鼠3種基因擴(kuò)增倍數(shù)

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)性疲勞后體重及血糖變化

現(xiàn)已知，中樞神經(jīng)系統(tǒng)無法充分驅(qū)動(dòng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性是造成肌肉工作能力下降的主要原因[11-12].哺乳動(dòng)物大腦皮質(zhì)與基底神經(jīng)節(jié)之間存在三條環(huán)路聯(lián)系，在這些環(huán)路聯(lián)系上，紋狀體依然具有承上啟下的核心地位.紋狀體以中等棘狀神經(jīng)元占優(yōu)勢比例，與大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)、黑質(zhì)、丘腦底核等核團(tuán)聯(lián)系廣泛而密切.眾所周知，突觸是神經(jīng)元間信息傳遞的關(guān)健敏感部位，其可塑性變化必然牽涉大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元向下發(fā)放神經(jīng)沖動(dòng)的頻次和強(qiáng)度，造成下行錐體束支皮質(zhì)脊髓束等的傳遞效率下降，從而影響其驅(qū)動(dòng)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的效果，或可造成肌肉工作能力的下降.侯莉娟等[13]的研究提示：隨著運(yùn)動(dòng)疲勞程度的加深，大鼠紋狀體神經(jīng)元突觸后致密物質(zhì)(PSD)厚度逐漸減小，但與PSD-95蛋白表達(dá)無相關(guān)性.在運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生機(jī)制的諸多學(xué)說中，保護(hù)性抑制學(xué)說倍受青睞，或與運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生的中樞機(jī)制更為貼近.

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，第7 d力竭運(yùn)動(dòng)后，體重在兩組之間沒有顯著性差異，這與本組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，但血糖水平實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組顯著升高，與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反.目前，運(yùn)動(dòng)與血糖水平變化方面研究結(jié)果尚不統(tǒng)一.有研究顯示，力竭運(yùn)動(dòng)過程中大鼠血糖水平呈顯著降低走勢[14]，相反的研究結(jié)果提示，大鼠負(fù)重游泳至力竭時(shí)血糖水平升高[15]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.也有研究顯示，力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠血糖濃度幾乎無變化[16].機(jī)體內(nèi)降低血糖水平的唯一激素是胰島素，外周骨骼肌、脂肪等組織有兩條途徑調(diào)控血糖水平：即胰島素依賴途徑與非胰島素依賴途徑，且前者為主要途徑.而紋狀體神經(jīng)元在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，多依賴非胰島素途徑調(diào)控血糖[17]，力竭運(yùn)動(dòng)作為應(yīng)激刺激，不能有效激活胰島素受體相關(guān)的信號(hào)分子，譬如磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、鈣離子(Ca2+)、蛋白激酶C(PKC)等，導(dǎo)致胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3(GLUT3)不能有效及時(shí)進(jìn)行膜轉(zhuǎn)位，造成葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)遲滯，從而血糖水平不降反升.

3.2 運(yùn)動(dòng)疲勞后樹突棘數(shù)量及形態(tài)變化

樹突棘是興奮性神經(jīng)元樹突分支上的微小突起.樹突棘與突觸超微結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，是絕大多數(shù)興奮性突觸在體條件下的突觸后結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，包括膨大的棘頭和狹窄的棘頸[18]，可將興奮性突觸的PSD和相關(guān)的細(xì)胞器包裹在樹突棘的局部范圍內(nèi)，使其成為一個(gè)相對(duì)獨(dú)立于樹突支干的電信號(hào)和生化信號(hào)單元[19].在哺乳動(dòng)物的生命周期中，大腦樹突棘的密度呈現(xiàn)高度的動(dòng)態(tài)變化特征，先后經(jīng)歷發(fā)生、修剪、成熟、消失4個(gè)階段[20].這種密度的動(dòng)態(tài)性變化隱含著神經(jīng)環(huán)路的強(qiáng)化、弱化及調(diào)整，是突觸可塑性的重要表現(xiàn)，與之相伴隨的是形態(tài)結(jié)構(gòu)的多樣性，一般認(rèn)為短粗型和蘑菇型是成熟型樹突棘，常參與突觸后結(jié)構(gòu)的重塑.

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，第7 d力竭運(yùn)動(dòng)后，實(shí)驗(yàn)組大鼠樹突棘密度及數(shù)量顯著增加(P<0.05)，而樹突棘平均長度在兩組之間無顯著性差異(P>0.05).李曉康等[21]的研究提示，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)刺激可引起大鼠中央杏仁核神經(jīng)元樹突棘數(shù)量增加.白石等[22]實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8 W循環(huán)流水運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，可致訓(xùn)練組大鼠大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)V層及小腦浦肯野氏神經(jīng)元樹突棘密度顯著增高.Petzinger等[23]研究表明，大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以使健康小鼠紋狀體神經(jīng)元樹突棘密度、數(shù)量顯著增加.Stranahan等[24-25]的研究結(jié)果顯示，自主跑輪運(yùn)動(dòng)使成年大鼠神經(jīng)元樹突棘密度增加，這些均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.現(xiàn)已知，運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)的累積過程，力竭只是運(yùn)動(dòng)性疲勞的終點(diǎn).這種數(shù)量及密度的顯著增加，既有樹突棘修剪走向成熟階段的內(nèi)在因素使然，也有運(yùn)動(dòng)刺激觸發(fā)的適應(yīng)性外在原因存在，更有深層次的發(fā)生方面原因.目前，樹突棘的形成有3種假說：偽足說、Miller/Peters說及Sotelo說[10,26]，因偽足說與Sotelo說主要論點(diǎn)相近、并多有重合，且Sotelo說被廣泛接受和認(rèn)可，因此學(xué)界普遍接受Sotelo說的觀點(diǎn)，認(rèn)為樹突棘結(jié)構(gòu)的形成可能先于突觸聯(lián)接的建立，并在一定時(shí)間內(nèi)等待軸突末端的到來，從而形成突觸聯(lián)接[10].依此學(xué)說，樹突棘密度及數(shù)量的顯著增加，預(yù)示著突觸聯(lián)系的可能增加，突觸整合作用隨之強(qiáng)化，從而及時(shí)調(diào)控運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性，并延擱運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生.

另外，樹突棘形態(tài)方面，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)長型占比有所增高、分叉型占比有所下降，但都不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；短粗型占比非常顯著(P<0.01)下降，蘑菇型占比非常顯著(P<0.01)升高.有研究提示，高頻刺激使突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加，引發(fā)突觸后出現(xiàn)長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)現(xiàn)象，并表現(xiàn)為樹突棘數(shù)量的增加和棘頭的增大；相反，低頻刺激觸發(fā)的長時(shí)程抑制(LTD)會(huì)使樹突棘逐漸萎縮、脫落，表現(xiàn)為樹突棘數(shù)量的減少和體積的縮小[27].但出現(xiàn)這些變化的內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究.眾所周知，樹突棘的形態(tài)依賴于其內(nèi)富含的細(xì)胞骨架，或可從細(xì)胞骨架及相關(guān)基因表達(dá)方面探尋蛛絲馬跡.

3.3 相關(guān)基因qRT-PCR結(jié)果

采用比較Ct法的相對(duì)定量結(jié)果評(píng)判目的基因擴(kuò)增效果，以2-ΔΔCt呈現(xiàn)擴(kuò)增倍數(shù).從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，目的基因F-actin,MAP2,Tau的相對(duì)表達(dá)量分別是CG組的1.33,1.06,1.71倍.現(xiàn)已知，樹突棘內(nèi)的細(xì)胞骨架主要是微絲，又稱纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)，在神經(jīng)元胞體及樹突內(nèi)均有存在，并積極參與突觸后神經(jīng)活動(dòng).豐富的F-actin使樹突棘具有高度的動(dòng)力性和可變性，微絲動(dòng)態(tài)性的聚合和解聚改變著樹突棘的形態(tài)，如解聚時(shí)樹突棘縮小，聚合時(shí)樹突棘則擴(kuò)大[28].除微絲外，神經(jīng)元內(nèi)還含有微管及其伴隨組裝和去組裝存在的微管相關(guān)蛋白(MAP),在諸多微管蛋白中，研究較清楚的是MAP2和Tau.一般認(rèn)為，MAP2存在于神經(jīng)元的胞體和樹突，而Tau多存在于軸突.神經(jīng)元可將MAP2mRNA運(yùn)輸?shù)綐渫贿h(yuǎn)端，且具有極大的選擇性，將特異性的mRNA運(yùn)輸?shù)綐渫徊⒃诖朔g成蛋白質(zhì)，可能是蛋白質(zhì)特異性的分布于神經(jīng)元不同部位的一種手段，其機(jī)制或與突觸部位活動(dòng)情況相關(guān)聯(lián).從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，分布于樹突中的MAP2mRNA表達(dá)量與對(duì)照組幾近相同，而F-actin及Tau mRNA的表達(dá)量均顯著增高，據(jù)此可以推測，因運(yùn)動(dòng)疲勞引發(fā)的突觸可塑性可誘使不同mRNA特異性分布，造成本實(shí)驗(yàn)樹突棘數(shù)量、密度及形態(tài)變化的主要因素是F-actin及Tau mRNA，而非MAP2mRNA.

另外，MAP2通過聚合反應(yīng)調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性，并促進(jìn)其組裝，參與神經(jīng)元形態(tài)構(gòu)建、細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過程，其表達(dá)的增強(qiáng)是樹突生長的標(biāo)志[29].Tau在大腦組織中含量很高，但Tau蛋白的磷酸化水平卻很低，其與微管的結(jié)合能力受制于絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)的磷酸化水平，且這種磷酸化水平受多種因素調(diào)節(jié)，GSK-3β便是其中之一[30].房國梁等[31]的研究提示，有氧運(yùn)動(dòng)通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制GSK-3β的活性，降低大鼠海馬組織Tau蛋白的磷酸化水平.

同時(shí)，樹突棘形態(tài)的可塑性變化多由復(fù)雜的分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)，并受神經(jīng)活動(dòng)的精準(zhǔn)調(diào)控.有關(guān)樹突棘膨大過程中形態(tài)變化與分子動(dòng)態(tài)變化的順序性研究顯示[32-33]，sLTP發(fā)生后，受局部高頻谷氨酸刺激后1 min內(nèi)，樹突棘結(jié)構(gòu)即可發(fā)生膨大，同時(shí)在樹突棘內(nèi)肌動(dòng)蛋白(actin)、絲切蛋白(cofilin)等相關(guān)蛋白開始聚集；隨后的1～4 min內(nèi)，谷氨酸受體亞基、鈣信號(hào)相關(guān)分子等在蛋白質(zhì)水平開始升高；在晚期sLTP，突觸后腳手架蛋白等才開始聚集.在這些分子的動(dòng)態(tài)聚集中，cofilin水平的上升出現(xiàn)最早，且其上升幅度大于樹突棘體積增大的幅度[33].這種順序性變化的結(jié)果可理解為sLTP發(fā)生后，因興奮性遞質(zhì)分泌量突增的刺激，樹突棘內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白隨即開始聚集，而后其體積增大，隨后才有谷氨酸受體亞基及相關(guān)信號(hào)分子蛋白水平的上升，最后腳手架蛋白等才開始聚集.這或許可解釋本實(shí)驗(yàn)F-actin,MAP2,Tau的相對(duì)表達(dá)量變化及與樹突棘形態(tài)、數(shù)量變化之間的內(nèi)在邏輯關(guān)系及機(jī)理.

喬德才等[34-35]的研究顯示,運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)紋狀體Glu和GABA濃度變化是導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性改變及運(yùn)動(dòng)能力降低的重要原因.據(jù)此推測，運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下，Glu暫時(shí)性的高分泌激活NMDA受體等介導(dǎo)的信號(hào)通路，大量Ca2+內(nèi)流致使胞內(nèi)鈣超載，Ca2+既可與CaM結(jié)合激活CaMKⅡ、也可與質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的DAG協(xié)同激活PKC，從而觸發(fā)一系列級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白、特別是F-actin及微管相關(guān)蛋白Tau的聚合或解聚，最終表現(xiàn)為樹突棘數(shù)量和形態(tài)的改變.

另外，現(xiàn)已知，PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路與胰島素及其受體、受體底物直接關(guān)聯(lián)，是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)的主要下游信號(hào)途徑，并參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)、神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等生理生化過程.有實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，外周葡萄糖代謝障礙或胰島素功能低下時(shí)，體外培養(yǎng)的人神經(jīng)元的 GSK-3β可由非活化型轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨?，致使Tau蛋白磷酸化[36].在敲除小鼠神經(jīng)元膜上的胰島素受體基因的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)血糖明顯升高，大腦組織GSK-3β活性明顯改變、Tau蛋白過度磷酸化[37].由此可見，糖代謝障礙時(shí)，GSK-3β與Tau蛋白之間會(huì)產(chǎn)生一定的聯(lián)系.基于上述機(jī)理，運(yùn)動(dòng)疲勞后紋狀體神經(jīng)元F-actin及Tau mRNA的高表達(dá)可致樹突棘數(shù)量、密度顯著增加，且蘑菇型及短粗型樹突棘占比極顯著改變.

4 結(jié)束語

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，運(yùn)動(dòng)疲勞即刻大鼠血糖顯著增高，紋狀體神經(jīng)元樹突棘密度和數(shù)量顯著增加，蘑菇型樹突棘占比極顯著增高、而短粗型樹突棘占比卻極顯著下降，F(xiàn)-actin及Tau mRNA相對(duì)表達(dá)量升高.其發(fā)生機(jī)制可能為：運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下，GluR介導(dǎo)的NMDA構(gòu)象(Ca2+濃度)發(fā)生改變、或PI3K/AKT/GSK-3β等信號(hào)通路被激活或抑制，觸發(fā)相應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致血糖升高而使葡萄糖失穩(wěn)態(tài)，并與作為應(yīng)激刺激的運(yùn)動(dòng)疲勞效應(yīng)相互疊加，產(chǎn)生協(xié)同作用，導(dǎo)致F-actin及Tau mRNA基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，并最終表征為樹突棘形態(tài)、數(shù)量及密度的可塑性變化.