朱吉昌，張成霖，梅瑞嫻，余西，王利環(huán)，于暉

（1.五邑大學(xué) 紡織材料與工程學(xué)院，廣東 江門 529020；2.五邑大學(xué) 生物科技與大健康學(xué)院，廣東 江門 529020）

皮膚是全身最大、最外層的器官，具有保護(hù)機(jī)體免受外部生物侵入、減弱外界機(jī)械損傷、體溫調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、體內(nèi)外物質(zhì)交換等功能. 當(dāng)受到嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)，皮膚會(huì)失去自我修復(fù)能力，需要盡快地進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù). 皮膚創(chuàng)傷的愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括急性炎癥期、細(xì)胞增生期、瘢痕形成期、表皮及其他組織再生期四個(gè)階段[1]，因此理想的創(chuàng)面敷料應(yīng)滿足滲出物快速吸收、創(chuàng)面水蒸氣有效蒸發(fā)、創(chuàng)面維持等要求[2]. 傳統(tǒng)的傷口敷料如紗布、棉絨、繃帶等，基本上可以將傷口與外界環(huán)境隔離，提供干燥的愈合環(huán)境，但易導(dǎo)致繼發(fā)感染等一系列并發(fā)癥. 現(xiàn)代創(chuàng)面敷料如水凝膠[3]、水膠體[4]、海綿[5]、半透膜[6]，在防止創(chuàng)面脫水進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面取得了顯著進(jìn)展，但這些敷料在防水性、透氣性、吸附能力和延展性等方面各有欠缺：半透膜敷料能夠阻隔環(huán)境微生物感染，具有良好的保濕性，但吸收滲液能力差，不適用于感染傷口[7]；水凝膠和水膠體敷料能夠加速干性焦痂傷口的愈合，但不適用于感染傷口和嚴(yán)重滲液傷口[8-9]；海綿孔隙率高，具有良好的吸收滲液的能力，但保濕性差，不適用于三度燒傷或干性焦痂傷口[10]. 因此，目前沒有完美的敷料產(chǎn)品能夠?qū)崿F(xiàn)傷口的全程修復(fù).

基于組織工程技術(shù)原理，開發(fā)類似細(xì)胞外基質(zhì)具有的多級結(jié)構(gòu)的新型三維敷料，能為皮膚再生提供一個(gè)潛在的解決方案. 由于細(xì)胞外基質(zhì)具有微米至納米尺度的纖維狀結(jié)構(gòu)，因此由微米纖維和納米纖維構(gòu)筑的復(fù)合纖維敷料被認(rèn)為是理想的傷口敷料材料[11-14]. 靜電紡絲技術(shù)制備的纖維直徑在幾百納米至幾個(gè)微米之間，被認(rèn)為能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)的纖維狀結(jié)構(gòu). 然而，由靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維通常是致密的二維層狀膜[15]，厚度小、液體吸附能力差，適用于無滲出或低滲出創(chuàng)面，不適用于滲出性創(chuàng)面或深創(chuàng)面. 為此，構(gòu)建孔隙率高、透氣性好，同時(shí)又具有優(yōu)異吸水性能的三維纖維敷料來修復(fù)皮膚組織，成為了皮膚組織工程的研究熱點(diǎn)之一. Wen 等[16]利用改良的氣體發(fā)泡技術(shù)制備了殼聚糖/聚乙烯醇復(fù)合三維層狀納米纖維海綿，用于止血和傷口愈合，這種三維層狀海綿能夠吸收約 60 倍自身質(zhì)量的溶液，體內(nèi)研究表明，三維層狀納米纖維結(jié)構(gòu)有利于創(chuàng)面愈合，以及早期功能真皮和脂肪細(xì)胞的再生，且疤痕面積相對較小. Tan 等[17]通過液體接收靜電紡纖維，成功制備了聚乳酸三維纖維傷口修復(fù)材料，該材料具有5 20 μm～相互連通的孔隙，可以使人皮膚成纖維細(xì)胞長入其中. 本研究通過纖維均質(zhì)分散-冷凍干燥技術(shù)與靜電紡絲技術(shù)的結(jié)合，將微米尺度的聚乳酸（PLA）纖維、納米尺度的細(xì)菌纖維素（BC）纖維通過殼聚糖（CS）粘結(jié)，構(gòu)建成具有三維連通孔結(jié)構(gòu)的多級結(jié)構(gòu)纖維敷料，以期用于皮膚創(chuàng)傷的有效修復(fù).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

N,N-二甲基甲酰胺（DMF，西隴科學(xué)股份有限公司）；二氯甲烷（ C H2Cl2，上海麥克林生化有限公司）；聚乳酸（PLA，浙江海正生物材料有限公司）；細(xì)菌纖維素（BC，海南億德食品有限公司）；殼聚糖（CS，上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司）；乙酸（HAc，廣州化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（ C H3C H2OH，廣東光華科技股份有限公司）；L929 小鼠成纖維細(xì)胞（武漢普諾賽生物科技有限公司）；L929 細(xì)胞專用培養(yǎng)基（MEM，武漢普諾賽生物科技有限公司）；胰酶溶液（上海宏生生物科技股份有限公司）；活/死細(xì)胞雙染色試劑盒（武漢艾美捷科技有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；4,6′ -二脒基 2- -苯基吲哚（DAPI，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；iFluorTM 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（翌圣生物科技上海股份有限公司）；Triton X-100（翌圣生物科技上海股份有限公司）；磷酸鹽（PBS）粉末（Ubio Technology）；多聚甲醛（上海麥克林生化科技有限公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

PL - 2 03-電子天平（博特勒托利多儀器上海有限公司），82 - 5-磁力攪拌器（常州普天儀器制備有限公司），F(xiàn)J2009-數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)（上海索映儀器設(shè)備有限公司），Visco - 0 70-旋轉(zhuǎn)流變儀（中美合資技術(shù)有限公司），DXE - 3-靜電紡絲機(jī)（上海巡騰納米科技有限公司），GZX - 9 240-電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），BDF - 2 5H110-超低溫冰箱（海信容聲廣東冰箱有限公司），2 - 4 LDplus -冷凍干燥機(jī)（上海萊景科學(xué)儀器有限公司），Sigma500-掃描電子顯微鏡（SEM，蔡司股份公司），YG601H - III-透濕儀（泉州寧紡儀器有限公司），LD - 2 3.503-萬能材料試驗(yàn)機(jī)（深圳市蘭博三思材料檢測有限公司），CFP - 1 100A-多孔材料孔徑分析儀（美國 PMI 公司），BIO - R AD - i Mark 酶標(biāo)儀（北京邁潤醫(yī)療醫(yī)療器械有限公司）， B B - 1 50 - C O2培養(yǎng)箱（塞默飛世爾蘇州儀器有限公司），IX73-熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯公司），DMi8-共聚焦熒光顯微鏡（徠卡儀器有限公司）.

1.3 樣品制備

靜電紡絲過程參數(shù)為：灌注速度1 mL/h，電壓強(qiáng)度20 kV，接收距離20 cm，滾筒轉(zhuǎn)速50 r/min，環(huán)境溫度(20 ±5)°C，相對濕度為(50 ±5) %. 利用靜電紡絲方法制備PLA 微米纖維后，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PLA 微米纖維紡絲液（稱取5.8 g 的PLA 顆粒，加入質(zhì)量比為 2 :8的 D MF/CH2C l2混合溶液中，置于磁力攪拌器上攪拌2 h）.

質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%PLA 微米纖維分散液的制備：PLA 纖維置于真空干燥箱60°C干燥24 h 后，稱取2 g PLA 微米纖維膜，裁剪為5 mm ×5 mm大小，加入198 g 超純水中，利用高速分散均質(zhì)機(jī)以20 000 r/min 的速度均質(zhì)分散10 min 即得.

質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BC 納米纖維分散液的制備：BC 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaOH 溶液中浸泡24 h 后，放在濾網(wǎng)上用超純水沖洗，反復(fù)沖洗至pH 值中性，烘干備用. 稱取2 g 的BC，加入超純水至200 g，利用高速分散均質(zhì)機(jī)以20 000 r/min 的速度均質(zhì)分散10 min 即得.

質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%CS 溶液的制備：稱取 CS 粉末1 g，加入到99 g 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%的醋酸水溶液中，放置在磁力攪拌器上攪拌60 min 即得.

將配置好的 PLA 微米纖維分散液、BC 納米纖維分散液和 CS 溶液按質(zhì)量比分別為 7 : 3 :0.1、7 : 3 :0.2、7 : 3 :0.5、3 : 7 :0.2 和 5 : 5 :0.2 等5 種比例混合后，用磁力攪拌器攪拌1 h，使其混合均勻. 分別取這5 種質(zhì)量比的混合液加入模具中，置于 - 8 0°C的冰箱冰凍成型，再冷凍干燥24 h，得到干態(tài)的PLA/BC/CS 多級結(jié)構(gòu)纖維敷料.

1.4 測試與表征

采用電子掃描顯微鏡（SEM）對PLA 微米纖維、BC 納米纖維及PLA/BC/CS 多級纖維敷料的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察與表征. PLA/BC/CS 混合分散液的黏度由旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行測試. 敷料透濕氣性由透濕儀進(jìn)行測試.

敷料的力學(xué)性能在水中進(jìn)行，用萬能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行壓縮測試，壓縮速率為1 mm/min，壓縮應(yīng)變?yōu)?0%.

敷料的生物相容性實(shí)驗(yàn)：首先將敷料用 75%乙醇和紫外光照滅菌，無菌 PBS 清洗干凈后置于96 孔板中，將L929 株成纖維細(xì)胞懸液接種于敷料上，每孔個(gè)細(xì)胞，每孔加入100 μL 培養(yǎng)基，放入為5%的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37培養(yǎng)基每2 天更換一次. 敷料上細(xì)胞的活性使用進(jìn)行測試（具體操作步驟根據(jù)商品操作說明進(jìn)行）；細(xì)胞的活/死狀態(tài)使用活/死細(xì)胞雙染色試劑盒進(jìn)行染色表征（具體操作步驟根據(jù)商品操作說明進(jìn)行）；細(xì)胞在支架上的粘附形態(tài)分別使用鬼筆環(huán)肽染色和SEM 表征.

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維和敷料的形貌與結(jié)構(gòu)

通過掃描電鏡對 PLA 和 BC 兩種纖維進(jìn)行觀察，如圖 1 所示，采用靜電紡絲技術(shù)制備的 PLA纖維表面光滑，直徑分布在，具有微米級尺度；BC 纖維直徑分布在，具有納米級尺度，滿足構(gòu)筑多級結(jié)構(gòu)纖維敷料的尺度要求.

圖1 PLA 纖維和BC 纖維的SEM 圖像與直徑分布

經(jīng)均質(zhì)分散-冷凍干燥技術(shù)制備得到的PLA/BC/CS 多級纖維敷料的實(shí)物圖、微觀形貌如圖2 所示：5 種PLA/BC/CS 混合比的漿液均能通過冷凍干燥獲得形狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的三維敷料，敷料內(nèi)部均具有類似海綿的連通多孔結(jié)構(gòu)，其中PLA 微米纖維在整個(gè)三維結(jié)構(gòu)中起到“骨架”支撐作用，形成微米級的大孔結(jié)構(gòu)；BC 納米纖維則“填充”在孔壁上，模擬細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維狀結(jié)構(gòu)；CS 的加入起到粘合作用，使三維結(jié)構(gòu)保持一定的穩(wěn)定性.

圖2 不同比例敷料的宏觀與微觀形貌圖

理想的生物醫(yī)用敷料內(nèi)部的三維孔狀結(jié)構(gòu)不僅可以為傷口滲液的吸收提供儲(chǔ)存空間，同時(shí)還為傷口與外界的物質(zhì)交換提供“通道”，因此敷料的孔徑對傷口的愈合有著重要意義. 表1 展示了不同比例 PLA/BC/CS 多級纖維敷料的孔徑分布數(shù)據(jù)：1）當(dāng)敷料中 PLA 與 BC 的比例不變時(shí)，隨著 CS的含量從0.1、0.2 增加到0.5，其平均孔徑由169 μm 依次降低到119 μm、106 μm，這主要是因?yàn)镃S附著在 PLA 與 BC 纖維表面，隨著其含量增加，黏度也隨著增大（具體見表 1：混合液的黏度由(456.4 ±41.3) m m2/s ，依次增加到 ( 852.4 ±49.8) m m2/s、(2 075.8 ±108.9) m m2/s ），從而導(dǎo)致冷凍過程中冰晶的生長受到抑制，最終導(dǎo)致敷料孔徑減小. 2）當(dāng)CS 含量不變時(shí)，隨著BC 比例的增加，溶液的黏度也增加，導(dǎo)致敷料孔徑減小.

表1 不同比例PLA/BC/CS 敷料的孔徑與分散液的黏度

2.2 多極結(jié)構(gòu)敷料的物化性能

敷料對創(chuàng)面環(huán)境的保濕程度可以通過敷料的含水率進(jìn)行表征. 表2 數(shù)據(jù)顯示：1）當(dāng)敷料中PLA與 BC 的比例不變時(shí)，隨著 CS 比例從 0.1、0.2 增加到 0.5，敷料的含水率由(31.9±1.0)%依次上升至(34.6±0.6%)、(38.2±0.5)%，這主要?dú)w功于CS 良好的吸水溶脹性能，但整體變化幅度較小；2）當(dāng)CS 配比不變時(shí)，隨著BC 納米纖維占比的增加，其含水率上升幅度顯著，這主要是BC 良好的吸水溶脹性能導(dǎo)致的. 因此針對疤痕形成期的傷口，可以通過提高BC 納米纖維和CS 的比例來維持創(chuàng)面的濕度.

為避免炎癥期傷口的潰爛，理想的醫(yī)用敷料應(yīng)具有良好的透濕氣性. 如表 2 所示：5 種敷料都表現(xiàn)出良好的透濕性能，其透濕量均大于210 000 g(/ m )d· . 結(jié)合敷料的孔徑和吸水性能發(fā)現(xiàn)，敷料的透濕性隨孔徑的增大而增大、隨含水率的增大而減小，因此孔徑大、含水率小的敷料透濕性更好，更適合炎癥期傷口的修復(fù).

敷料在使用過程中會(huì)吸收傷口的滲出液，由于敷料本身材質(zhì)與結(jié)構(gòu)等原因，一些敷料會(huì)產(chǎn)生不同程度的體積變化，從而影響實(shí)際的使用效果. 敷料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是衡量敷料使用性能的重要指標(biāo)之一，本研究對多級結(jié)構(gòu)纖維敷料吸水后的體積收縮率進(jìn)行了測試. 表 2 數(shù)據(jù)顯示：1）當(dāng)敷料中PLA 微米纖維與BC 納米纖維的比例不變時(shí)，隨著CS 比例從0.1、0.2 增加到0.5，敷料的體積收縮率由(32.0±0.8)%依次減小到(27.2±0.7)%、(19.4±1.0)%，這表明黏合劑CS 含量增加，敷料的穩(wěn)定性更好，同時(shí)CS 在水中也會(huì)發(fā)生一定的溶脹，從而減弱體積收縮帶來的影響；而CS 含量較低時(shí)，敷料孔徑結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，敷料吸水后易產(chǎn)生收縮. 2）當(dāng)CS 配比不變時(shí)，隨著BC 的增加，敷料的孔徑減小，原因是BC 比PLA 的吸水溶脹性能好，BC 增加其體積收縮逐漸降低.

傷口在愈合初期會(huì)產(chǎn)生大量的滲液，因此敷料需具有優(yōu)異的吸收滲液能力. 本研究中敷料吸收滲液的能力用敷料的吸水性能來表征. 敷料的理論吸水率受敷料吸水后的體積收縮率和干態(tài)體積密度的影響（不同比例的PLA/BC/CS 敷料的理論體積密度均為10 mg/cm3）. 計(jì)算結(jié)果如表 2 所示：多級結(jié)構(gòu)纖維敷料最低的吸水率都可達(dá)到6 790%，即敷料至少能夠吸收自身重量67.9 倍的水量，完全能夠滿足高滲液傷口的需要.

表2 不同比例敷料的含水率、透濕量、體積收縮率和理論吸水率數(shù)據(jù)

對于皮膚組織工程來說，當(dāng)皮膚的某處部位發(fā)生缺失時(shí)，覆蓋的敷料會(huì)由于機(jī)體彎曲而承受張力，因此敷料需要具有一定的力學(xué)性能.本實(shí)驗(yàn)利用萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)對多級結(jié)構(gòu)纖維敷料的壓縮進(jìn)行了表征. 從表 3 的最大壓縮應(yīng)力（應(yīng)變?yōu)?0%）和5 個(gè)壓縮循環(huán)后的壓縮形變數(shù)據(jù)可以看出：1）當(dāng)敷料中 PLA 與 BC 的比例不變時(shí)，隨著CS 比例從0.1、0.2 增加到0.5，敷料的最大應(yīng)力逐漸增大，最高（13.8±0.1）kPa，但其 5 個(gè)壓縮循環(huán)后的形變無顯著性差異. 產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因應(yīng)該是隨著 CS 含量的增大，敷料的體積密度相應(yīng)增大，從而使壓縮應(yīng)力增大. 2）在CS 含量不變，調(diào)節(jié)PLA 微米纖維與BC 納米纖維的比例時(shí)，敷料的壓縮應(yīng)力逐漸減小，這是由于 PLA 在敷料中起到支撐作用，而隨著PLA 含量的減小，敷料的壓縮應(yīng)力也隨著減少；而壓縮形變隨 BC 納米纖維比例的提高而逐漸減小，這是因?yàn)锽C 在水中良好的溶脹性賦予了敷料良好的回彈性，從而使壓縮形變減小.

表3 多級結(jié)構(gòu)纖維敷料的壓縮性能

2.3 多級結(jié)構(gòu)纖維敷料的生物相容性

敷料的生物相容性決定了敷料的實(shí)際應(yīng)用. 為了測試其生物相容性，本研究采用了CCK-8 試劑盒和活/死細(xì)胞染色對接種在 7PLA/3BC/0.2CS、5PLA/5BC/0.2CS、3PLA/7BC/0.2CS 敷料上的細(xì)胞的增殖能力和活/死狀態(tài)進(jìn)行了表征.

圖3 的測試結(jié)果顯示：接種在3 種敷料上的L929 細(xì)胞均具有良好的增殖能力；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，3 種敷料上的細(xì)胞均呈現(xiàn)為指數(shù)增長，表明3 種敷料均具有良好的生物相容性. 相比之下，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第 3 至第 7 天時(shí)，培養(yǎng)在 7PLA/3BC/0.2CS 敷料上的細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，并且與培養(yǎng)時(shí)間正相關(guān).

圖4 的細(xì)胞活/死染色結(jié)果同樣顯示：接種在3 種敷料上的L929 細(xì)胞的數(shù)目隨培養(yǎng)時(shí)間的延長成倍增長，并在各個(gè)時(shí)間段均呈現(xiàn)超過90%的細(xì)胞存活率（綠色），且在7PLA/3BC/0.2CS 敷料上的細(xì)胞密度最大. 這可能是7PLA/3BC/ 0.2CS 敷料三維結(jié)構(gòu)中的孔徑更大，便于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物質(zhì)的交換，為細(xì)胞的增殖提供了更大的空間，從而更有利于細(xì)胞的增殖和傷口的愈合.

圖4 敷料生物相容性的活/死細(xì)胞染色熒光圖像

為了進(jìn)一步分析促進(jìn)細(xì)胞在 7PLA/3BC/0.2CS 增殖的原因，對接種在 7PLA/3BC/0.2CS、5PLA/5BC/0.2CS 和3PLA/7BC/0.2CS 敷料上培養(yǎng)了3 天的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征. 由圖5 的細(xì)胞骨架染色結(jié)果以及SEM 圖像可知，在7PLA/3BC/0.2CS 敷料上培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)良好的伸展?fàn)顟B(tài)，在5PLA/5BC/0.2CS 敷料培養(yǎng)的細(xì)胞伸展幅度較小，而在3PLA/7BC/0.2CS 敷料培養(yǎng)的伸展最差，呈球狀. 出現(xiàn)該現(xiàn)象主要原因是隨著PLA 微米纖維含量的增加，敷料的親水性減弱，更有利于細(xì)胞的粘附和伸展，而細(xì)胞的粘附和伸展進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，從而使 7PLA/3BC/0.2CS 敷料更有利于傷口的修復(fù).

圖5 L929 細(xì)胞在不同比例敷料上培養(yǎng)3 天后的細(xì)胞形態(tài)熒光染色圖像和SEM 圖像

2.4 敷料的舒適性能展示

舒適性反映了敷料適應(yīng)人體形狀和運(yùn)動(dòng)的能力，當(dāng)敷料易于伸展并能基本返回原位時(shí)，能防止皮下剪切損傷，患者也會(huì)感覺舒適. 如圖 6 所示，貼敷于手腕處的 7PLA/3BC/0.2CS 多級結(jié)構(gòu)纖維敷料在經(jīng)過彎曲使用后仍能保持彎曲前的形狀，并且能夠貼合皮膚. 該敷料的舒適性主要?dú)w功于PLA/BC/CS 敷料中多級纖維的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和CS 的緊密粘合作用.

圖6 敷料舒適性能展示

3 結(jié)論

通過纖維均質(zhì)分散-冷凍干燥技術(shù)制備的PLA/BC/CS 敷料同時(shí)具有上百微米的大孔結(jié)構(gòu)、微米以及納米尺度的纖維結(jié)構(gòu)，高度模擬了細(xì)胞外基質(zhì)的多級結(jié)構(gòu). PLA/BC/CS 多級結(jié)構(gòu)纖維敷料兼具良好的吸水性、透濕性、保濕性，以及良好的生物相容性，其上細(xì)胞增殖及伸展效果良好.

敷料中殼聚糖的加入對其抗菌功效的影響尚待研究，通過微米PLA 纖維和納米BC 纖維搭建的多級纖維結(jié)構(gòu)來模擬細(xì)胞外基質(zhì)的多級結(jié)構(gòu)，為創(chuàng)面敷料的制備提供了一種新的思路和方法，而該敷料在不同的創(chuàng)口環(huán)境中功能性的應(yīng)用還需要繼續(xù)深入研究.