王 燕， 楊建成， 金毅然， 馬曉娜， 李家輝， 郭松林， 劉佳鑫， 梁雪云

（1.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院寧夏干細胞與再生醫(yī)學重點實驗室，銀川 750004）

缺血性腦卒中的致死率和致殘率極高[1]，患者因腦缺血造成不可逆的功能神經(jīng)元喪失和神經(jīng)受損[2]，目前臨床上仍缺乏有效的治愈方法。神經(jīng)干細胞主要存在于大腦海馬區(qū)，可自我更新并增殖分化為神經(jīng)細胞[3]。海馬區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖分化能力被腦缺血影響[4]，移植的神經(jīng)干細胞可替代丟失的神經(jīng)元和重建腦缺血后受損的神經(jīng)回路[5]。因此，腦缺血后及時保護海馬區(qū)神經(jīng)干細胞有利于促進神經(jīng)功能的修復[6]。干細胞移植成為最有希望治療腦卒中的方法之一[7]。間充質(zhì)干細胞可誘導分化成衍生神經(jīng)干細胞樣細胞[8]，但是目前相關(guān)研究較少。本課題組前期采用不同誘導培養(yǎng)基均可將人胎盤間充質(zhì)干細胞（human placental mesenchymal stem cells，hPMSCs）誘導成神經(jīng)細胞，且誘導的細胞具有神經(jīng)干細胞的特性[9]。因此，本文旨在探究用hPMSCs 誘導成神經(jīng)干細胞（hPMSCs induced neural stem cells，hPMSCsiNSCs）的條件培養(yǎng)基對經(jīng)氧-糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）損傷后的小鼠海馬神經(jīng)干細胞的治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

P3 至P6 代hPMSCs 由寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院寧夏干細胞與再生醫(yī)學重點實驗室提供，細胞的采集及獲取均獲得寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會批準（倫理號：2020-289）。SPF 級雄性ICR小鼠，3 周齡，平均體質(zhì)量18～20 g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，所有的實驗動物均符合動物倫理委員會的要求（倫理號：2020-725），所有的實驗過程均按照寧夏醫(yī)科大學實驗動物相關(guān)倫理規(guī)定操作。Ultraculture Serum Free Medium購自瑞士Lonza 公司；Pall Ultroser G Serum substitute 購自美國Pall 公司；Neurobasal A Medium、B27 Supplement、N2 Supplement、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco 公司；bFGF、EGF 購自美國PeproTech 公司；EdU 檢測試劑盒、ROS 活性氧檢測試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司；層粘連蛋白包被液購自瑞典BioLamina 公司；兔抗NF、NSE、GAP43、Cleaved-Caspase-3、SOD 抗體均購自英國Abcam 公司；兔抗Nestin 抗體購自美國Invitrogen 公司；鼠抗β-actin 抗體購自美國Proteintech 公司；Cy3 標記的山羊抗兔IgG 購自美國Jackson Immuno Research 公司；IRDye 680RD 山羊抗兔IgG、IRDye 800CW 山羊抗小鼠IgG 購自美國LI-COR 公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；BCA 蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；封閉羊血清、DAPI 購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物、CO2恒溫培養(yǎng)箱、PRIMO 臺式高速離心機購自美國Thermo Fisher 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Odyssey CLx 雙色紅外激光成像儀購自美國LI-COR 公司；流式細胞儀購自美國BD 公司；6 孔板、12 孔板、培養(yǎng)皿及離心管等耗材均購自美國康寧公司。

1.2 方法

1.2.1 hPMSCs 的培養(yǎng)與誘導 hPMSCs 復蘇后接種于Lonza+UG 無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞生長融合至90%時，胰蛋白酶消化、離心，調(diào)整細胞密度為1.0×104個/mL，接種于添加2%B27、1%N2、10 mg·L-1bFGF、20 mg·L-1EGF 的Neurobasal 誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，誘導成懸浮的細胞球（直徑約100 μm）。

1.2.2 免疫熒光染色法鑒定hPMSCs-iNSCs 將hPMSCs-iNSCs 吹打成單個細胞后貼壁培養(yǎng)于層粘連蛋白包被過的12 孔板中，貼壁過夜，預熱的PBS 洗2 次，4%多聚甲醛室溫固定10 min 后洗3 次，0.5% TritonX-100 透化1 h，5%山羊血清室溫封閉1 h，分別滴加一抗Nestin（1∶200）、GAP43（1∶500），4 ℃孵育過夜。滴加Cy3 標記的山羊抗兔IgG（1∶800）室溫避光孵育3 h 后洗3 次，DAPI避光染色5 min 后洗3 次，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基收集 選擇直徑約100 μm 的hPMSCs-iNSCs 置于新鮮的添加2%B27、10 mg·L-1bFGF、20 mg·L-1EGF、2 μg·mL-1肝素的Neurobasal 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集上清液作為條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM），0.22 μm 濾器過濾后用于后續(xù)實驗。

1.2.4 小鼠海馬神經(jīng)干細胞的原代培養(yǎng) ICR小鼠處死后用75%乙醇浸泡消毒，剪下頭部，剝離皮膚組織，沿顱骨中線剪開，將腦組織與顱骨分離，完全暴露大腦組織，用彎鑷輕輕將大腦取出置于無菌培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下小心剝離出海馬組織，用剪刀將海馬組織剪碎成1 mm3的組織碎塊，胰酶消化7 min，PBS 洗2 次，接種于添加2%B27、10 mg·L-1bFGF、20 mg·L-1EGF、2 μg·mL-1肝素的Neurobasal 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待培養(yǎng)至1 周左右時，顯微鏡下可以看到折光性較強的細胞球，移液器輕輕吹散并接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至2 周左右，懸浮細胞球的數(shù)量明顯增多，體積明顯增大，培養(yǎng)至P3 代（直徑約100 μm）后用于后續(xù)實驗。

1.2.5 免疫熒光染色法鑒定海馬神經(jīng)干細胞 將原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細胞吹打成單個細胞后按照1.2.2 步驟對海馬神經(jīng)干細胞進行鑒定，免疫熒光染色法檢測Nestin（1∶200）、GAP43（1∶500）、NSE（1∶300）、NF（1∶1 000）的蛋白表達。

1.2.6 實驗分組 將小鼠海馬神經(jīng)干細胞吹打成單個細胞后接種于層粘連蛋白包被過的6 孔板內(nèi)，待生長融合至70%左右。正常組（Normal 組）：用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，放入95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱；氧-糖剝奪組（OGD 組）：更換為無糖神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基（添加物不變），放入1%O2、5%CO2、94%N2低氧培養(yǎng)箱，24 h 后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并更換為神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基，放入95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；氧-糖剝奪+條件培養(yǎng)基組（OGD+CM 組）：與OGD 組處理一樣，低氧24 h 后更換hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基，放入95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后進行后續(xù)實驗。

1.2.7 EdU 染色法檢測神經(jīng)干細胞的增殖能力 各組細胞用終濃度為10 μmol·L-1的EdU 工作液（組分A）孵育24 h，4%多聚甲醛室溫固定20 min，2 mg·mL-1的甘氨酸溶液室溫孵育5 min，3%BSA洗2 次，加入0.5%TritonX-100 室溫孵育20 min，3%BSA 洗2 次，加入Click-iT 反應混合物（組分C、D、E）室溫避光孵育30 min，PBS 洗2 次，DAPI避光染色5 min 后洗3 次。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.8 免疫熒光染色法檢測神經(jīng)干細胞的凋亡水平 待1.2.6 結(jié)束后，按照1.2.2 的方法檢測Cleaved-Caspase-3（1∶1 000）的水平來評估海馬神經(jīng)干細胞的凋亡情況。

1.2.9 Western blot 法檢測神經(jīng)干細胞抗氧化蛋白SOD 的表達水平 各組細胞用預冷的PBS 洗2 次，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液冰上裂解30 min，4 ℃離心12 000 r·min-1，10 min 后得到細胞總蛋白上清液，BCA 試劑盒檢測濃度。適量蛋白樣品用SDS-PAGE 凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，加入一抗SOD（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗3 次，加入680RD 山羊抗兔IgG（1∶10 000）、800CW 山羊抗小鼠IgG（1∶10 000），室溫避光孵育1 h，TBST 洗3 次。Odyssey CLx 雙色紅外激光成像儀掃描讀膜，Image J 軟件分析灰度值。

1.2.10 流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)干細胞內(nèi)ROS 水平 采用DCFH-DA 熒光探針法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS 水平。各組細胞用胰酶消化得到細胞懸液，加入終濃度為10 μmol·L-1的DCFHDA 工作液，37 ℃避光孵育30 min，無血清培養(yǎng)基洗2 次，PBS 重懸為細胞懸液（細胞數(shù)至少3×104個），488 nm 激發(fā)，530 nm 測定，流式細胞儀檢測神經(jīng)干細胞內(nèi)ROS 水平變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 7.04 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。所有實驗至少重復3 次。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hPMSCs-iNSCs 的形態(tài)學觀察

將hPMSCs 接種于含有誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，24～48 h 后，培養(yǎng)皿中逐漸出現(xiàn)懸浮生長的細胞球。隨著天數(shù)的增加，懸浮生長的細胞球的數(shù)量和直徑均增加（P 均<0.05），見圖1。

圖1 hPMSCs-iNSCs 的形態(tài)學變化

2.2 hPMSCs-iNSCs 的生物學特性檢測

免疫熒光染色結(jié)果顯示，未誘導hPMSCs 僅有少量細胞為Nestin 或GAP43 陽性細胞，熒光信號較弱。誘導后hPMSCs-iNSCs，60%以上的細胞為Nestin 陽性細胞，90%以上的細胞為GAP43陽性細胞，并且熒光信號較強，見圖2。

圖2 hPMSCs 與hPMSCs-iNSCs 中Nestin 和GAP43 免疫熒光染色（↙：Nestin 與GAP43 陽性細胞；bar=20 μm）

2.3 原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)干細胞的生物學特性鑒定

免疫熒光染色法檢測直徑約為100 μm 的細胞球的神經(jīng)干細胞標志蛋白Nestin、NF、GAP43和NSE 的表達。結(jié)果顯示，幾乎所有細胞均表達Nestin、NF、GAP43 和NSE 蛋白，見圖3。

圖3 小鼠海馬神經(jīng)干細胞的Nestin、NF、GAP43 和NSE 免疫熒光染色（↙：Nestin、NF、GAP43 和NSE 陽性細胞；bar=20 μm）

2.4 hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基對OGD 損傷的海馬神經(jīng)干細胞形態(tài)的影響

貼壁培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)干細胞在OGD 24 h后，貼壁生長的細胞僅有30%左右，大多數(shù)細胞漂浮在培養(yǎng)液中；細胞形態(tài)改變，表現(xiàn)為細胞輪廓模糊，細胞胞體變圓，細胞突起縮短，貼壁能力差，見圖4B。OGD 組和OGD+CM 組培養(yǎng)48 h后，兩組細胞數(shù)量均有所增加，細胞形態(tài)與OGD前后的神經(jīng)干細胞明顯不同，主要表現(xiàn)為胞體變大，突起變長變粗。OGD 組與OGD+CM 組相比，細胞形態(tài)無明顯差異，見圖4C、D。

圖4 不同培養(yǎng)條件下海馬神經(jīng)干細胞的形態(tài)

2.5 hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基對OGD 損傷后海馬神經(jīng)干細胞增殖能力的影響

EdU 染色結(jié)果顯示，與Normal 組比較，OGD 組海馬神經(jīng)干細胞EdU 陽性細胞數(shù)減少（P<0.05）；與OGD 組比較，OGD+CM 組海馬神經(jīng)干細胞EdU 陽性細胞數(shù)增多（P<0.05），見圖5。

圖5 不同培養(yǎng)條件下海馬神經(jīng)干細胞EdU 染色

2.6 hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基對OGD 損傷后海馬神經(jīng)干細胞凋亡的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Normal 組比較，OGD 組海馬神經(jīng)干細胞Cleaved-Caspase-3 陽性細胞數(shù)增加（P<0.05）；與OGD 組比較，OGD+CM組海馬神經(jīng)干細胞Cleaved-Caspase-3 陽性細胞數(shù)減少（P<0.05），見圖6。

圖6 不同培養(yǎng)條件下海馬神經(jīng)干細胞Cleaved-Caspase-3 免疫熒光染色

2.7 hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基對OGD 損傷后海馬神經(jīng)干細胞抗氧化能力的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與Normal 組比較，OGD 組海馬神經(jīng)干細胞SOD 蛋白的表達下降（P<0.05）；與OGD 組比較，OGD+CM 組海馬神經(jīng)干細胞SOD 蛋白的表達升高（P<0.05），見圖7A。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與Normal 組比較，OGD 組海馬神經(jīng)干細胞內(nèi)ROS 水平上升（P<0.05）；與OGD 組比較，OGD+CM 組海馬神經(jīng)干細胞內(nèi)ROS水平下降（P<0.05），見圖7B。

圖7 不同培養(yǎng)條件下海馬神經(jīng)干細胞抗氧化能力變化

3 討論

海馬區(qū)對缺血缺氧極為敏感[10]，腦缺血損傷時，海馬區(qū)神經(jīng)干細胞可遷移至受損區(qū)域，替代受損神經(jīng)細胞發(fā)揮功能[11]，同時腦缺血會使海馬區(qū)的神經(jīng)干細胞功能受損[12-13]。有研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，移植的神經(jīng)干細胞可遷移至受損部位，促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖、分化及遷移，然而，神經(jīng)干細胞的來源十分有限。

本研究將人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞誘導為hPMSCs-iNSCs，其表達神經(jīng)干細胞的標志蛋白Nestin 和GAP43，表明hPMSCs-iNSCs 具有部分神經(jīng)干細胞的生物學特性，可以作為外源性的神經(jīng)干細胞的來源。本研究利用小鼠海馬神經(jīng)干細胞建立體外OGD 模型來模擬腦缺血的內(nèi)環(huán)境[16-17]，探討hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基對OGD損傷的海馬神經(jīng)干細胞的保護作用。EdU 染色和Cleaved-Caspase-3 免疫熒光染色結(jié)果表明，OGD 后海馬神經(jīng)干細胞的增殖能力下降，且Cleaved-Caspase-3 陽性細胞數(shù)增加；用hPMSCsiNSCs 條件培養(yǎng)基處理后，受損海馬神經(jīng)干細胞的增殖能力升高，Cleaved-Caspase-3 陽性細胞數(shù)下降。間充質(zhì)干細胞可清除自由基，促進內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的修復，對受損神經(jīng)細胞起到保護作用[18-19]。腦缺血后神經(jīng)細胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平上升[20]，ROS 的過度產(chǎn)生破壞細胞的結(jié)構(gòu)與功能[21-22]。為了進一步探討hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基對OGD 損傷的海馬神經(jīng)干細胞的保護機制，檢測細胞內(nèi)ROS水平變化和抗氧化蛋白SOD 的表達，評價hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基的治療效果。Western blot和流式細胞術(shù)結(jié)果表明，hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基不僅可以清除OGD 損傷的海馬神經(jīng)干細胞過度產(chǎn)生的ROS，還可以修復OGD 損傷后的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中抗氧化蛋白SOD 的表達。hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基可能通過其抗氧化物質(zhì)成分對受損的海馬神經(jīng)干細胞發(fā)揮保護作用。在后續(xù)的研究中我們將檢測hPMSCs-iNSCs條件培養(yǎng)基中的抗氧化物質(zhì)成分，進一步明晰hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基對OGD 損傷的海馬神經(jīng)干細胞的保護作用。

綜上所述，本研究利用hPMSCs 誘導的細胞具有神經(jīng)干細胞的特性，采用hPMSCs-iNSCs 條件培養(yǎng)基處理OGD 損傷的海馬神經(jīng)干細胞，能夠使受損神經(jīng)干細胞的增殖能力和抗氧化能力升高，進而降低神經(jīng)干細胞的凋亡，促進神經(jīng)干細胞的修復。本研究結(jié)果為臨床利用神經(jīng)干細胞移植治療缺血性腦卒中提供了理論依據(jù)。