馮詩詩田 青胡 軍

(1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.工業(yè)微生物菌種保藏與選育河南省工程實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450001;3.鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450001)

益生菌在人體健康方面發(fā)揮著重要作用[1-4],尤其是在降膽固醇的作用上,人體血清中的膽固醇含量與心血管疾病關(guān)系密切[5],主要發(fā)揮降解作用的是乳酸菌[6-7],其中雙歧桿菌降解效果顯著[8-9]。腸道膽固醇的吸收主要是膽酸的乳化作用,菌株產(chǎn)生的BSH可將結(jié)合型膽酸鹽類水解成游離型膽酸氨基酸殘基[10-11],經(jīng)腸肝循環(huán)進(jìn)一步分解膽固醇,或不參與腸肝循環(huán)隨糞便排出,從而達(dá)到降低膽固醇的目的[12-13]。體外研究表明:膽固醇可與游離膽汁酸、菌體細(xì)胞發(fā)生共沉淀作用,降解培養(yǎng)基中的膽固醇[14]。雙歧桿菌是嚴(yán)格的厭氧菌,對馴化后的菌株對氧氣有一定的耐受性,前期在益生性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有顯著的膽固醇降解作用,在48 h內(nèi)降解率可達(dá)到50%,72 h可達(dá)到70%,由于該菌株在48 h時的活性比72 h高,故選用48 h為優(yōu)化培養(yǎng)的周期。

為深入探究長雙歧桿菌F16對膽固醇的降解作用,對BSH及其基因進(jìn)行鑒定,分析菌株對膽固醇的降解作用與產(chǎn)BSH的關(guān)系,并采用響應(yīng)面分析法建立模型,優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶條件,提高BSH活性,從而為長雙歧桿菌F16在食品、保健和醫(yī)藥等方面的綜合應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試 劑

菌種來源:實(shí)驗(yàn)所用菌株F16取自鄭州大學(xué)某實(shí)驗(yàn)室一株經(jīng)過長期馴化的益生菌。

蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、瓊脂粉、葡萄糖、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、K2HPO4、KH2PO4、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳(BC),天津市大茂化學(xué)試劑廠;三氯乙酸、茚三酮、碘酸鉀、果糖、瓊脂糖、膽固醇、牛膽酸鈉、Marker、Ezup柱式細(xì)菌基因DNA抽提試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1 mL、乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二氨2 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、磷酸氫二鉀2 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀 器

YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;JY600D電泳儀,北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;Eppendorf MastercyclernexusPCR儀,艾本德中國;EPOCH微孔板分光光度計,美國伯騰儀器有限公司;Heraeus Fresco 21高速冷凍離心機(jī),熱電實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司奧斯特羅德分公司;ZHJH-C1109B型超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化

取甘油保存的F16菌液,接入新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h以上(第1次活化時間較長),之后每次傳代培養(yǎng)48 h即可。

1.3.2bsh的鑒定

菌懸液的制備:將活化后的長雙歧桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)48 h后,4 ℃下10 000 r/min離心10 min,棄去上清液,用PBS將菌體洗滌2次,調(diào)節(jié)菌體的OD600為1。

采用牛津杯法[15],加入0.3%的?；撬徕c于MRS培養(yǎng)基,將上述菌懸液注入牛津杯中,培養(yǎng)48 h或72 h,觀察是否有白色沉淀以及茚三酮顯色反應(yīng)是否有藍(lán)紫色顏色變化,以此來鑒定膽鹽水解酶[16]。

1.3.3bsh基因的鑒定

通過檢索NCBI的雙歧桿菌序列,設(shè)計了一組bsh基因的特異性引物:bsh上游引物為5’-TGAGGTCCATGGAGCTGGGTTTGAAGA-3’;BSH下游引物為5’-GTATCATGAACGTGCAAGCCAACCAAA-3’。

F16的基因組DNA為模板,使用bsh基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系如表1所示。

表1 bsh基因鑒定PCR反應(yīng)體系Table 1 The bsh gene identifies the PCR system

PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min 6 s,30次循環(huán),72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行電泳,若得到的基因片段長度與預(yù)期相符,將PCR產(chǎn)物純化回收,送至測序公司測序。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計

在單因素實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、葡萄糖質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、酵母浸粉質(zhì)量濃度和菌液接種量)[17]的基礎(chǔ)上,以葡萄糖質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、菌液接種量為自變量,膽鹽水解酶活性為響應(yīng)值,利用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[18-19],并采用Designexpert 12軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 測定方法

將調(diào)節(jié)好的菌懸液進(jìn)行冰浴,超聲破碎后再離心,取上清液,加入磷酸緩沖液和牛膽酸鈉溶液,搖勻,30 min后終止反應(yīng),加入茚三酮指示劑煮沸,稀釋后在570 nm處測定樣品吸光度值,具體測定方法參照文獻(xiàn)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSH的鑒定結(jié)果

將活化后的長雙歧桿菌F16的菌液注入含膽鹽的MRS的牛津杯中,培養(yǎng)一段時間后,牛津杯底部有白色沉淀,如圖1所示。取適量白色沉淀,加入茚三酮顯色劑,顏色變?yōu)樗{(lán)紫色,可初步確定F16產(chǎn)BSH。

圖1 牛津杯法鑒定BSH結(jié)果Fig.1 Oxfordcup method of BSH results

2.2 bsh基因的鑒定結(jié)果

引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳,最終得到了一段長度約為1 100 bp的基因片段,其擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。圖2中:從左至右依次為Marker、引物擴(kuò)增產(chǎn)物和空白對照。該基因片段與預(yù)期相符合,使用生物信息軟件將測序結(jié)果與已知序列進(jìn)行比對分析,得出F16-bsh基因片段與已報導(dǎo)的bsh基因(NZ_CP026999.1)同源性為93.97%,F16-bsh基因反向測序序列與已報導(dǎo)的bsh基因序列比較如圖3所示,由此可以確定該基因?yàn)槟扄}水解酶bsh家族基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明長雙歧桿菌F16含有bsh基因。

圖2 bsh基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of bsh gene amplification

圖3 F16-bsh基因反向測序序列與已報導(dǎo)的bsh基因序列比較Fig.3 The F16-bsh gene reverse sequencing sequence was compared with the reported bsh gene sequence

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以葡萄糖質(zhì)量濃度A、蛋白胨質(zhì)量濃度B、接種量C為自變量,以BSH活性O(shè)D570為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合實(shí)驗(yàn),方案和結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface design and results

采用Designexpert 12軟件對表2進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗(yàn),建立了葡萄糖質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度和接種量3個自變量和BSH活性響應(yīng)指標(biāo)關(guān)系的二階多項(xiàng)式方程:Y=0.897 2+0.004 4A+0.000 1B+0.013 0C+0.001 0AB+0.002 3AC-0.003 7BC-0.135 6A2-0.149 6B2-0.086 3C2。

2.3.2 響應(yīng)面模型的方差分析

對回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示。由表3可知:該回歸模型極顯著(P<0.000 1),失擬項(xiàng)越小,對應(yīng)的P值越大,擬合效果越好,該模型的失擬項(xiàng)對應(yīng)的P=0.065 3>0.05,不顯著,其中A,C對BSH活性的影響顯著(P<0.05),二次項(xiàng)A2,B2,C2對BSH活性的影響極顯著(P<0.01),表明該回歸方程的自變量和因變量之間的相關(guān)關(guān)系顯著,模型擬合度高,實(shí)際值與預(yù)測值較為接近,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可行。對回歸方程進(jìn)行可信度分析,得到R2=0.999 2,經(jīng)調(diào)整后R2=0.998 1,表明該模型可以很好地解釋72.58%的響應(yīng)值變動。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

2.3.3 響應(yīng)面分析

為探索這3個因素之間的交互作用對BSH活性的影響及影響程度,繪制該回歸方程的響應(yīng)曲面,曲面圖如圖4所示。蛋白胨質(zhì)量濃度與接種量的等高線比較接近橢圓,且曲面較陡,說明蛋白胨質(zhì)量濃度與接種量的交互作用對BSH活性的影響較大;葡萄糖質(zhì)量濃度與蛋白胨質(zhì)量濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度與接種量的等高線均接近圓形,說明葡萄糖質(zhì)量濃度與蛋白胨質(zhì)量濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度與接種量的交互作用對BSH活性的影響不明顯。

圖4 各因素的交互作用對BSH活性的影響曲面Fig.4 The influence surface of each factor interaction on BSH activity

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Designexpert 12軟件分析,可得到BSH活性的最優(yōu)發(fā)酵條件為:葡萄糖質(zhì)量濃度10.043 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度14.997 g/L、接種量1.038%,此時BSH活性O(shè)D570預(yù)測值為0.898?？紤]到實(shí)際情況,將發(fā)酵條件調(diào)整為葡萄糖質(zhì)量濃度10.05 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度15 g/L、接種量1.05%,進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到BSH活性O(shè)D570平均值為0.896,與預(yù)測值的誤差為2.26%,偏差較小,表明響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件較為可信。

2.4 F16菌株對膽固醇的降解作用

為驗(yàn)證F16菌株對膽固醇的降解效果,對優(yōu)化前后的膽固醇降解率進(jìn)行分析比較,在前期研究中已知膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.430 1x+0.003,優(yōu)化前膽固醇降解率為46%,優(yōu)化后的膽固醇降解率為72.6%,優(yōu)化后的降解率約為優(yōu)化前的1.6倍。

3 結(jié) 論

長雙歧桿菌F16對膽固醇有較顯著的降解效果,采用牛津杯法初步鑒定F16能產(chǎn)膽鹽水解酶,根據(jù)菌株全基因組序列和已知的bsh基因序列,設(shè)計引物并擴(kuò)增出bsh基因,證明F16具有bsh基因,并得到F16的bsh基因序列,將F16-bsh與已報導(dǎo)的bsh序列進(jìn)行比對,同源性為93.97%,證明該基因?qū)儆赽sh家族基因,表明F16具有BSH活性。葡萄糖質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、接種量以及酵母浸粉質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH會導(dǎo)致BSH活性產(chǎn)生變化,設(shè)計響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對長雙歧桿菌F16的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化:葡萄糖質(zhì)量濃度10.05 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度15 g/L、接種量1.05%、酵母浸粉質(zhì)量濃度15 g/L、培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)基pH 5.5,優(yōu)化后F16菌株長勢旺盛,代謝加快,產(chǎn)生的BSH活性明顯增加,用OD570表示為0.896,優(yōu)化后的BSH活性是優(yōu)化前的1.8倍,優(yōu)化后的膽固醇降解率約為優(yōu)化前的1.6倍,表明長雙歧桿菌F16菌株產(chǎn)生的BSH活性較高較穩(wěn)定,降膽固醇效果顯著提高,在食品、保健和醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。