王柳岑，朱永樂，鞠葛金悅，劉至立，李美瑩，王晶晶

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

毛酸漿（Physalis pubescens L.）為茄科酸漿屬一年生草本植物，其果實(shí)顏色金黃，外形圓潤，俗稱黃菇娘，味道酸甜可口，是我國東北地區(qū)一種營養(yǎng)豐富的應(yīng)季水果。研究表明，毛酸漿富含黃酮、多酚等多種功能性成分，具有抗炎、提高免疫力等多種功效[1-3]，是一種極具開發(fā)潛力的漿果。目前市場上毛酸漿的深加工產(chǎn)品少，主要是果汁、罐頭、果醬和果脯等初級(jí)加工產(chǎn)品[4-8]。大量研究表明，乳酸菌發(fā)酵可以改善果蔬汁的品質(zhì)、風(fēng)味和抗氧化活性[9-12]。另外，乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道pH 值、保護(hù)腸道、抑制腫瘤和預(yù)防腹瀉等生理功效，因此乳酸菌發(fā)酵果蔬汁的研制成為近年來的研究熱點(diǎn)[13-16]。國內(nèi)學(xué)者分別采用植物乳桿菌、短桿乳桿菌、副干酪乳桿菌等對(duì)葡萄汁、獼猴桃果汁、樹莓汁和拐棗汁等進(jìn)行了單一菌種或者復(fù)合菌種的發(fā)酵工藝研究，均取得了較好的效果[16-20]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，植物乳桿菌發(fā)酵毛酸漿果汁經(jīng)體外消化后，乳酸菌仍具有很好的活力，果汁中多酚含量和抗氧化活性均較高[21]。有學(xué)者分別比較了植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌等常見益生菌在毛酸漿中的單株發(fā)酵特性，對(duì)乳酸菌復(fù)合酵母菌發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，但未對(duì)植物乳桿菌和副干酪乳桿菌的復(fù)合發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，其發(fā)酵后抗氧化成分及主要?dú)馕蹲兓采形疵鞔_[22-24]。

本研究通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合發(fā)酵毛酸漿果汁的工藝配方進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)發(fā)酵前后果汁理化指標(biāo)、抗氧化成分（黃酮和多酚）以及氣味進(jìn)行了檢測，為乳酸菌發(fā)酵毛酸漿果汁類產(chǎn)品的開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

毛酸漿，購于遼寧省錦州市；植物乳桿菌1.1856（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿1.9089（Lactobacillus paracei），錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

亞硝酸鈉、福林酚、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純；沒食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%）、蘆丁（標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%），購于索萊寶生物科技有限公司；MRS 液體培養(yǎng)基，購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

RBM-615 型榨汁機(jī)，德國瑞本公司；UV-1800 型分光光度計(jì)，日本島津公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；HH-4D 型恒溫水浴鍋，上海比朗儀器制造有限公司；WTY-A 型手持糖度儀，成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；PEN3 型電子鼻，德 國Airsense Analytics Gmbh 公 司；ZHJH-112 型超凈工作臺(tái)，上海智誠分析儀器制造有限公司；HR/T20MM 型立式冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；FA2004N 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毛酸漿果汁的制備

挑選新鮮無壞果的毛酸漿果實(shí)，清洗去宿萼后榨汁，一層濾布過濾，82 ℃滅菌15 min。

1.2.2 毛酸漿果汁發(fā)酵

取出保存在甘油管中的乳酸菌，接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h，活化2代。將不同菌種比例的菌液配比后，以107CFU/mL的菌密度接入毛酸漿果汁中，于封口玻璃瓶中培養(yǎng)，37 ℃靜置發(fā)酵24 h，每6 h 取樣進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.2.3 綜合評(píng)價(jià)

1.2.3.1 感官評(píng)價(jià)

參考仵白敏[17]的方法，隨機(jī)挑選受過相關(guān)訓(xùn)練的10 人，采取隨機(jī)抽樣的方式，分別對(duì)發(fā)酵果汁的色澤、組織狀態(tài)、氣味、口感、酸甜度5 個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1 所示。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation scoring criteria

1.2.3.2 抗氧化性評(píng)價(jià)

由于毛酸漿富含具有抗氧化性的黃酮、多酚等功能性成分，因此對(duì)黃酮和多酚的含量進(jìn)行了檢測，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2 所示。

表2 抗氧化性成分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Antioxidant composition scoring criteria

1.2.3.3 綜合評(píng)分的確定

將黃酮含量、多酚含量和感官品質(zhì)3 項(xiàng)指標(biāo)擬合而成綜合評(píng)分。綜合評(píng)分權(quán)重的確定是采用專家評(píng)分的方法，即請(qǐng)專家對(duì)3 個(gè)指標(biāo)（總和為100 分）的重要度進(jìn)行評(píng)分，確定3 項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分，具體如表3 所示[25]。

表3 指標(biāo)的專家權(quán)重評(píng)分結(jié)果Table 3 Weight scoring results of indicators by experts

綜合評(píng)分=0.50×感官評(píng)分+0.25×總黃酮含量評(píng)分+0.25×多酚含量評(píng)分

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 復(fù)合菌種接種比例試驗(yàn)

在接種量1%（V/V），發(fā)酵時(shí)間12 h 條件，調(diào)整植物乳桿菌與副干酪乳桿菌的接種比例（后文簡稱菌種比）分別為0∶1、1∶2、1∶1、2∶1、1∶0（V/V）（配比后菌密度107CFU/mL），對(duì)制備的乳酸菌混合發(fā)酵毛酸漿果汁進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.2.4.2 復(fù)合菌種接種量試驗(yàn)

在菌種比例2∶1（V/V），發(fā)酵時(shí)間12 h 條件下，調(diào)整菌種接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%（V/V），對(duì)制備的乳酸菌混合發(fā)酵毛酸漿果汁進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.2.4.3 復(fù)合菌種發(fā)酵時(shí)間試驗(yàn)

在菌種比例2∶1（V/V），接種量1%（V/V）條件下，調(diào)整發(fā)酵時(shí)間分別為0、6、12、18、24 h，對(duì)制備的乳酸菌混合發(fā)酵毛酸漿果汁進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)3 個(gè)發(fā)酵因素進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factor and level of response surface test

1.2.6 測定項(xiàng)目與方法

1.2.6.1 乳酸菌活菌數(shù)

根據(jù)GB 4789.35—2016[26]進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)。

1.2.6.2 發(fā)酵指標(biāo)

pH 值：使用pH 計(jì)測定；總酸含量：參照GB/T 12456—2021[27]中的方法測定，總酸度以乳酸計(jì)算；可溶性固形物含量：使用手持糖度儀測定；總糖含量：采用DNS 比色法[28]測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.639 9x-0.074 6，R2=0.997 9。

1.2.6.3 總黃酮和多酚含量

總黃酮含量：參考雷靜文等[29]的方法測定；多酚含量：采用Folin-Ciocalteu 檢測法[30]測定。

1.2.6.4 電子鼻檢測

參考韓雪等[31]的方法，對(duì)樣品進(jìn)行電子鼻檢測，儀器參數(shù)：載氣流速100 mL/min，清洗時(shí)間100 s，檢測時(shí)間60 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，自動(dòng)調(diào)零時(shí)間5 s，選擇58 s 時(shí)的響應(yīng)值用于數(shù)據(jù)分析。對(duì)新鮮果汁、滅菌后的新鮮果汁、發(fā)酵果汁和滅菌后的發(fā)酵果汁4 個(gè)樣品進(jìn)行檢測，滅菌方法采用巴氏滅菌法。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以xˉ±s 表示，采用Excel 2010 和SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin2018-64 繪制圖。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design Expert 10 軟件，揮發(fā)性氣味成分采用WinMuster 軟件分別進(jìn)行PCA、Loading 和LDA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖1～3 所示，菌種比、接種量和發(fā)酵時(shí)間均對(duì)毛酸漿果汁的綜合評(píng)分有很大影響，菌種比為2∶1時(shí)，發(fā)酵果汁的綜合評(píng)分最高，為（25.8±0.48）分（圖1）；隨著接種量和發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵果汁的綜合評(píng)分呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)接種量和發(fā)酵時(shí)間分別超過1.0%和12 h 時(shí)，由于發(fā)酵果汁過酸使感官評(píng)分下降，導(dǎo)致綜合評(píng)分下降（圖2～3）。因此，選取菌種比2∶1，接種量1.0%和發(fā)酵時(shí)間12 h 為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中的0 水平。

圖1 復(fù)合菌種接種比例對(duì)毛酸漿果汁綜合評(píng)分的影響Fig.1 Effect of inoculation ratio of mixed starins on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

圖2 復(fù)合菌種接種量對(duì)毛酸漿果汁綜合評(píng)分的影響Fig.2 Effect of inoculation concentration of mixed starins on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

圖3 復(fù)合菌種發(fā)酵時(shí)間對(duì)毛酸漿果汁綜合評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation time of mixed strains on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以菌種比（A）、接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Response surface test design and results

表6 回歸模型的方差分析Table 6 ANOVA for the regression models

對(duì)表5 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)多元回歸分析，得到發(fā)酵毛酸漿果汁綜合評(píng)分（Y）對(duì)菌種比（A）、接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）的回歸方程為：

Y=26.01+0.49A+0.96B+0.34C-1.26AB-0.82AC-1.52BC-1.69A2-1.21B2-1.60C2

由表6 的方差分析結(jié)果可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)（R2）為0.971 8，調(diào)整決定系數(shù)（R2adj）為0.935 6，說明該回歸方程具有良好的擬合度和可信度[32]，因此該回歸方程可用于毛酸漿果汁發(fā)酵結(jié)果的理論推測。其中，A、AC 對(duì)發(fā)酵毛酸漿果汁綜合評(píng)分的影響顯著（P＜0.05），B、AB、BC、A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.01）。影響發(fā)酵毛酸漿果汁綜合評(píng)分各因素的主次順序依次為：B（接種量）＞A（菌種比）＞C（發(fā)酵時(shí)間）。

圖4～6 為兩兩因素之間的響應(yīng)面曲線圖。通過分析可知，菌種比（A）、接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）任意兩因素間的組合，其綜合評(píng)分皆隨工藝參數(shù)的提高而呈現(xiàn)先增加后下降趨勢，特別是AB 和BC 組合，其曲面變化陡峭，這與方差分析結(jié)果一致，說明本試驗(yàn)參數(shù)選擇合理，在選定范圍內(nèi)的參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化，能夠得到最佳的綜合評(píng)分。

圖4 菌種比和接種量的交互作用對(duì)毛酸漿果汁綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面曲線圖Fig.4 Response surface map of the effects of the interaction of strain ratio and inoculum amount on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

2.2.2 最佳發(fā)酵工藝的確定

圖5 菌種比和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)毛酸漿果汁綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面曲線圖Fig.5 Response surface map of the effects of the interaction of strain ratio and fermentation time on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

圖6 接種量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)毛酸漿果汁綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面曲線圖Fig.6 Response surface map of the effects of the interaction of inoculation amount and fermentation time on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

根據(jù)響應(yīng)面回歸模型及Design Expert 10 軟件求解方程得到毛酸漿乳酸菌混合發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為：菌種比7∶3.515，接種量1.016%，發(fā)酵時(shí)間12.09 h，根據(jù)上述條件經(jīng)模型優(yōu)化預(yù)測得到發(fā)酵毛酸漿果汁綜合評(píng)分為25.793 分?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)需要，對(duì)參數(shù)進(jìn)行簡化，調(diào)整為菌種比2∶1，接種量1.0%、發(fā)酵時(shí)間12 h，經(jīng)過3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，綜合評(píng)分平均值為25.82分，與模型預(yù)測理論值基本一致，說明本模型可信度高，可用于生產(chǎn)中預(yù)測毛酸漿果汁混合發(fā)酵工藝的結(jié)果。

2.3 毛酸漿果汁發(fā)酵前后理化指標(biāo)變化

表7 為發(fā)酵前后毛酸漿果汁的理化指標(biāo)變化情況。由表7 可見，由于乳酸菌在發(fā)酵過程中需要消耗糖類作為碳源并產(chǎn)酸[33]，所以發(fā)酵后毛酸漿果汁的pH 值、可溶性固形物和總糖含量降低，總酸含量升高。毛酸漿果汁發(fā)酵前后的多酚和總黃酮含量分別由（0.259±0.01）g/L 和（0.268±0.01）g/L 提高至（0.281±0.00）g/L 和（0.401±0.00）g/L，菌落總數(shù)達(dá)到8.31±0.12（lg（CFU/g））。葉盼等[34]選用植物乳桿菌對(duì)蘋果汁進(jìn)行發(fā)酵，也發(fā)現(xiàn)多酚和總黃酮含量顯著增加，與本文研究結(jié)果一致。說明乳酸菌發(fā)酵有益于毛酸漿中功能性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和溶出，這可能由于乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酯酶和酚酸脫羧酶。酯酶可促進(jìn)果汁中結(jié)合酚水解釋放出游離酚；酚酸脫羧酶能夠?qū)?fù)雜的大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類物質(zhì)。另外，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸還可以抑制酚類物質(zhì)降解。這些都可導(dǎo)致乳酸菌發(fā)酵后果汁中酚類物質(zhì)的含量及種類發(fā)生變化[35]。

表7 理化指標(biāo)Table 7 Physico-chemical indicators

2.4 電子鼻結(jié)果

氣味是果蔬汁品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。乳酸菌發(fā)酵過程中，果蔬汁中的游離氨基酸以及糖類等物質(zhì)被水解成萜烯類物質(zhì)，使得烯萜類物質(zhì)含量增加，產(chǎn)生花果香以及香脂香氣，對(duì)果蔬汁的氣味產(chǎn)生影響[36]。采用優(yōu)化后的工藝參數(shù)發(fā)酵毛酸漿果汁，利用電子鼻確定了發(fā)酵果汁中的主要?dú)馕冻煞?，評(píng)價(jià)了乳酸菌發(fā)酵對(duì)毛酸漿果汁氣味的影響。

2.4.1 雷達(dá)圖分析

由圖7 可知，傳感器S7 對(duì)不同處理的樣品氣味的響應(yīng)值均為最大，其次是傳感器S9 和傳感器S2，說明樣品中萜烯類物質(zhì)和無機(jī)硫化物含量最高，其次為氮氧化合物和有機(jī)硫化物、芳香物質(zhì)。萜烯類物質(zhì)廣泛存在于植物和動(dòng)物體內(nèi)，越來越多的研究表明，萜烯類物質(zhì)具有抗氧化活性[21]，而硫化物廣泛存在于果酒中。發(fā)酵前后傳感器S7 響應(yīng)值差異明顯，萜烯類物質(zhì)和無機(jī)硫化物含量增加最明顯；揮發(fā)性香氣由強(qiáng)到弱依次為發(fā)酵果汁、滅菌發(fā)酵果汁、新鮮果汁和滅菌新鮮果汁，這說明乳酸菌發(fā)酵處理可以豐富果汁氣味，巴氏滅菌處理會(huì)降低果汁的氣味成分。

圖7 雷達(dá)分析圖Fig.7 Radar diagram

2.4.2 Loading 分析

4 個(gè)樣品揮發(fā)性氣味的Loading 分析如圖8 所示，傳感器的響應(yīng)值距原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對(duì)揮發(fā)性氣味成分的識(shí)別能力越強(qiáng)[37]。由Loading 分析圖可知，氣味總貢獻(xiàn)率為99.944%，對(duì)樣品揮發(fā)性成分貢獻(xiàn)率最大的感應(yīng)器是S7，其次是S2 和S9，其他感應(yīng)器的貢獻(xiàn)率差別不明顯，表明影響樣品果汁風(fēng)味差異的主要是萜烯類物質(zhì)、無機(jī)硫化物、氮氧化合物、有機(jī)硫化物和芳香物質(zhì)，其他成分差異不明顯。

圖8 Loading 分析圖Fig.8 Loading diagram

2.4.3 PCA 分析

4 個(gè)樣品揮發(fā)性氣味的PCA 分析如圖9 所示，每個(gè)橢圓代表不同樣品揮發(fā)性氣味成分的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)。分析得出，第一主成分貢獻(xiàn)率為93.176%，第二主成分貢獻(xiàn)率為6.768%，貢獻(xiàn)率之和為99.944%，大于90%，說明基本代表了樣品主要的氣味特征。在PCA圖中，每個(gè)橢圓內(nèi)數(shù)據(jù)點(diǎn)分布越緊密，說明樣品重復(fù)性越高；橫坐標(biāo)軸上的間距越大，說明樣品之間的差異性越大，由于第一主成分貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)高于第二主成分貢獻(xiàn)率，所以差異主要體現(xiàn)在第一主成分上。通過圖9 可以看出，滅菌前后的毛酸漿果汁差異不顯著，發(fā)酵前后的毛酸漿果汁差異非常明顯?？衫肔DA 圖進(jìn)一步分析。

圖9 PCA 分析圖Fig.9 PCA diagram

2.4.4 LDA 分析

4 個(gè)樣品揮發(fā)性氣味的LDA 分析如圖10 所示，通過LDA 分析得出，兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率之和為98.28%，高于70%～85%，說明方法可以使用[38]。通過圖10 可以看出，樣品間離散度大，說明不同處理對(duì)毛酸漿果汁的揮發(fā)性氣味有明顯的影響[39]。

圖10 LDA 分析圖Fig.10 LDA diagram

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)乳酸菌混合發(fā)酵毛酸漿果汁工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，確定乳酸菌混合發(fā)酵毛酸漿果汁最佳工藝參數(shù)為：植物乳桿菌與副干酪乳桿菌接種比2∶1，接種量1.0%，在37 ℃下發(fā)酵12 h。在此條件下制作的毛酸漿果汁中富含多酚黃酮和萜烯類物質(zhì)，萜烯類物質(zhì)為毛酸漿果汁中香氣物質(zhì)種類最多且含量最高的物質(zhì)，具有柑橘類以及松木香氣。本研究為毛酸漿的深加工提供了參考。