周志明，呂 彪,4，閆 芳，張春云，王海平，王勤禮，王建東，徐 濤，張春梅,，陳 葉

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，蘭州 730000；2河西學(xué)院祖師麻原植物應(yīng)用技術(shù)研究所，甘肅張掖 734000；3甘肅泰康制藥有限責(zé)任公司，甘肅武威 733000；4河西學(xué)院鄉(xiāng)村振興研究院，甘肅張掖 734000）

0 引言

唐古特瑞香(Daphne tangutica Maxim)為瑞香科瑞香屬(Daphne linn)多年生小灌木，分布于甘肅、青海、四川、云南等海拔3000 m左右的山坡灌叢、林緣、溝谷地帶[1]。唐古特瑞香的根皮和莖皮為中國傳統(tǒng)中藥材‘祖師麻’，其果、葉可治鼻炎及下疳，花可治肺膿腫，根皮莖皮則具有祛風(fēng)除濕，止痛散瘀等功效[2]，臨床應(yīng)用非常廣泛?，F(xiàn)代研究揭示唐古特瑞香含有香豆素類、木脂素類、黃酮及二萜三萜原酸酯類等多種化學(xué)成分[3-4]，有抗炎、抑菌、抗瘧、降壓、鎮(zhèn)靜、催眠等藥理作用[5]。

唐古特瑞香耐寒、喜冷涼氣候，適生地域環(huán)境特殊，在干燥寒冷、植被單一的西北地區(qū)是難得的常綠灌木，亦為此地區(qū)水土保持和水源涵養(yǎng)的優(yōu)良生態(tài)樹種[6]，目前，中國的祖師麻藥材多以采挖野生唐古特瑞香為主，連根掘起的采藥方式已致使其野生植物資源日漸匱乏，加之唐古特瑞香種子量小，且不易發(fā)芽，天然更新能力弱，野生資源正面臨著前所未有的破壞，蘊(yùn)藏量急劇下降，不少地區(qū)已經(jīng)瀕于滅絕[7]。因此，唐古特瑞香人工種植工作勢在必行，實(shí)現(xiàn)祖師麻藥材的可持續(xù)利用已成為當(dāng)下亟需解決的問題。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對唐古特瑞香的研究主要集中在化學(xué)成分測定、藥理作用等方面[8-13]，對不同產(chǎn)地、不同年限唐古特瑞香不同部位有效成分含量測定鮮有研究?；诖耍狙芯坷肏PLC方法，測定不同地區(qū)（互助、哈溪）、不同年限（3、5和8年）及不同部位（根皮和莖皮）的唐古特瑞香中祖師麻甲素、7-羥基香豆素和紫丁香苷含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為下一步祖師麻人工高效種植、合理和可控地使用該類藥材提供科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)在甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院完成，于2020年11月—2021年5月進(jìn)行。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津20A-T液相色譜儀、萬分之一電子天平（FA2004上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×150 mm)、十萬分之一電子天平（PT-124/85S福州華志科學(xué)儀器有限公司）、數(shù)控超聲波清洗器（KQ3200DE昆山市超聲儀器有限公司）、KQ-500E型超聲波清洗器、DFT-50手提式中藥粉碎機(jī)（世諾）。

1.2 試劑

祖師麻甲素（批號：B21084 HPLC≥98%上海源葉生物科技有限公司）、7-羥基香豆素（批號：B21854 HPLC≥98%上海源葉生物科技有限公司）、紫丁香苷（批號：Cas：118-34 HPLC≥99.90%成都麥德生科技有限公司）。流動(dòng)相A：甲醇（批號：20170920256，色譜純）；流動(dòng)相B：乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；流動(dòng)相C：娃哈哈水；流動(dòng)相D：磷酸（優(yōu)級純）。

1.3 材料

不同年份和產(chǎn)地唐古特瑞香不同藥用部位藥材12批次，見表1。

表1 不同年份的樣品來源

2 方法和結(jié)果

2.1 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)以武威天祝藏族自治縣哈溪鎮(zhèn)和青海省互助土族自治縣的唐古特瑞香為研究對象，選取3年生、5年生和8年生唐古特瑞香植株，剝?nèi)「ず颓o皮，分別剪碎置于室內(nèi)晾干，將材料粉碎裝入樣品袋，以待備用。

2.1.1 祖師麻甲素和7-羥基香豆素含量的測定 對照品溶液的制備：精密稱取祖師麻甲素和7-羥基香豆素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，于50 mL容量瓶中，加85%甲醇至容量瓶的2/3，超聲5 min，在用85%甲醇定容至刻度線，搖勻，即得到祖師麻甲素和7-羥基香豆素含量分別為0.2076 mg/mL和0.1956 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液單品。抽取溶液沖洗針管1～2次，再取溶液，換下針頭，安裝針頭過濾器（有機(jī)膜），將針管中溶液打出一半倒入廢瓶，剩余一般裝入樣品瓶2/3。

供試品溶液的制備：精密稱取唐古特瑞香樣品粉末約1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加水80 mL，密塞，稱定重量，超聲提取45 min（功率25 w，頻率25 khz），放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾到錐形瓶（將初濾液倒入廢瓶），再取過濾液沖洗針管1～2次，換下針頭，安裝針頭過濾器（有機(jī)膜），將針管中溶液打出一半倒入廢瓶，剩余一半裝入樣品瓶2/3。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm)；對祖師麻甲素和7-羥基香豆素的測定，流動(dòng)相使用乙腈∶0.05%磷酸(10∶90)，流速為0.9 mL/min，檢測波長是327 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μL。在此條件下對照品（圖1、2）和供試品（圖3）色譜在26 min和46 min有色譜峰。

圖1 祖師麻甲素對照品色譜圖（左）

圖2 7-羥基香豆素對照品色譜圖（右）

圖3 祖師麻甲素和7-羥基香豆素供試品HPLC色譜圖

2.1.2 紫丁香苷含量的測定 對照品溶液的制備：精密稱取紫丁香苷對照品10 mg，于50 mL容量瓶中，加85%甲醇至容量瓶的2/3，超聲5 min，在用85%甲醇定容至刻度線，搖勻，即得到紫丁香苷含量為0.2064 mg/mL的對照品溶液單品。抽取溶液沖洗針管1～2次，再取溶液，換下針頭，安裝針頭過濾器（有機(jī)膜），將針管中溶液打出一半倒入廢瓶，剩余一般裝入樣品瓶2/3。

供試品溶液的制備：同2.1.1中供試品溶液制備一樣。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm)；對紫丁香苷的測定，流動(dòng)相使用流動(dòng)相使用甲醇∶水(20∶80)，流速為 0.9 mL/min，檢測波長是265 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μL。在此條件下對照品（圖4）和供試品（圖5）色譜在17 min有色譜峰。

圖4 紫丁香苷對照品色譜圖

圖5 紫丁香苷供試品HPLC色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取祖師麻甲素對照品溶液(0.4152 mg/mL)4、8、12、16、20 μL，精密吸取7-羥基香豆素(0.3912 mg/mL)4、8、12、16、20 μL，精密吸取紫丁香苷(0.4128 mg/mL)4、8、12、16、20 μL，按照上述條件分別注入色譜儀測定（分別以待測成分質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明線性關(guān)系良好。線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(r2)見表2。

表2 3種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液（含祖師麻甲素0.2076 mg/mL，7-羥基香豆素0.1956 mg/mL，紫丁香苷0.2064 mg/mL）20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果祖師麻甲素峰面積RSD為0.90%，7-羥基香豆素峰面積RSD為0.20%，紫丁香苷峰面積RSD為0.30%。表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批供試品（S4號樣品）6份，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，10，12 h按照2.1.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL。結(jié)果祖師麻甲素峰面積RSD=0.27%，7-羥基香豆素峰面積RSD為0.13%，紫丁香苷峰面積RSD為0.18%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次供試品（S7號樣品）6份，分別按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件實(shí)驗(yàn)，記錄峰面積并計(jì)算各待測組分含量。結(jié)果，祖師麻甲素平均含量為5.597 mg/g，RSD=0.50%(n=6)，7-羥基香豆素平均含量為0.899 mg/g，RSD=0.40%(n=6)，紫丁香苷平均含量為5.098 mg/g,RSD=0.40%(n=6)。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性較好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量得唐古特瑞香供試品（S7號樣）9份，每份取0.1 g，精密稱定，分別精密加入唐古特瑞香對照樣品（祖師麻甲素0.2076 mg/mL，7-羥基香豆素0.1956 mg/mL、紫丁香苷0.2064 mg/mL）儲(chǔ)備液1.5、1、0.5 mL，按照2.2.1項(xiàng)下方法制得供試品溶液，以上色譜條件測定：祖師麻甲素平均回收率為95.78%，RSD為1.8%；7-羥基香豆素平均回收率為95.84%，RSD為1，4%；紫丁香苷平均回收率為95.10%，RSD為1.4%。

2.3 樣品結(jié)果與分析

含量測定結(jié)果表明，唐古特瑞香香豆素主要3種活性成分在所有待測樣品中均能檢測出，每一樣類型中各成分含量變化不大，同一部位不同年限或同一年限不同部位的唐古特瑞香中各成分含量存在差異。利用SPSS 26對不同年限和不同部位的唐古特瑞香各成分含量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表3、4。

表3 同一部位不同年限唐古特瑞香樣品中3種成分含量的比較(x±s,n=3)

同一部位的樣品在不同年限各成分含量呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)積累見表3，除哈溪地區(qū)莖皮中紫丁香苷含量隨年限增長而增加外，其余不同地區(qū)、不同部位紫丁香苷的含量在第5年顯著增加(P＜0.05)；互助地區(qū)根皮和哈溪地區(qū)莖皮中祖師麻甲素、7-羥基香豆素，在第5年含量顯著減少(P＜0.05)；互助地區(qū)莖皮和哈溪地區(qū)根皮中祖師麻甲素含量次序分別為，3年生＞8年生＞5年生，5年生＞8年生＞3年生(P＜0.05)；互助地區(qū)莖皮與哈溪地區(qū)根皮中7-羥基香豆素含量次序分別為，5年生＞3年生＞8年生，3年生＞5年生＞8年生(P＜0.05)。

同一年限不同部位樣品各成分含量比較見表4，莖皮中祖師麻甲素、7-羥基香豆素和紫丁香苷含量顯著高于根皮中(P＜0.05)；哈溪地區(qū)莖皮祖師麻甲素含量顯著高于互助地區(qū)根皮和莖皮含量(P＜0.05)；5年生和8年生祖師麻甲素與3年生7-羥基香豆素和紫丁香苷的含量依次為互助莖皮＞哈溪莖皮＞互助根皮＞哈溪根皮(P＜0.05)；5年生和8年生紫丁香苷的含量依次為互助莖皮＞互助根皮＞哈溪莖皮＞哈溪根皮(P＜0.05)。

表4 同一年限不同部位唐古特瑞香樣品中3種成分含量的比較(x±s,n=3)

3 討論與結(jié)論

基于HPLC分析的中藥質(zhì)量控制與評價(jià)研究主要依靠指標(biāo)性有效成分的定量或定性分析策略。因此，合理選取指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定分析是中藥質(zhì)量評價(jià)的重要前提。HPLC已在唐古特瑞香成分含量測定、指紋圖譜研究以及資源化學(xué)開發(fā)方面應(yīng)用廣泛。本研究以《中國藥典》2020年版規(guī)定的香豆素為基礎(chǔ)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道常用于唐古特瑞香質(zhì)量評價(jià)的祖師麻甲素，7-羥基香豆素和紫丁香苷3種化合物作為HPLC指標(biāo)成分，建立同時(shí)測定祖師麻甲素和7-羥基香豆素2種成分和單獨(dú)測定紫丁香苷1種成分的HPLC體系。祖師麻甲素，7-羥基香豆素和紫丁香苷穩(wěn)定性差，對光、熱敏感，在供試品溶液制備時(shí)比較了甲醇超聲和甲醇回流的提取結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)長生45 min對3種成分的提取效果好，故采用簡便的超聲提取法，時(shí)間為45 min。同時(shí)采用紫外檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)對唐古特瑞香3種指標(biāo)性成分進(jìn)行掃描，結(jié)果祖師麻甲素在327 nm處波長有最大吸收，紫丁香苷在265 nm處波長有最大吸收，7-羥基香豆素在327 nm處波長有最大吸收。嘗試在327 nm波長處檢測，祖師麻甲素、7-羥基香豆素均具有較強(qiáng)響應(yīng)，但紫丁香苷峰幾乎不可見，故選擇327 nm為祖師麻甲素、7-羥基香豆素測定波長；嘗試在265 nm波長處檢測，祖師麻甲素與7-羥基香豆素響應(yīng)值雖有降低，但紫丁香苷響應(yīng)值明顯提高，且與相鄰雜質(zhì)峰分離良好，能夠達(dá)到檢測要求，故選擇265 nm為紫丁香苷測定波長。

中藥材的質(zhì)量形成過程與物種的生態(tài)環(huán)境關(guān)系極為密切，前期產(chǎn)地樣品采收、加工技術(shù)、后期運(yùn)輸及儲(chǔ)藏等對藥效都會(huì)產(chǎn)生中藥的影響[14]。從中藥的生產(chǎn)地來看，藥用植物生理代謝與環(huán)境因素的交互導(dǎo)致植物體內(nèi)次生長代謝物質(zhì)積累量不一致，這是道地藥材的核心問題[15]。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道唐古特瑞香資源分布狀況[7]以及有效成分的提取和測定方法[8-10]。王明時(shí)等[16]在唐古特瑞香中首次提取出了祖師麻甲素、7-羥基香豆素和紫丁香苷等多個(gè)成分。張超等[17]在研究中表示香豆素主要分布于祖師麻基原植物黃瑞香的根皮和莖皮；張金等[18]在測定祖師麻基原植物黃瑞香不同部位紫丁香苷含量的研究中表示，紫丁香苷在葉部含量較低，可以從根芯或莖芯中分離制備紫丁香苷。為了深入探究唐古特瑞香不同地區(qū)、不同年限及不同部位質(zhì)量形成的化學(xué)本質(zhì)，本研究進(jìn)行了3、5和8年生唐古特瑞香根皮和莖皮主要成分含量的動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種成分在不同年限或不同部位的唐古特瑞香樣品中含量積累并不一致。同一部位樣品，除哈溪地區(qū)根皮祖師麻甲素和互助地區(qū)莖皮7-羥基香豆素含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢外，其余地區(qū)的這2種成分均表現(xiàn)為先增加后減小，且3年生唐古特瑞香莖皮中含量最高；除哈溪地區(qū)莖皮紫丁香苷含量一直增加外，其余地區(qū)部位的含量均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，且5年生唐古特瑞香含量最高。同一年限內(nèi)，3年生和5年生唐古特瑞香根皮中3種成分含量大于8年生，但8年生莖皮中3種成分含量均高于根皮，說明唐古特瑞香的根皮和莖皮都是香豆素類化合物儲(chǔ)藏的主要器官，這些與黃瑞香的研究結(jié)果相似。5年生唐古特瑞根皮與莖皮總香豆素含量高達(dá)0.17%，說明互助地區(qū)各種環(huán)境生態(tài)因子適合唐古特瑞香香豆素的積累。

中藥發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)為主要有效成分，然而藥用部位有效成分積累的生物學(xué)本質(zhì)目前了解甚少。本研究揭示藥用唐古特瑞香主要有效成分在不同年限不同部位的差異積累，根皮與莖皮中的含量都很高，莖皮中含量稍高于根皮，佐證了唐古特瑞香根皮及莖皮入藥的認(rèn)識。唐古特瑞香如何通過生理代謝合成并轉(zhuǎn)運(yùn)有效成分至藥用部位貯藏，將是亟待解決的問題?，F(xiàn)如今祖師麻基原植物唐古特瑞香極度緊缺，因此，研究和推廣野生唐古特瑞香人工種植，模擬天然野生環(huán)境，采用溫室大棚種植或者組織培養(yǎng)技術(shù)，研究快速繁殖的方法，才能從根本上緩解祖師麻藥材的資源緊缺問題。