文/鄧起秀

肺炎鏈球菌是小兒肺炎、菌血癥、腦膜炎等諸多細(xì)菌感染疾病的主要病原菌之一，相關(guān)數(shù)據(jù)表明，全球5歲以下兒童中每年約有70～100萬死于肺炎鏈球菌性疾病。因此，加強(qiáng)對(duì)肺炎鏈球菌的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，早期采取針對(duì)性的抗菌藥物治療方案尤為重要。但有研究指出，不同的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法可取得不同的檢測(cè)結(jié)果。E-test法在臨床上較為常見，可取得較高的準(zhǔn)確性。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，全自動(dòng)微生物分析儀因其具有檢測(cè)快速、操作簡便、檢測(cè)準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)在臨床中得到廣泛應(yīng)用?；谏鲜霰尘?，本文將2021年7月至2021年11月本院兒科分離的30株肺炎鏈球菌作為研究對(duì)象，其中將青霉素用鄭州安圖E-test法與國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）進(jìn)行對(duì)比，其他抗菌藥物敏感性試驗(yàn)用溫州康泰藥敏紙片（K-B法）與國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）進(jìn)行對(duì)比，觀察檢測(cè)結(jié)果，旨在探索一種簡便、快速、有效的檢驗(yàn)方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)抽取2021年7月至2021年11月本院分離的肺炎鏈球菌30株進(jìn)行研究，均來源于兒科患兒的痰液、鼻腔分泌物等標(biāo)本（同一患兒同一標(biāo)本類型，不重復(fù)計(jì)入）。對(duì)應(yīng)的患兒信息為男23例，女7例；年齡1個(gè)月～6歲，平均（3.15±0.92）歲，其中1個(gè)月～1歲27例，1～3歲2例，3～5歲1例；肺炎2例，鼻竇炎1例，急性咽炎1例，支氣管肺炎26例；咳嗽14例，咳痰5例，喘息1例，氣促2例，發(fā)熱8例。

1.2 方法

試劑與儀器：K-B法藥敏紙片（溫州康泰），青霉素E-test紙條（鄭州安圖）、血瓊脂平板、5%綿羊血MHA平板（鄭州安圖），麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管、藥敏稀釋液、藥敏指示劑、樣本稀釋液、細(xì)菌鑒定藥敏鑒定板（珠海迪爾生物工程）。

（1）細(xì)菌分離鑒定：將標(biāo)本接種于血瓊脂平板中，放置于5%CO、35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，經(jīng)典型菌落形態(tài)觀察，挑選血平板上草綠色溶血、臍窩狀的可疑菌落做進(jìn)一步分純，同時(shí)采用藥敏紙片進(jìn)行奧普托欣敏感性試驗(yàn)，再用國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）鑒定為肺炎鏈球菌。

（2）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)：采用苛養(yǎng)菌5%綿羊血MHA平板以K-B法復(fù)核藥敏結(jié)果，其中青霉素采用E-test方法，同時(shí)也用國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。

（3）具體操作方法：

①K-B法：嚴(yán)格按照第四版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行，選取血瓊脂平板上菌落配置0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，用無菌棉拭子蘸取調(diào)好的菌液，擠出過多菌液，在5%綿羊血MHA平板表面反復(fù)均勻涂抹3次，每涂抹一次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂兩圈，待瓊脂表面菌液干燥，在15～20min內(nèi)用無菌鑷子將紙片貼于平板表面，各紙片中心距離不小于24mm，并確保紙片與平板表面完全接觸，放置于35℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24h后測(cè)量抑菌圈直徑。

②青霉素E-test方法：前述步驟與K-B法一致，待瓊脂表面菌液干燥用無菌鑷子將E試條貼于平板表面，確保整個(gè)藥敏條與瓊脂表面完全接觸，放置于35℃、5%的CO培養(yǎng)箱中孵育20～24h后讀取結(jié)果。

③微量肉湯稀釋法（參考方法）：取純培養(yǎng)單個(gè)菌落于稀釋液瓶內(nèi)壁研磨呈細(xì)菌懸液（2麥?zhǔn)希?，用連續(xù)移液器吸取該菌懸液加入試劑板A5-A12孔內(nèi)，每孔100μL，吸菌懸液500μL，加至增菌肉湯培養(yǎng)基中，充分混勻，繼續(xù)加入試劑板A1-A4、B1-B7孔內(nèi)，每孔100μL，在A1-A4、A9、B1-B7孔分別滴加無菌液狀石蠟兩滴；再吸剩余增菌肉湯培養(yǎng)基50μL，加至藥敏培養(yǎng)基，充分混勻，繼續(xù)加入試劑板其余各孔（所有的抗菌藥物MIC測(cè)定試驗(yàn)孔、生長對(duì)照空及6.5%NACL），每孔100μL，并在C1孔滴加無菌液狀石蠟2滴；封板然后放培養(yǎng)箱35℃18～24h后上機(jī)讀取結(jié)果。

（4）質(zhì)量控制：質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619，其藥敏結(jié)果必須符合質(zhì)控范圍。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）檢測(cè)結(jié)果：3種方法均根據(jù)CLSIM100第30版規(guī)定的折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果分析，主要分為3級(jí)：敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。（2）青霉素以E-test法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他藥物以K-B法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均經(jīng)國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）復(fù)核。參照上述CLSI規(guī)定的折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)，分析檢驗(yàn)結(jié)果：①分類符合（CA），國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）S、I、R結(jié)果與E-test法/K-B法檢驗(yàn)結(jié)果一致；②非常重大誤差（VME），國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）將R誤判為S；③重大誤差（ME），國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）將S判定為R；④一般誤差（mE），E-test法/K-B法檢驗(yàn)結(jié)果為S或R，而國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）結(jié)果為I或E-test法/K-B法檢驗(yàn)結(jié)果為I，而國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）結(jié)果為S或R?？山邮艿恼`差范圍：CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果分析

根據(jù)CLSI折點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)，珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）與E-test法/K-B法的S、I、R結(jié)果如表1所示。

表1 檢測(cè)結(jié)果分析

2.2 兩種檢測(cè)方法比較

青霉素以E-test檢驗(yàn)結(jié)果為參考，其他抗菌藥物以K-B法復(fù)核，國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）對(duì)青霉素、萬古霉素、左氧氟沙星、利福平、利奈唑胺、四環(huán)素的CA均為100.00%；對(duì)復(fù)方新諾明的CA為93.33%，ME為6.67%；對(duì)紅霉素、克林霉素的CA均為93.33%，mE均為6.67%。具體結(jié)果如表2所示。

表2 兩種實(shí)驗(yàn)方法比較［n=30，例（%）］

3 討論

肺炎鏈球菌是兒童呼吸道感染的主要致病菌之一，也是大葉性肺炎的病原菌，還可伴有菌血癥。肺炎鏈球菌屬條件致病菌，正常情況下定植于鼻咽部，當(dāng)機(jī)體免疫功能失衡時(shí)，可引起鼻竇炎、中耳炎等非侵襲性疾?。蝗艏?xì)菌入血，還可引起骨髓炎、菌血癥、敗血癥等，對(duì)患兒的生命安全造成威脅。隨著青霉素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性的問題日益突出，引起多重耐藥菌株，顯著增加臨床治療難度。有研究通過對(duì)某地區(qū)患兒的侵襲性肺炎鏈球菌病患兒進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，死亡病例的分離菌株多為多重耐藥菌株，故認(rèn)為多重耐藥與患兒的不良預(yù)后有一定的聯(lián)系；同時(shí)青霉素不敏感患兒合并基礎(chǔ)疾病、罹患腦膜炎、合并多種耐藥的概率依次為30.7%、32.0%、86.7%，均高于青霉素敏感肺炎鏈球菌患兒的15.4%、9.2%、63.1%。由此可見，青霉素引起的耐藥問題會(huì)對(duì)患兒的臨床預(yù)后產(chǎn)生不良影響，故選擇一種有效、安全的抗菌藥物尤為重要。王傳清等于2016年對(duì)10家兒童醫(yī)院進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌是我國兒童臨床優(yōu)勢(shì)分離株，且兒童的分離比例明顯高于成人；而肺炎鏈球菌青霉素不敏感株占比從0.9%到71%不等，提示細(xì)菌耐藥問題形勢(shì)嚴(yán)峻。

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，簡稱藥敏試驗(yàn)，是指在體外測(cè)定抗菌藥物抑制或殺滅微生物的能力，能夠?yàn)榕R床治療選擇準(zhǔn)確的抗菌藥物，常見的檢驗(yàn)方法包括肉湯稀釋法、E-tset法、紙片擴(kuò)散法等。抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，能夠針對(duì)菌株選擇敏感性抗菌藥物，最大化確?？垢腥局委熜Ч?，對(duì)于患兒的臨床治療及預(yù)后具有重要意義。根據(jù)CLSI相關(guān)規(guī)定，頭孢曲松、美羅培南等均可用于肺炎鏈球菌感染的治療，但針對(duì)上述藥物尚無可靠的K-B法進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，故建議應(yīng)采用MIC法進(jìn)行確定。全自動(dòng)微生物分析儀是目前國內(nèi)臨床廣泛應(yīng)用的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法，其中國產(chǎn)珠海迪爾細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）能夠測(cè)得青霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、利福平、萬古霉素等多種抗菌藥物的MIC值。該分析儀的檢驗(yàn)原理檢測(cè)系統(tǒng)由生化反應(yīng)孔和抗菌藥物MIC測(cè)定試驗(yàn)孔組成，在生化反應(yīng)孔加入細(xì)菌懸液，抗菌藥物MIC測(cè)定試驗(yàn)孔中加入培養(yǎng)基，經(jīng)35℃～37℃孵育。生化反應(yīng)在細(xì)菌代謝作用下直接產(chǎn)生顏色變化或經(jīng)加入顯色劑后產(chǎn)生顏色變化，抗菌藥物MIC測(cè)定試驗(yàn)根據(jù)試驗(yàn)孔是否出現(xiàn)渾濁（沉淀）確定細(xì)菌是否生長，通過細(xì)菌測(cè)定系統(tǒng)分析從而將細(xì)菌快速、準(zhǔn)確地鑒定到種屬，同時(shí)分析抗菌藥物的MIC值。本研究將青霉素以E-test法進(jìn)行試驗(yàn)，其他藥物以K-B法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示該分析儀對(duì)青霉素、萬古霉素、左氧氟沙星、利福平、利奈唑胺、四環(huán)素的CA均為100.00%，提示國產(chǎn)珠海迪爾測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）在上述6種抗菌藥物藥敏性試驗(yàn)中與E-test法/K-B法具有高度一致性。分析儀對(duì)復(fù)方新諾明、紅霉素、克林霉素的CA均為93.33%，＞90%，提示符合率在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。在誤差結(jié)果分析方面，發(fā)現(xiàn)分析儀對(duì)紅霉素、克林霉素的mE均為6.67%，符合≤10%的標(biāo)準(zhǔn)，提示誤差在可接受范圍內(nèi)；但對(duì)復(fù)方新諾明的ME為6.67%，不符合≤3%的標(biāo)準(zhǔn)，提示誤差在不可接受范圍內(nèi)。由此可見，對(duì)于肺炎鏈球菌，國產(chǎn)珠海迪爾測(cè)定系統(tǒng)檢（DL-96Ⅱ）測(cè)復(fù)方新諾明的藥敏試驗(yàn)不可靠，需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。但綜合研究結(jié)果可知，國產(chǎn)珠海迪爾測(cè)定系統(tǒng)（DL-96Ⅱ）可檢出肺炎鏈球菌對(duì)多種抗菌藥物的敏感性，且與K-B法相比存在較高的一致性，證實(shí)該分析儀在肺炎鏈球菌中抗菌藥物敏性試驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。黃梅等研究中還指出，全自動(dòng)微生物分析儀檢驗(yàn)快速、重復(fù)性高，可顯著提升工作效率，且受到人為因素的影響較小，檢驗(yàn)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。

綜上所述，全自動(dòng)微生物分析儀具有檢驗(yàn)準(zhǔn)確、操作簡便、快速、受人為因素影響小、重復(fù)性高、精確檢測(cè)細(xì)菌的MIC濃度、結(jié)果符合率高等特點(diǎn)，可檢出兒科肺炎鏈球菌對(duì)大部分抗菌藥物的敏感性，但在復(fù)方新諾明的敏感試驗(yàn)中尚存在一定的局限性，還需做進(jìn)一步驗(yàn)證。