張雪燕，吳思蒙，王太升，張繼紅

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是一種慢性、進(jìn)行性和破壞性的間質(zhì)性疾病，是肌成纖維細(xì)胞的異?；罨头只鴮?dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)和膠原沉積[1-2].三氯乙烯(TCE)作為溶劑，用做脫脂劑、制冷劑制造中的化學(xué)中間體，還是去斑劑和黏合劑的成分，是一種常見的環(huán)境污染物[3].TCE的毒性已被廣泛證實(shí)，長期與TCE接觸，可導(dǎo)致肝、腎和皮膚受損，并可能引起癌癥[4].在2013—2014年健康和營養(yǎng)檢查調(diào)查中，TCE在血液中的檢出率為0.6%[5].國外有研究[6]報(bào)道，TCE可以引起過敏性肺炎，但對肺部損傷的研究甚少.本研究通過小鼠肺纖維化實(shí)驗(yàn)探討TCE可導(dǎo)致肺部纖維化及其機(jī)制，為以后臨床治療肺部損傷提供一定的依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF級雄性小鼠45只(長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，SCXK(吉)：2011-0004)，體質(zhì)量(20±2)g，6～8周齡.飼養(yǎng)條件為室溫21～25 ℃，濕度50%～65%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食水，小鼠飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn).

1.2 主要儀器與試劑

試劑α-SMA、CTGF、COL-I單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；組織切片機(jī)(上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；病理石蠟包埋機(jī)(沈陽譽(yù)德電子儀器有限公司)；病理組織展片機(jī)(天津天利航空機(jī)電有限公司)；自動脫水機(jī)(LEICA ASP 300S，北京悅昌行科技有限公司)；三氯乙烯 (天津市大茂化學(xué)試劑廠)；靜式染毒柜(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室).

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物模型建立

選取45只雄性小鼠，喂養(yǎng)1周，將小鼠隨機(jī)分組，空白對照組5只，不做任何處理；TCE染毒組40只，采用靜式吸入法對小鼠進(jìn)行染毒，染毒時(shí)小鼠禁食水，保證染毒柜密閉性良好.將TCE染毒組小鼠分為低劑量(1 500 mg/m3)組與高劑量組(5 500 mg/m3)，每組20只，每次吸入時(shí)間 2 h；于2個(gè)月、3個(gè)月時(shí)各斷髓處死10只.

2.2 HE與特殊染色

小鼠肺取材后，在10%中性福爾馬林溶液中固定36 h，經(jīng)組織脫水、二甲苯中透明、石蠟包埋和切片(厚度4 μm)后進(jìn)行常規(guī)HE染色及特殊染色(Masson染色、網(wǎng)狀纖維染色及彈力纖維染色).

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測COL-I、SMA、CTGF的表達(dá)

肺組織石蠟切片后用二甲苯脫蠟，經(jīng)不同梯度的酒精處理后，再用PBS緩沖液清洗，pH 8.0 EDTA抗原修復(fù)，3%雙氧水封閉；滴加一抗，在37 ℃下孵育60 min，二抗及三抗孵育20 min，DAB顯色；最后為蘇木素染核，分化返藍(lán)，脫水透明，封片.空白對照組一抗選用PBS緩沖液替代.顯微鏡下分析α-SMA、CTGF及COL-I蛋白的表達(dá)，使用Image Pro Plus 6.0計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)對免疫組化的圖像進(jìn)行半定量分析，在高倍鏡(400×)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算平均光密度值.

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 小鼠肺組織大體觀察

空白對照組小鼠肺部沒發(fā)現(xiàn)異常，肺部表面輪廓清晰，光滑有彈性，呈粉紅色，無結(jié)節(jié)及出血點(diǎn).通過大體觀察發(fā)現(xiàn)，低劑量組小鼠表面彈性略差，局部可見出血點(diǎn)，呈暗紅色，其余肺組織呈灰紅色；2個(gè)月高劑量組肺表面彈性差，呈灰紅灰白色，體積有所減小；3個(gè)月高劑量組小鼠肺組織表面呈灰紅灰白色，粗糙，質(zhì)地略硬，彈性較差，體積縮小.

3.2 肺組織病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯微鏡下顯示：空白對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)無異常，肺泡壁間隔無增厚，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤不明顯；低劑量組小鼠支氣管周圍可見大量炎細(xì)胞浸潤，血管充血，肺泡內(nèi)出血，肺氣腫形成；2個(gè)月高劑量組小鼠可見肺泡間隔增寬，支氣管周圍纖維組織增生，部分肺泡融合；3個(gè)月高劑量組部分肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞融合，肺泡壁隔增寬明顯，周圍支氣管纖維組織明顯增生，支氣管上皮異常增生.見圖1.

圖1 小鼠肺組織HE染色(×400)Fig.1 HE staining of mouse lung tissue(×400)

3.3 Masson染色、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維染色

Masson染色觀察顯示：空白對照組小鼠可見氣管周圍、肺間質(zhì)分布少量藍(lán)色膠原纖維，肺泡結(jié)構(gòu)清晰.低劑量組小鼠氣管周圍、肺間質(zhì)分布的藍(lán)染膠原纖維，比正常對照組略增生；2個(gè)月高劑量組小鼠氣管周圍及肺間質(zhì)均可見分布藍(lán)染的膠原纖維沉積，呈束狀；3個(gè)月高劑量組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，分布大量藍(lán)色膠原纖維聚集.見圖2.

1.Masson染色；2.彈力纖維染色；3.網(wǎng)狀纖維染色.圖2 特殊染色(×400)Fig.2 Special staining(×400)

經(jīng)維多利亞藍(lán)彈力纖維染色后顯微鏡下顯示：正常對照組肺泡壁基底膜線條呈深藍(lán)色，肺泡結(jié)構(gòu)正常；低劑量組肺泡壁基底膜部分彈性纖維斷裂，出現(xiàn)肺氣腫；高劑量組小鼠可見肺泡壁基底膜內(nèi)彈力纖維廣泛斷裂、變細(xì).見圖2.

網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果顯示：空白對照組分布極少量網(wǎng)狀纖維，低劑量組小鼠肺組織網(wǎng)狀纖維比正常對照組略增生，高劑量組3個(gè)月時(shí)肺網(wǎng)狀纖維增生、肺泡隔增厚較2個(gè)月時(shí)明顯.見圖2.

3.4 免疫組化檢測肺組織內(nèi)CTGF、α-SMA及COL-I蛋白的表達(dá)

經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示：空白對照組小鼠肺組織CTGF蛋白表達(dá)較低.與正常對照組比較，各組小鼠肺組織CTGF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，在低劑量組中CTGF主要表達(dá)于肺泡上皮及氣管上皮細(xì)胞，且與2個(gè)月小鼠比較3個(gè)月小鼠肺組織中CTGF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；在高劑量組中，成纖維細(xì)胞中也有CTGF的表達(dá)，且與2個(gè)月比較3個(gè)月小鼠肺組織中CTGF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05).見表1.

空白對照組小鼠肺組織可見少量α-SMA、COL-I蛋白表達(dá)，與正常對照組比較，高劑量小鼠肺組織α-SMA、COL-I蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，在低劑量組中2個(gè)月小鼠的肺組織α-SMA、COL-I蛋白表達(dá)無顯著差異性，3個(gè)月小鼠的肺組織α-SMA、COL-I蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05).α-SMA、COL-I蛋白除正常表達(dá)于氣道平滑肌外，少量表達(dá)于肌成纖維細(xì)胞，呈散在性，在低劑量或高劑量組中，與2個(gè)月小鼠比較3個(gè)月小鼠肺組織中α-SMA、COL-I蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05).見圖3、表1.

1.SMA；2.CTGF；3.Col-I.圖3 小鼠肺組織免疫組化染色(×400)Fig.3 Immunohistochemical staining of mice lung tissue(×400)

表1 各組小鼠CTGF、α-SMA、COL-I蛋白表達(dá) Tab.1 CTGF， α-SMA，COL-I protein expression in each group

4 討 論

肺纖維化是一病因未明的肺間質(zhì)性疾病，可引起彌漫性肺泡炎、成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的病理性增生、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 沉積，進(jìn)而導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，最終引起低氧性呼吸衰竭.肺纖維化是由多種損傷因素引起的，如成纖維細(xì)胞增殖、肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)堆積，從而改變肺結(jié)構(gòu)及功能[7].成纖維細(xì)胞灶包括成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)和肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MB)[8]，在刺激因子的作用下，促進(jìn)肺纖維化進(jìn)一步發(fā)展的主要細(xì)胞是肺成纖維細(xì)胞.成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化是肺纖維化過程中的重要介導(dǎo)因素[9].另外，肌成纖維細(xì)胞能分泌大量的ECM，包括膠原蛋白(主要成分)、蛋白多糖、纖維連接蛋白、彈性蛋白等基質(zhì)成分，而Ⅰ型膠原是最常見的ECM膠原[10].α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的主要分子，普遍被認(rèn)為是纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素，其表達(dá)增加會加重纖維化[11].此外，α-SMA還參與合成Col-Ⅰ、纖維連接蛋白、Col-Ⅲ等細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)纖維化的發(fā)生[12].因此，α-SMA及 Col-Ⅰ表達(dá)可以作為判斷肺纖維化程度的指標(biāo)[13].

結(jié)締組織生長因子(CTGF)是一種分泌性基質(zhì)蛋白，是近年發(fā)現(xiàn)的成纖維細(xì)胞分裂和膠原合成促進(jìn)劑，在肺纖維化的發(fā)生中發(fā)揮重要作用.CTGF普遍分布于腎、肝、肺、結(jié)締組織等組織器官中，是促纖維化刺激的下游因子，參與血管生成、肌纖維細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和創(chuàng)傷修復(fù)等活動，是組織重塑和纖維化的核心中介[14-16].FORKERT PG等[17]通過腹腔給藥的方式發(fā)現(xiàn)急性劑量的三氯乙烯可誘導(dǎo)肺纖維化，但其機(jī)制不清.三氯乙烯致肺損傷主要通過呼吸道途徑，而目前國內(nèi)外還未有通過吸入染毒法對三氯乙烯致肺纖維化進(jìn)行的研究.

本實(shí)驗(yàn)通過對小鼠在不同濃度、總體時(shí)間不同下吸入三氯乙烯誘導(dǎo)小鼠建立肺纖維化模型，結(jié)果顯示：三氯乙烯可導(dǎo)致小鼠肺部炎細(xì)胞浸潤、肺氣腫形成、肺泡壁基底膜斷裂、肺泡間隔增厚及纖維增生，這符合肺纖維化的主要病理特征，說明三氯乙烯致小鼠肺纖維化造模成功.通過免疫組化對CTGF、α-SMA及COL-I蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，α-SMA及COL-I蛋白低劑量組小鼠在2個(gè)月時(shí)蛋白表達(dá)不明顯，3個(gè)月時(shí)出現(xiàn)明顯表達(dá)，高劑量組都有明顯表達(dá)，說明隨著時(shí)間延長，或者在時(shí)間點(diǎn)相同下，增加三氯乙烯劑量后肺纖維化的程度加重，其機(jī)制與α-SMA、CTGF及COL-I蛋白表達(dá)有關(guān).此研究可為臨床診治肺纖維化提供參考.