王寧 鄭璐瑤 孟秀娟 劉海婷 丁楊明 姚蓉 郭少晨 陸宇

【Fundprogram】 Beijing Municipal Science and Technology Commission (Z191100006619090); Special Program for Clinical Medicine Development of Beijing Hospital Management Center (ZYLX202123)

N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(N-acetyltransferase-2，NAT2)是人體內(nèi)一種重要的Ⅱ相代謝酶，主要在肝臟及腸道上皮中表達，參與體內(nèi)多種物質(zhì)的代謝過程[1]。由于基因多態(tài)性的存在，個體NAT2代謝能力存在明顯差異，可分為NAT2快、中間及慢代謝型[2]。研究證實，人群中不同NAT2代謝型與腫瘤、帕金森病等多種疾病及藥物不良反應的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，發(fā)病機制考慮與NAT2慢乙?；瘜е碌臋C體毒性物質(zhì)蓄積有關(guān)[3-7]。2021年11月發(fā)布的《結(jié)核病患者N-乙?；D(zhuǎn)移酶2編碼基因多態(tài)性檢測與異煙肼合理用藥專家共識》明確指出NAT2代謝型與抗結(jié)核藥物異煙肼的療效與不良反應有關(guān)，在患者接受異煙肼抗結(jié)核治療時確定其NAT2基因型對患者的精準化治療至關(guān)重要[8]。

不同種族、地區(qū)人群NAT2基因型、單體型分布存在明顯差異[2，9]。例如，在歐洲人群中NAT2*5等位基因攜帶率約為50%左右，但該等位基因在東亞人群中攜帶率僅為5%；在東亞人群中攜帶率約為20%的NAT2*7等位基因，在歐洲人群中攜帶率卻不足5%；NAT2*14等位基因在非洲及美洲人群中攜帶率約為10%，但在歐洲及亞洲人群中基本不攜帶此等位基因。因此，明確中國人群NAT2基因型及等位基因分布至關(guān)重要。

目前國內(nèi)外結(jié)核病研究領(lǐng)域NAT2基因多態(tài)性研究中大多以檢測NAT2中特定單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點作為確定NAT2基因型的依據(jù)，常見的檢測位點為341T→C(或481C→T)、590G/A、857G/A，分別對應*5、*6、*7等位基因，上述3種等位基因可解釋中國人群中大部分的慢乙?；x類型[10]。3SNP法采用341T→C、590G→A、857G→A等3個SNP位點對NAT2基因型進行推斷，2SNP法利用2個SNP位點(282C→T、341T→C)推斷NAT2基因型。Hein和Doll[11]報道4SNP法(191G→A、341T→C、590G→A、857G→A)推斷NAT2基因型的準確性與7SNP法相當，優(yōu)于tagSNP(rs1495741)、2SNP(282C→T和341T→C)及3SNP法(341T→C、590G→A、857G→A)。由于rs180127919(191G→A)位點突變僅存在于非洲人群中，因此，其研究中4SNP法在中國人群NAT2基因型推斷時實質(zhì)上等同于3SNP法。Selinski等[12]發(fā)現(xiàn)2SNP法推斷NAT2基因型的效能與經(jīng)典的7SNP法相當，優(yōu)于tagSNP法。在中國人群中NAT2不同推斷方法效能的比較研究尚未見報道，筆者對已發(fā)表的包含中國人群NAT2基因型信息的文獻進行了檢索，構(gòu)建了中國人群NAT2基因型數(shù)據(jù)庫，并對不同NAT2基因型推斷方法的效能進行評價。

材料和方法

1.文獻檢索：對包含中國人群NAT2基因多態(tài)性數(shù)據(jù)的文獻進行檢索，檢索范圍包括Medline、PubMed、Embase、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)和萬方醫(yī)學網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，檢索時限為數(shù)據(jù)庫建庫至2021年12月1日，同時對納入文獻的參考文獻進一步手工檢索。英文檢索詞：NAT2、N-acetyltransferase、polymorphism、China或Chinese，以及這些詞的同義詞或擴展詞；中文檢索詞：NAT2、基因多態(tài)性、中國，以及這些詞的同義詞或擴展詞。

2.文獻納入及排除標準：(1)納入標準：①NAT2 基因多態(tài)性檢測方法為PCR直接測序法或至少檢測NAT2基因第2外顯子6個SNP位點(rs1041983、rs1801280、rs1799929、rs1799930、rs1208、rs1799931)；②研究結(jié)果NAT2基因多態(tài)性數(shù)據(jù)中包含亞型(如*6A、*7B等)信息及對應頻數(shù)信息；③如遇同一項研究階段結(jié)果發(fā)表在不同期刊的情況，則對數(shù)據(jù)進行合并、整理，選擇包含內(nèi)容詳細、數(shù)據(jù)廣泛的研究。(2)排除標準：①文獻結(jié)果只報道NAT2快、慢代謝基因型而未報道具體NAT2基因型(雙體型)及亞型數(shù)據(jù)；②研究人群不在中國境內(nèi)。

3.文獻數(shù)據(jù)評價及處理：使用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)評分表對納入的文獻進行質(zhì)量評價和風險評估。提取文獻中NAT2基因型及等位基因信息，重建單項研究NAT2基因型數(shù)據(jù)庫并利用Phase 2.1軟件[13-15]進行單體型和雙體型重建及驗證，對于文獻中與軟件基因型推測不符的數(shù)據(jù)進行分析和修正。NAT2等位基因和基因型分型標準參考人類NAT2等位基因庫(http://nat.mbg.duth.gr/Human%20NAT2%20alleles_2013.htm)。提取文獻中對照組人群NAT2基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建中國人群NAT2基因型分布數(shù)據(jù)庫，比較和分析不同地區(qū)NAT2等位基因和基因型分布特點。SNP位點信息及人群分布數(shù)據(jù)通過美國國家生物信息中心SNP數(shù)據(jù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及中國漢族基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.biosino.org/pgghan2/index)查詢?；跇?gòu)建的NAT2基因型數(shù)據(jù)庫，評估不同NAT2基因型分型方法的準確性。

4.統(tǒng)計學處理：不同研究的NAT2基因型及等位基因分布以“頻數(shù)和頻率(%)”描述，通過WPS電子表格整理數(shù)據(jù)。不同NAT2基因型推斷方法(3SNP法及2SNP法[11])性能評價指標包括敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度，推斷方法效能的比較采用McNemar檢驗和Kappa一致性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.文獻篩選結(jié)果：經(jīng)過文獻檢索及篩選，最終納入10項研究[4-5，16-23]。具體文獻篩選過程及文獻基本信息見圖1及表1。

表1 納入研究文獻信息匯總

圖1 文獻篩選流程圖

2.納入文獻風險偏倚評價：使用NOS評分表對納入的文獻進行質(zhì)量評價和風險評估。量表共分為3個主要評價指標，分別為研究對象選擇、組間可比性、暴露因素測量。每項下分別有4、2、3個小項，根據(jù)文獻內(nèi)容是否符合分別賦值，最高為9★，得分越高，文獻質(zhì)量越高，納入文獻評價情況見表2。

表2 納入文獻的偏差風險和質(zhì)量評估

3.文獻中NAT2基因型及等位基因信息提取及整理：10篇文獻中3篇文獻NAT2基因型分型采用直接測序法，7篇采用間接方法檢測至少6個SNP位點的多態(tài)性并對個體的NAT2基因型進行推斷。利用7篇文獻中個體的NAT2基因型(雙體型)信息重建各自單項研究NAT2基因型數(shù)據(jù)，并使用Phase 2.1軟件驗證原文獻的推測結(jié)果。

在上海-2012研究[20]中檢測到*14A等位基因，查詢美國國家生物技術(shù)信息中心SNP數(shù)據(jù)庫及中國漢族人群基因組數(shù)據(jù)庫，*14A等位基因?qū)膔s1801279位點僅在非洲裔人群具有多態(tài)性，中國人群此位點全部為GG型，在整理數(shù)據(jù)時將該研究中的這2例刪除。

在上海-2016研究[5]中，共有477例中間代謝型，根據(jù)Phase 2.1基因型推斷結(jié)果，分別將477例推斷為*4/*5B(31例)、*4/*6A(261例)及*4/*7B(185例)。該研究中有12例未能明確基因亞型，僅能判斷為快代謝及慢代謝等位基因雜合個體，在計算人群NAT2基因型分布時納入這12例，由于不能確定SNP位點多態(tài)性信息，評估不同NAT2分型方法及統(tǒng)計不同等位基因頻率時未納入這12例中間代謝型個體。

在長沙-2006研究[4]中，NAT2分型結(jié)果匯總表中，共有3種基因型無法確定基因亞型，分別是NAT2*6A/282.481、NAT2*6B/282.481及NAT2*6E/282.481，通過查詢?nèi)祟怤AT2基因數(shù)據(jù)庫(最后更新2016年4月18日)，未查詢到同時攜帶282C→T與481C→T的NAT2等位基因，且即使理論上存在282C→T與481C→T共同突變的等位基因，由于此2個位點都是同義突變，帶有282C→T與481C→T的等位基因也應該是NAT2快代謝等位基因。利用Phase 2.1軟件對該研究NAT2基因型數(shù)據(jù)進行單體型及雙體型重建，上述3種基因型重新推斷為*13/*6N、*4/*6N、*11/*6N。由于3種基因型都是快代謝及慢代謝等位基因雜合子，3種基因型均推斷為NAT2中間代謝基因型。

剩余4項研究中，經(jīng)Phase 2.1軟件推斷結(jié)果與研究匯報推斷結(jié)果一致。

4.納入文獻中對照組NAT2基因型及等位基因信息匯總：對上述整理后的數(shù)據(jù)進行匯總，提取單個研究中對照組NAT2基因型及等位基因數(shù)據(jù)(廣州-2011研究為結(jié)核病患者，該研究所有數(shù)據(jù)納入?yún)R總)構(gòu)建中國人群NAT2基因型數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫包含4010例個體的基因型數(shù)據(jù)匯總信息。(1)匯總數(shù)據(jù)中NAT2快代謝基因型、中間代謝基因型、慢代謝基因型總體頻率分別為25.79%(1034/4010)、50.87%(2040/4010)、23.34%(936/4010)，NAT2非慢代謝基因型總體頻率為76.66%(3074/4010)，具體見表3。(2)匯總數(shù)據(jù)中NAT2快代謝等位基因包括*4、*13、*11A、*12A、*12B、*12C，NAT2快代謝等位基因總體攜帶頻率為51.19%(4096/8002)。其中，*4等位基因占全部快代謝等位基因的96.92%(3970/4096)；匯總數(shù)據(jù)中慢代謝等位基因包括*5、*6、*7、*10、*19，NAT2慢代謝等位基因總體攜帶頻率為48.81%(3906/8002)，其中*5、*6、*7等位基因占所有慢代謝等位基因的99.90%(3902/3906)，具體見表4。北京-2012研究[16]在北方人群中檢測到*10及*19等位基因，在該研究人群中的攜帶率均為0.93%(2/214)。

表3 納入研究文獻中NAT2基因型分布情況

表4 納入研究文獻中NAT2等位基因分布情況

5.不同方法推斷NAT2基因型效能：基于10篇文獻的所有能夠獲得精確基因型(雙體型)的NAT2多態(tài)性數(shù)據(jù)，重建包含5448例NAT2基因型信息數(shù)據(jù)庫(表5)，基于此數(shù)據(jù)庫，對3SNP及2SNP法推斷NAT2代謝基因型的效能進行評價。

表5 3SNP法及2SNP法推斷NAT2基因型結(jié)果

續(xù)表5

3SNP法采用341T→C、590G→A、857G→A等3個SNP位點對NAT2基因型進行推斷。借鑒文獻報道中采用的積分法，每個位點如果為野生型純合子，則積0分，如果為雜合子則積1分，突變純合子則積2分，將上述3個位點所得積分相加，如果總分為0分，則推斷為NAT2快代謝型，如果總分為1分，則推斷為NAT2中間代謝型，積分≥2分，則推斷為NAT2慢代謝型。3SNP法推斷NAT2基因型共有4種基因型出現(xiàn)錯誤，分別是*4/*6J、*4/*10、*4/*19、*6A/*19，總體推斷錯誤率為0.22%(12/5448)。3SNP法推斷NAT2慢代謝基因型的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為99.92%、99.81%、99.36%、99.98%、99.83%；推斷NAT2快代謝基因型的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為100.00%、99.92%、99.80%、100.00%、99.94%(表6，7)。

表6 3SNP法推斷NAT2慢代謝基因型效能分析

表7 3SNP法推斷NAT2快代謝基因型效能分析

2SNP法利用2個SNP位點(282C→T、341T→C)推斷NAT2基因型。每個位點如果為野生型純合子，則積0分，如果為雜合子則積1分，突變純合子則積2分，將上述3個位點所得積分相加，總分為0分推斷為NAT2快代謝基因型，總分為1分推斷為NAT2中間代謝基因型，積分≥2分推斷為NAT2慢代謝基因型。2SNP法推斷NAT2基因型共有19種基因型出現(xiàn)推斷錯誤，總體推斷錯誤率為6.74%(367/5448)。2SNP法推斷NAT2慢代謝基因型的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為99.52%、98.36%、94.54%、98.66%、97.71%；推斷NAT2快代謝基因型的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為93.19%、96.01%、89.75%、97.41%、95.25%(表8，9)。

表8 2SNP法推斷NAT2慢代謝基因型效能分析

表9 2SNP法推斷NAT2快代謝基因型效能分析

將3SNP法及2SNP法推斷NAT2快、慢代謝基因型的效能進行對比。經(jīng)McNemer檢驗，兩種方法推斷NAT2慢代謝基因型敏感度的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.189，P=0.664)，具有較高的一致性(Kappa=0.932，P<0.01)。兩種方法推斷NAT2快代謝基因型敏感度的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.973，P=0.001)，3SNP法推斷NAT2快代謝基因型時優(yōu)于2SNP法。

討 論

本研究納入10項研究，重建的NAT2數(shù)據(jù)庫在一定程度上可以反映中國人群NAT2基因型構(gòu)成情況。10項研究中對照組共4010例，非慢代謝基因型占到了所有人群的76.7%，快、慢等位基因分別占51.19%及48.81%。在中國人群中，NAT2基因型分布以非慢代謝型為主。

除了常見的NAT2慢代謝等位基因*5、*6、*7外，在北京-2012[16]研究中檢測到*10及*19等位基因。*19等位基因最早由日本學者發(fā)現(xiàn)[24]，190C→T(rs1805158)突變使NAT2基因第64位的精氨酸變成了色氨酸，導致NAT2酶活性的下降。通過在中國漢族基因組數(shù)據(jù)庫查詢，rs1805158位點在我國漢族人群中堿基T總體攜帶率為0.146%，在北京、河南、江蘇、貴州、陜西5個地市均檢測到堿基T攜帶者，攜帶率分別為0.12%、0.089%、0.209%、2.08%、0.059%。*10等位基因?qū)氖莚s72554617(499G→A)，該突變使NAT2基因第167位的谷氨酸變成了賴氨酸，導致NAT2酶活性的下降。rs72554617位點在我國漢族人群中堿基A總體攜帶率為0.049%，在北京、上海、陜西、陜西、河南等9個地市均檢測到堿基A攜帶者，以安徽省攜帶率最高(0.45%)，其余地市攜帶率均低于0.15%。

采用既往文獻中報道的3SNP積分法對重建數(shù)據(jù)庫中的樣本進行推斷，所有46種NAT2基因型中，共有4種基因型推斷錯誤，分別是*4/*6J、*4/*10、*4/*19、*6A/*19，總體推斷錯誤率為0.22%。錯誤原因分為2類，其中，*10、*19等位基因存在499G→A和190C→T突變，這使得在使用3SNP方法對*4/*10、*4/*19基因型推斷時，將中間代謝型錯誤地推斷為快代謝型，而*6A/*19慢代謝型推斷為中間代謝型。另一類推斷錯誤是由于*6J等位基因的存在，基因型為*4/*6J的個體3SNP推斷法積分為2分，3SNP法將該種基因型推斷為慢代謝型。針對此種情況，如果受檢者通過3SNP法檢測結(jié)果為TT、AG、AG，則該個體可能的基因型為*4/*6J或者*6/*7，其抗結(jié)核治療異煙肼用量可根據(jù)異煙肼血藥濃度檢測結(jié)果進行調(diào)整。

當SNP檢測對341T→C、590G→A、857G→A等3個位點檢測結(jié)果為CT、AG、GG或CT、GG、AG或TT、AG、AG或CT、AG、AG等4種情況時，理論上可能NAT2基因型為中間代謝型或者慢代謝型。但在本研究構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫中僅出現(xiàn)*4/*6J這一種基因型，其他理論上存在的3種檢測結(jié)果在納入的3項研究中并未檢測到。另外，筆者進一步查詢了人類NAT2等位基因庫，并未發(fā)現(xiàn)341T→C、590G→A、857G→A等3個位點同時為突變位點的NAT2等位基因。因此，如果樣本檢測為CT、AG、AG，3SNP法計算得分為3分，則按照目前人類NAT2等位基因庫的數(shù)據(jù)推斷該個體可確定為NAT2慢代謝型。

采用既往文獻中報道的2SNP積分法對數(shù)據(jù)庫中的樣本進行推斷，所有46種NAT2基因型中，共有19種基因型出現(xiàn)錯誤，總體推斷錯誤率為6.74%，遠高于3SNP法的推斷錯誤率(0.22%)。2SNP法推斷NAT2基因型的基礎(chǔ)是SNP位點590G→A和857G→A與282C→T存在連鎖不平衡，人群中282C→T一般伴隨590G→A或857G→A中的一種出現(xiàn)。因此，當個體中檢測到282C→T時，可以認為該個體攜帶590G→A或857G→A，此2種突變與*6及*7相對應。但在中國人群中，根據(jù)本研究結(jié)果看，282C→T與590G→A或857G→A之間的關(guān)聯(lián)強度并不高，282C→T也與*12或*13 相關(guān)聯(lián)。因此，2SNP法會將攜帶*13或*12等位基因的個體錯誤推斷為攜帶*6或*7等位基因，導致了較高的推斷錯誤率。2SNP法推斷性能在不同人群中存在較大差異，考慮與不同人群*13或*12等位基因攜帶比例有關(guān)，在*12及*13等位基因攜帶比例較高的人群中，2SNP法推斷NAT2基因型效能較差。

筆者對3SNP及2SNP法推斷NAT2基因型的效能進行了比較。在中國人群中推斷NAT慢代謝基因型時，3SNP法與2SNP法推斷結(jié)果一致性較好；但推斷NAT2快代謝基因型時，3SNP法推斷NAT2基因型總體效能優(yōu)于2SNP法。

本次納入研究中有3項研究的NAT2基因多態(tài)性檢測采用PCR直接測序法，7項研究基于有限SNP檢測的結(jié)果進行NAT2基因型推斷。為了確保數(shù)據(jù)的準確性，本文在7項研究結(jié)果NAT2基因型數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上采用Phase 2.1軟件進行了驗證，最大限度保證了NAT2基因型推斷結(jié)果的正確性。個別研究中部分樣本未能明確匯報NAT2基因亞型信息，因此，在對NAT2推斷方法進行評價時，刪除了這部分數(shù)據(jù)。盡管本研究納入了5448例樣本構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，研究群體涉及北京、上海、廣州等多個地區(qū)，但相對于我國龐大的人口數(shù)量，納入的樣本數(shù)據(jù)仍不能完全反映中國人群NAT2基因多態(tài)性特點。因此，本研究的結(jié)論需更大樣本的研究驗證。另外，納入研究中研究人群大部分以漢族為主，故尚需明確少數(shù)民族人群的NAT2基因型分布情況。

綜上所述，本研究中NAT2基因型數(shù)據(jù)庫的建立能夠為臨床工作中NAT2基因分型工作提供參考。由于不同人群NAT2基因型分布和構(gòu)成具有地域性差異，在*10、*19等罕見等位基因攜帶率較高地區(qū)，增加對190C→T和499G→A位點的檢測可以提高NAT2基因型推斷的準確性。綜合考慮3SNP法與2SNP法推斷NAT2基因分型效能的差異，建議在中國人群中采用3SNP法推斷NAT2基因型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻王寧：醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計分析；鄭璐瑤：實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計分析；孟秀娟：分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、統(tǒng)計分析、指導；劉海婷：實施研究、采集數(shù)據(jù)、支持性貢獻；丁楊明：采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、統(tǒng)計分析；姚蓉：實施研究、采集數(shù)據(jù)；郭少晨：實施研究、分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；陸宇：醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費、行政和技術(shù)及材料支持、指導