劉可可，李莎莎，駱強(qiáng)偉，徐 炎，王躍進(jìn)

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200）

0 引言

葡萄(Vitis vinifera L.)是跨越世界南北廣泛種植的重要經(jīng)濟(jì)果樹(shù)[1]。據(jù)聯(lián)合國(guó)FAO數(shù)據(jù)，截止到2019年世界葡萄種植總面積為693萬(wàn)hm2，生產(chǎn)量為7428萬(wàn)t；中國(guó)的葡萄種植面積為74.6萬(wàn)hm2，生產(chǎn)量為1437.2萬(wàn)t，鮮食葡萄產(chǎn)量達(dá)到了世界第一，種植面積達(dá)到了世界第二[2]。其廣泛用途呈現(xiàn)在鮮食、釀酒、制干、制汁、制醬?，F(xiàn)在生產(chǎn)上缺乏無(wú)核抗病優(yōu)質(zhì)的葡萄品種。所以，無(wú)核抗病葡萄新品種選育與性狀探究是亟需研究?jī)?nèi)容。早期的常規(guī)雜交育種方式既耗時(shí)，子代無(wú)核率又低，僅有0%～15.9%[3-4]。1982年，Ramming通過(guò)胚挽救技術(shù)成功獲得2株實(shí)生無(wú)核葡萄[5]。美國(guó)育種學(xué)家用胚挽救技術(shù)，證實(shí)后代無(wú)核率在85%以上[6]，育成的無(wú) 核 品 種 有‘Autumn Crisp’、‘Adora Seedless’、‘Melissa’等[7]。現(xiàn)在該技術(shù)被各國(guó)葡萄育種家廣泛應(yīng)用于無(wú)核葡萄育種工作中[8-13]。中國(guó)培育成功的無(wú)核葡萄品種有‘滬培1號(hào)’[14]、‘滬培2號(hào)’[15]、‘紫豐’[16]等。本課題組前期也對(duì)葡萄的無(wú)核性狀進(jìn)行了研究[17-19]。基于以往的研究成果，本試驗(yàn)利用中國(guó)野生葡萄的優(yōu)勢(shì)，加強(qiáng)抗病性狀育種研究，以歐洲無(wú)核葡萄作母本，中國(guó)刺葡萄‘塘尾’(Vitis davidii Foex.cv.Tangwei)、‘雪峰’(Vitis davidii Foex.cv.Xuefeng)及山葡萄‘雙優(yōu)’(Vitis amurensis Rupr.cv.Shuangyou)和歐山雜種‘北醇’(Vitis vinifera L.× Vitis amurensis Rupr.)為父本，將抗病性基因融入到無(wú)核品種中，采用胚挽救技術(shù)來(lái)提高育種效率。利用無(wú)核標(biāo)記SCF27-2000[20]以及課題組前期獲得的無(wú)核探針GSLP1-569[21]、抗霜霉病探針S294-369、S382-615[22]、抗白粉病探針 OPY13-661[23]對(duì)雜種后代進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，加快無(wú)核抗病葡萄的培育。為解決常規(guī)雜交育種效率低、無(wú)核品種不抗病、需要噴藥防病等問(wèn)題，選育出無(wú)核抗病新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年4月—2021年4月在西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃、旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所完成。父本為抗病性較強(qiáng)的山葡萄‘雙優(yōu)’，刺葡萄‘塘尾’、‘雪峰’，歐山雜種‘北醇’；母本均為歐洲無(wú)核葡萄品種。

1.2 主要儀器

葡萄專用雜交袋、尖頭鑷子(14 cm)、手術(shù)刀（23號(hào)）、解剖鏡、一次性塑料培養(yǎng)皿(90 mm)、培養(yǎng)基(ER、E20A、MM3)，PCR 儀(BIO-RADPTC-0200)、核酸染料（北京全式金）、瓊脂糖、電泳儀(Consort E844)、電泳緩沖液、超凈工作臺(tái)、凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大田雜交與胚挽救技術(shù)操作流程 在大田去雄時(shí)，選擇健壯的樹(shù)、健壯枝蔓、健壯結(jié)果母枝、健壯結(jié)果枝、健壯花序上健壯的花蕾進(jìn)行去雄，去雄后噴水，并套上專用雜交袋。柱頭表面溢出粘液時(shí)，選擇晴朗無(wú)風(fēng)的上午，8：00—10：00授粉，連授3天。后期子房膨大即授粉成功，否則進(jìn)行補(bǔ)授。根據(jù)母本的授粉日期，適時(shí)采收雜交果實(shí)。雜交果穗取回后，剪下果粒置于網(wǎng)兜(10 cm×12 cm)沖洗2～6 h。在超凈臺(tái)用酒精(75%)處理30 s，無(wú)菌水沖洗3～5次，次氯酸鈉(3%)處理20 min，無(wú)菌水沖洗3～5次。剝?nèi)∨咧榻臃N于胚發(fā)育培養(yǎng)基中。胚珠暗培養(yǎng)8周后，剖取胚接種至胚萌發(fā)培養(yǎng)基。胚40天左右長(zhǎng)大成苗，之后進(jìn)行擴(kuò)繁，煉苗，最終移栽到大田（圖1）。參考田莉莉[24]統(tǒng)計(jì)發(fā)育胚的枚數(shù)和成苗數(shù)，計(jì)算胚發(fā)育率和成苗率，公式(1)～(2)。

圖1 無(wú)核抗病葡萄胚挽救過(guò)程

1.3.2 取樣時(shí)間對(duì)胚挽救影響試驗(yàn)‘火焰無(wú)核’ב北醇’組合于授粉后37～42天，每天取1次雜交幼果；‘京可晶’ב北醇’組合于授粉后34～44天，隔天取1次雜交幼果，比較不同取樣時(shí)間對(duì)胚發(fā)育的影響。

1.3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)胚發(fā)育影響試驗(yàn) 取‘美麗無(wú)核’自然授粉后40天、‘昆香無(wú)核’自然授粉后45天、‘紅寶石無(wú)核’與‘赫什無(wú)核’自然授粉后60天的胚珠，分別接種于ER、MM3、E20A[25]培養(yǎng)基中。采用正交設(shè)計(jì)，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。比較不同培養(yǎng)基對(duì)胚發(fā)育結(jié)果的影響。

1.3.4 胚珠發(fā)育培養(yǎng)基中添加不同濃度多胺對(duì)胚挽救影響試驗(yàn) 取‘紅寶石無(wú)核’ב塘尾’雜交后的胚珠接種，以7 g/L瓊脂+60 g/L蔗糖+3 g/L活性炭+MM3為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)分別添加0、1、2、3、4、5 mmol/L的亞精胺、精胺和腐胺。采用正交設(shè)計(jì)，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。比較不同多胺，不同濃度對(duì)胚發(fā)育率和成苗率的影響。

1.3.5 雜交后代無(wú)核性狀和抗病性狀的早期鑒定 參考王躍進(jìn)等[26]使用CTAB法提取DNA。使用無(wú)核標(biāo)記GLSP1-569和SCF27-2000、抗霜霉病標(biāo)記S382-615和S294-369以及抗白粉病標(biāo)記OPY13-661進(jìn)行檢測(cè)，使用分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇雜種植株的性狀。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)核抗病葡萄胚挽救結(jié)果

共配置雜交組合15個(gè)（表1），獲取雜交果實(shí)13038個(gè)，接種胚珠8572枚，胚發(fā)育數(shù)1338枚，得到234棵雜交苗，平均成苗率2.73%。其中組合‘紅寶石無(wú)核’ב塘尾’雜交獲得的發(fā)育胚和成苗數(shù)量最多，得到922枚發(fā)育胚和178株雜交子代，胚發(fā)育率為40.17%，成苗率為7.76%。‘雙優(yōu)’作父本的組合中，成苗率最高的是以‘無(wú)核白’作母本，為3.08%。‘北醇’為父本的組合中，成苗率最高的是以‘火焰無(wú)核’做母本，為1.98%。父本為‘塘尾’的雜交組合中，成苗率最高的是‘紅寶石無(wú)核’做母本，為7.76%。

表1 無(wú)核抗病葡萄胚挽救結(jié)果

2.2 取樣時(shí)間對(duì)胚發(fā)育率和萌發(fā)率的影響

如表2所示，‘火焰無(wú)核’ב北醇’在授粉后42天取樣，雜交胚的發(fā)育率(11.37%)和萌發(fā)率(3.52%)達(dá)到最高；‘京可晶’ב北醇’在授粉后38天取樣，雜交胚的發(fā)育率(4.3%)和萌發(fā)率(1.08%)達(dá)到最高。

表2 不同取樣時(shí)期對(duì)胚挽救胚發(fā)育與成苗的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)胚發(fā)育率的影響

將‘紅寶石無(wú)核’、‘美麗無(wú)核’、‘昆香無(wú)核’與‘赫什無(wú)核’的胚珠分別接種于ER、MM3、E20A培養(yǎng)基上（表3），以這4個(gè)品種為母本進(jìn)行胚挽救，結(jié)果表明，在E20A培養(yǎng)基上胚發(fā)育率最高，分別為14.33%、4.5%、6.1%、10.33%，胚發(fā)育率差異顯著。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)胚發(fā)育與胚挽救成苗的效果

2.4 胚珠發(fā)育培養(yǎng)基中添加不同濃度多胺對(duì)發(fā)育胚數(shù)量和成苗數(shù)的影響

以MM3為基礎(chǔ)胚發(fā)育培養(yǎng)基，添加不同多胺、不同濃度，取‘紅寶石無(wú)核’ב塘尾’的胚珠接種，結(jié)果表明添加3 mmol/L腐胺對(duì)胚的發(fā)育和成苗率效果最優(yōu)(55.83%、20%)（表4）。其次是添加1 mmol/L亞精胺對(duì)胚的發(fā)育和成苗率影響較高(50.37%、12.78%)。隨著外源添加物質(zhì)的濃度提升，成苗數(shù)量以及幼苗長(zhǎng)勢(shì)呈現(xiàn)一個(gè)下降的趨勢(shì)（圖2）。由此可見(jiàn)，在胚發(fā)育時(shí)期添加適量外源多胺對(duì)胚發(fā)育和成苗有較好的效果。

圖2 MM3胚挽救胚珠發(fā)育培養(yǎng)基添加不同多胺處理的成苗與生長(zhǎng)情況

表4 MM3胚珠發(fā)育培養(yǎng)基中添加不同濃度多胺對(duì)胚挽救成苗的影響結(jié)果

2.5 分子標(biāo)記輔助選擇鑒定

2.5.1 無(wú)核、抗病標(biāo)記對(duì)雜交親本的鑒定 對(duì)6個(gè)雜交親本進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定（圖3），無(wú)核標(biāo)記GSLP1-569和SCF27-2000的鑒定結(jié)果中，‘紅寶石無(wú)核’、‘火焰無(wú)核’、‘昆香無(wú)核’均攜帶無(wú)核分子標(biāo)記，GSLP1-569和SCF27-2000可用于母本為以上親本的雜種無(wú)核性狀的鑒定；抗霜霉病標(biāo)記S382-615檢測(cè)出‘塘尾’攜帶此標(biāo)記，可用于父本為‘塘尾’的雜種鑒定?？顾共?biāo)記 S294-369 檢測(cè)出‘塘尾’、‘北醇’、‘雪峰’攜帶此標(biāo)記，可用于檢測(cè)父本為以上親本的雜種鑒定?？拱追鄄?biāo)記OPY13-661檢測(cè)出‘塘尾’、‘北醇’攜帶此標(biāo)記，因此可用于父本為‘塘尾’、‘北醇’的雜種鑒定?？购诙徊?biāo)記OPSO3-1354沒(méi)有檢測(cè)出特異性條帶。

圖3 葡萄無(wú)核、抗霜霉病標(biāo)記對(duì)雜交親本的鑒定結(jié)果

2.5.2 無(wú)核、抗病標(biāo)記對(duì)雜交后代的鑒定 不同分子標(biāo)記對(duì)雜交后代的鑒定結(jié)果見(jiàn)（表5），對(duì)‘火焰無(wú)核’ב北醇’24個(gè)雜種子代的檢測(cè)結(jié)果中，有7個(gè)株系同時(shí)攜帶抗霜霉病、抗白粉病、無(wú)核特異性條帶，占比29.17%。對(duì)‘紅寶石無(wú)核’ב塘尾’178個(gè)雜種子代檢測(cè)結(jié)果中，有6個(gè)株系同時(shí)攜帶抗霜霉病和抗白粉病、無(wú)核特異性條帶，占比3.37%。對(duì)‘火焰無(wú)核’ב昆香無(wú)核’18個(gè)雜種子代檢測(cè)結(jié)果中，有5個(gè)株系同時(shí)攜帶2種無(wú)核標(biāo)記特異性條帶，后代無(wú)核株率為27.78%。對(duì)‘火焰無(wú)核’ב塘尾’和‘紅寶石無(wú)核’ב雪峰’5個(gè)雜種子代檢測(cè)結(jié)果中，這2個(gè)組合后代無(wú)核與抗白粉病株率為100.0%。‘火焰無(wú)核’ב塘尾’有3個(gè)株系同時(shí)攜帶無(wú)核抗霜霉病特異性條帶，后代抗霜霉病株率為75.0%。

表5 不同分子標(biāo)記對(duì)雜交后代鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

第一個(gè)無(wú)核葡萄品種‘梅爾’，是美國(guó)的Meier于1922年得到(Merer Everbearing)[27]。當(dāng)時(shí)，一個(gè)新品種的問(wèn)世用了10～20年的時(shí)間選育[3-4,30-31]，選育無(wú)核后代的效率有待提高。胚挽救技術(shù)最早應(yīng)用在果樹(shù)研究上的是Tukey[32]對(duì)櫻桃離體胚的培養(yǎng)。胚挽救技術(shù)的問(wèn)世，使無(wú)核葡萄間可以進(jìn)行雜交[33-34]，至少節(jié)省5年時(shí)間[6]。Burger[35]通過(guò)這種方式，培育出2632株雜種后代，選育出的F1代無(wú)核率在55%～92%之間，提升了后代無(wú)核效率。在胚挽救離體培養(yǎng)過(guò)程中，有許多關(guān)鍵因素決定胚發(fā)育率及成苗率，如親本的選擇、培養(yǎng)基的選擇、取樣時(shí)間以及個(gè)人操作技術(shù)都會(huì)影響到挽救的成敗。

葡萄的病害危害整個(gè)生長(zhǎng)周期，一直得不到有效的解決辦法，快速培育出無(wú)核、抗病的品種迫在眉睫。近年來(lái)，利用胚挽救技術(shù)培育無(wú)核抗病葡萄已成為食用葡萄育種的目標(biāo)[36-37]。引入無(wú)核抗病性狀，可從根本上防治霜霉病、根瘤蚜等病害。國(guó)外最先用無(wú)核葡萄與抗病圓葉葡萄雜交，獲得‘C41-5’抗病無(wú)核新株系[3]。經(jīng)鑒定中國(guó)的野生葡萄有很好的抗病性，且與歐洲葡萄親和性更好[38-39]。通過(guò)胚挽救技術(shù)可以使中國(guó)野生葡萄抗病基因與歐洲葡萄無(wú)核基因有效地融合。

MEJIA等[20]獲得無(wú)核探針SCF27-2000并用其對(duì)雜交子代進(jìn)行檢測(cè)，GSLP1-569的獲得也為無(wú)核性狀的選擇奠定了基礎(chǔ)，張艷艷等[22]使用中國(guó)野生葡萄‘白河35-1’成功獲得抗霜霉病探針S294-369、S382-615；張劍俠等[23]獲得抗白粉病探針OPY13-661，并對(duì)后代進(jìn)行了輔助選擇。分子標(biāo)記在育種上的應(yīng)用，更是加速了對(duì)子代性狀的鑒定，可以節(jié)省大量人力物力[20-22,40]。前人針對(duì)單一的性狀進(jìn)行較為單一的分子標(biāo)記輔助選擇，而本試驗(yàn)用多種分子標(biāo)記輔助選擇雜交后代的無(wú)核性與抗病性。

利用中國(guó)野生葡萄與無(wú)核歐洲葡萄品種雜交，創(chuàng)造無(wú)核抗病的新植株，從根本上提高雜種的抗病性，減少了農(nóng)藥使用導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，讓人們消費(fèi)優(yōu)質(zhì)的無(wú)核抗病新品種果實(shí)。在以后的無(wú)核抗病胚挽救育種中，可以參考本研究中‘紅寶石無(wú)核’與‘火焰無(wú)核’做母本，‘塘尾’與‘北醇’做父本雜交，可以獲得較多的雜種后代。以‘京可晶’為母本授粉后38天取樣較好，以‘火焰無(wú)核’為母本授粉后42天取樣較佳。以MM3為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，外源添加3 mmol/L的腐胺，可以獲得較高的胚發(fā)育率與成苗率。分子標(biāo)記輔助選擇鑒定225株雜種后代，篩選出16株既攜帶無(wú)核性狀又?jǐn)y帶抗霜霉病與抗白粉病特異條帶，這些無(wú)核抗病的新種質(zhì)是今后重點(diǎn)觀察與培育的種質(zhì)資源。本研究為葡萄無(wú)核抗病胚挽救育種提供了技術(shù)依據(jù)與新種質(zhì)。